本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種亞型ph-likeall的檢測方法。

背景技術(shù)：

急性淋巴細(xì)胞白血病（簡稱all）是兒童最常見的腫瘤，發(fā)病率隨年齡的增長而降低，目前重現(xiàn)性染色體改變是all的重要標(biāo)志，包括染色體重組、結(jié)構(gòu)改變等。多年來，臨床通過結(jié)合上述染色體變異特征，對all進(jìn)行危險(xiǎn)分層治療，使得all的治療效果得到了很大得改善，其中兒童all的5年生存率提高到了85%，然而仍有部分患者治療預(yù)后差，all的復(fù)發(fā)難治性使得該病依然是兒童及成人主要的致死疾病之一。

ph-likeall，是根據(jù)基因表達(dá)譜鑒定的一組疾病，其基因表達(dá)譜與bcr-abl1陽性all相似，但不表達(dá)bcr-abl1，所以稱之為bcr-abl1-likeall，又稱為ph-likeall。此類all主要見于急性前體b細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血?。╞cp-all），一般缺少bcp-all中典型的基因及染色體變異（etv6-runx1、e2a-pbx1、erg和mll重排、超二倍體等）且經(jīng)常會(huì)伴有高風(fēng)險(xiǎn)臨床特征。研究發(fā)現(xiàn)，ph-likeall約占sr（標(biāo)危）和hr（高危）兒童b-all的15%，在青年all中約為27.4%。與bcr-abl1陽性all相似，ph-likeall患者預(yù)后差，常規(guī)化療效果不佳，易復(fù)發(fā)。細(xì)胞株和人類白血病細(xì)胞表達(dá)的abl1，abl2，csf1r和pdgfrb融合基因在體外對達(dá)沙替尼（dasatinib）敏感，epor和jak2對磷酸魯索替尼（ruxolitinib）敏感，etv6–ntrk3融合基因?qū)诉蛱婺幔╟rizotinib）敏感。上述藥物僅針對個(gè)別異常的融合基因起到抑制作用，使用有一定的局限性；在檢測或者細(xì)胞過程時(shí)，需要多種藥物多次檢測，操作繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種亞型ph-likeall的檢測方法，能夠簡單快速全面地檢測ph-likeall。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種亞型ph-likeall的檢測方法，包括下列步驟：

1）分別配制乙醇溶液、預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，置2℃-8℃氮?dú)鈼l件儲(chǔ)存；

2）熒光探針溶解：向探針管內(nèi)加10~20μl水，加入150~200μl雜交液，超聲溶解30~60s，得到探針溶液；

3）將骨髓細(xì)胞固化，涂抹于玻片上，經(jīng)過預(yù)處理，制成涂片；所述固化為肝素化處理或經(jīng)edta-醋酸鈉處理；

4）將探針溶液預(yù)溫到室溫，漩渦混勻，離心2~3s，取5~15μl混勻的探針溶液滴加到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，用封片膠密封；

5）設(shè)置程序：先70~80℃變性5~10分鐘，然后35~40℃雜交16~18h；

6）除去封片膠，置于考普林缸內(nèi)的室溫洗液中1~5min洗去蓋玻片，取出涂片，用已預(yù)熱至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室溫65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然風(fēng)干；

7）滴加復(fù)染液到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，置-25~-15℃暗處復(fù)染20分鐘以上；所述復(fù)染液由以下重量份數(shù)的組分組成：革蘭氏染色液5~7份，氯化鎂1~3份，檸檬酸0.2~0.6份，熒光素0.5~0.7份，海藻酸鈉0.1~0.3份；

8）使用物鏡對樣本進(jìn)行掃描，確定樣本是否有異質(zhì)性。

具體的，所述乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為70~85%；所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液；所述洗液由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成：氯化鈉1.7~1.8%，檸檬酸鈉0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量為水；所述酶緩沖液為0.009~0.011mol/l的稀鹽酸。

優(yōu)選地，所述熒光探針共12組，分別為abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2。

絕大部分ph-likeall患者有染色體重排或其他的遺傳改變，可激活細(xì)胞因子受體或激酶信號。重排基因包括abl1，abl2，crlf2，csf1r，epor，jak2，ntrk3，pdgfrb，ptk2b，il2rb，tslp或tyk2。abl1，abl2，csf1r，jak2表達(dá)和pdgfrb融合基因?qū)е录?xì)胞因子獨(dú)立性擴(kuò)增和磷酸化stat5激活。將上述重排基因進(jìn)行標(biāo)記得到熒光探針，與復(fù)染液制成試劑盒。

復(fù)染液在變性雜交后添加，其效果在復(fù)染及觀察過程中體現(xiàn)。復(fù)染液采用革蘭氏染色液為主要成分，熒光素增加熒光效果，添加氯化鎂可增加熒光探針的標(biāo)記顯色效果；海藻酸鈉有助于細(xì)胞均勻地分散和復(fù)染，檸檬酸則加快異常細(xì)胞的融合過程，細(xì)胞均勻分散復(fù)染的過程中，異常細(xì)胞相互間快速地融合。總之各組分相互有效地配合可以準(zhǔn)確快速的觀察樣本是否有異性。熒光探針囊括了目前已知的所有針對性用藥的ph-likeall類型，經(jīng)探針溶液與樣本變性雜交后，滴加復(fù)染液，能夠全面準(zhǔn)確地檢測ph-likeall。

優(yōu)選地，所述步驟2）熒光探針溶解還包括下列步驟：用移液槍沖洗探針管底部和管壁，振蕩混勻20~40s，離心20~40s，放35~40℃水浴保溫溶解5~15分鐘；重復(fù)上述過程2~3次，將配制好的探針溶液備用或分裝冰凍避光保存。

優(yōu)選地，所述步驟6）考普林缸還用于盛放預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，將所述洗液預(yù)熱至72~74℃，將所述預(yù)處理液預(yù)熱至75~85℃，將所述酶緩沖液預(yù)熱至36~38℃。

優(yōu)選地，所述洗液室溫下的ph值為7.0±0.2；所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

具體地，所述步驟3）預(yù)處理包括如下步驟：a）將涂片60~70℃預(yù)熱5~10min，用浸蠟脫蠟透明液脫蠟2次每次10~20min，用無水乙醇脫水2次每次3~5min；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度復(fù)水，各0.5~2min，吸去殘余溶液；c）放在已經(jīng)預(yù)熱到75~85℃的預(yù)處理液中保溫20~40min，取出在純化水中浸泡1~2min，吸去殘余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已預(yù)熱至36~38℃的酶緩沖液中，浸入消化20~30min；e）在純化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度脫水，各0.5~2min，干燥備用。

優(yōu)選地，所述步驟a）浸蠟脫蠟透明液為異構(gòu)烷烴型

優(yōu)選地，所述步驟c）中所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液。

優(yōu)選地，所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

優(yōu)選地，所述掃描的結(jié)果中有異質(zhì)性的特征為有融合細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本檢測方法具有簡單、快速、成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測全面等優(yōu)點(diǎn)，能夠簡單快速全面地檢測ph-likeall；

2)熒光探針囊括了目前已知的所有針對性用藥的ph-likeall類型，全面的檢測可以為臨床指導(dǎo)用藥提供有利依據(jù)；

3)熒光探針具有很強(qiáng)的特異性，只結(jié)合特定位點(diǎn)的染色體，特異性強(qiáng)；

4)采用熒光原位雜交技術(shù)，熒光信號在顯微鏡下一目了然，靈敏度很高；

5)獲得骨髓細(xì)胞后可迅速處理成涂片，一般可在2-5天內(nèi)出結(jié)果。

附圖說明

圖1為fish正常細(xì)胞示意圖，1、橙色，2、綠色。

圖2為fish異常細(xì)胞，1、橙色，2、綠色，3、融合。

具體實(shí)施方式

下面用具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅局限于以下具體實(shí)施例。

以下所提供的實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明所涵蓋的范圍，所描述的步驟也不是用以限制其執(zhí)行順序。本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有公知常識對本發(fā)明做顯而易見的改進(jìn)，亦落入本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例一

一種亞型ph-likeall的檢測方法，包括下列步驟：

1）分別配制乙醇溶液、預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，置2℃-8℃氮?dú)鈼l件儲(chǔ)存；所述乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為70~85%；所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液；所述洗液由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成：氯化鈉1.7~1.8%，檸檬酸鈉0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量為水；所述酶緩沖液為0.009~0.011mol/l的稀鹽酸；

2）熒光探針溶解：向探針管內(nèi)加10~20μl水，加入150~200μl雜交液，超聲溶解30~60s，得到探針溶液；所述熒光探針共12組，分別為abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；

3）將骨髓細(xì)胞固化，涂抹于玻片上，經(jīng)過預(yù)處理，制成涂片；所述固化為肝素化處理或經(jīng)edta-醋酸鈉處理；

4）將探針溶液預(yù)溫到室溫，漩渦混勻，離心2~3s，取5~15μl混勻的探針溶液滴加到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，用封片膠密封；

5）設(shè)置程序：先70~80℃變性5~10分鐘，然后35~40℃雜交16~18h；

6）除去封片膠，置于考普林缸內(nèi)的室溫洗液中1~5min洗去蓋玻片，取出涂片，用已預(yù)熱至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室溫65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然風(fēng)干；

7）滴加復(fù)染液到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，置-25~-15℃暗處復(fù)染20分鐘以上；所述復(fù)染液由以下重量份數(shù)的組分組成：革蘭氏染色液5~7份，氯化鎂1~3份，檸檬酸0.2~0.6份，熒光素0.5~0.7份，海藻酸鈉0.1~0.3份；

8）使用物鏡對樣本進(jìn)行掃描，確定樣本是否有異質(zhì)性。

所述步驟2）熒光探針溶解還包括下列步驟：用移液槍沖洗探針管底部和管壁，振蕩混勻20~40s，離心20~40s，放35~40℃水浴保溫溶解5~15分鐘；重復(fù)上述過程2~3次，將配制好的探針溶液備用或分裝冰凍避光保存。

所述步驟6）考普林缸還用于盛放預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，將所述洗液預(yù)熱至72~74℃，將所述預(yù)處理液預(yù)熱至75~85℃，將所述酶緩沖液預(yù)熱至36~38℃。

所述洗液室溫下的ph值為7.0±0.2；所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

所述步驟3）預(yù)處理包括如下步驟：a）將涂片60~70℃預(yù)熱5~10min，用浸蠟脫蠟透明液脫蠟2次每次10~20min，用無水乙醇脫水2次每次3~5min；所述浸蠟脫蠟透明液為異構(gòu)烷烴型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度復(fù)水，各0.5~2min，吸去殘余溶液；c）放在已經(jīng)預(yù)熱到75~85℃的預(yù)處理液中保溫20~40min，取出在純化水中浸泡1~2min，吸去殘余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已預(yù)熱至36~38℃的酶緩沖液中，浸入消化20~30min；e）在純化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度脫水，各0.5~2min，干燥備用。

所述步驟c）中所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液。

所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

所述掃描的結(jié)果中有異質(zhì)性的特征為有融合細(xì)胞。

實(shí)施例二

一種亞型ph-likeall的檢測方法，包括下列步驟：

1）分別配制乙醇溶液、預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，置2℃-8℃氮?dú)鈼l件儲(chǔ)存；所述乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為70~85%；所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液；所述洗液由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成：氯化鈉1.7~1.8%，檸檬酸鈉0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量為水；所述酶緩沖液為0.009~0.011mol/l的稀鹽酸；

2）熒光探針溶解：向探針管內(nèi)加10~20μl水，加入150~200μl雜交液，超聲溶解30~60s，得到探針溶液；所述熒光探針共12組，分別為abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；

3）將骨髓細(xì)胞固化，涂抹于玻片上，經(jīng)過預(yù)處理，制成涂片；所述固化為肝素化處理或經(jīng)edta-醋酸鈉處理；

4）將探針溶液預(yù)溫到室溫，漩渦混勻，離心2~3s，取5~15μl混勻的探針溶液滴加到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，用封片膠密封；

5）設(shè)置程序：先70~80℃變性5~10分鐘，然后35~40℃雜交16~18h；

6）除去封片膠，置于考普林缸內(nèi)的室溫洗液中1~5min洗去蓋玻片，取出涂片，用已預(yù)熱至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室溫65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然風(fēng)干；

7）滴加復(fù)染液到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，置-25~-15℃暗處復(fù)染20分鐘以上；所述復(fù)染液由以下重量份數(shù)的組分組成：革蘭氏染色液5~7份，氯化鎂1~3份，檸檬酸0.2~0.6份，熒光素0.5~0.7份，海藻酸鈉0.1~0.3份；

8）使用物鏡對樣本進(jìn)行掃描，確定樣本是否有異質(zhì)性。

所述步驟2）熒光探針溶解還包括下列步驟：用移液槍沖洗探針管底部和管壁，振蕩混勻20~40s，離心20~40s，放35~40℃水浴保溫溶解5~15分鐘；重復(fù)上述過程2~3次，將配制好的探針溶液備用或分裝冰凍避光保存。

所述步驟6）考普林缸還用于盛放預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，將所述洗液預(yù)熱至72~74℃，將所述預(yù)處理液預(yù)熱至75~85℃，將所述酶緩沖液預(yù)熱至36~38℃。

所述洗液室溫下的ph值為7.0±0.2；所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

所述步驟3）預(yù)處理包括如下步驟：a）將涂片60~70℃預(yù)熱5~10min，用浸蠟脫蠟透明液脫蠟2次每次10~20min，用無水乙醇脫水2次每次3~5min；所述浸蠟脫蠟透明液為異構(gòu)烷烴型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度復(fù)水，各0.5~2min，吸去殘余溶液；c）放在已經(jīng)預(yù)熱到75~85℃的預(yù)處理液中保溫20~40min，取出在純化水中浸泡1~2min，吸去殘余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已預(yù)熱至36~38℃的酶緩沖液中，浸入消化20~30min；e）在純化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度脫水，各0.5~2min，干燥備用。

所述步驟c）中所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液。

所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

所述掃描的結(jié)果中有異質(zhì)性的特征為有融合細(xì)胞

實(shí)施例三

一種亞型ph-likeall的檢測方法，包括下列步驟：

1）分別配制乙醇溶液、預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，置2℃-8℃氮?dú)鈼l件儲(chǔ)存；所述乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為70~85%；所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液；所述洗液由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成：氯化鈉1.7~1.8%，檸檬酸鈉0.8~1%，乙基苯基聚乙二醇0.2~0.4%，余量為水；所述酶緩沖液為0.009~0.011mol/l的稀鹽酸；

2）熒光探針溶解：向探針管內(nèi)加10~20μl水，加入150~200μl雜交液，超聲溶解30~60s，得到探針溶液；所述熒光探針共12組，分別為abl1，abl2，csf1r，pdgfrb，crlf2，jak2，epor，il2rb，ntrk3，ptk2b，tslp和tyk2；

3）將骨髓細(xì)胞固化，涂抹于玻片上，經(jīng)過預(yù)處理，制成涂片；所述固化為肝素化處理或經(jīng)edta-醋酸鈉處理；

4）將探針溶液預(yù)溫到室溫，漩渦混勻，離心2~3s，取5~15μl混勻的探針溶液滴加到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，用封片膠密封；

5）設(shè)置程序：先70~80℃變性5~10分鐘，然后35~40℃雜交16~18h；

6）除去封片膠，置于考普林缸內(nèi)的室溫洗液中1~5min洗去蓋玻片，取出涂片，用已預(yù)熱至72~74℃的洗液漂洗1~3min，再用室溫65~75%乙醇溶液漂洗1~3min，避光自然風(fēng)干；

7）滴加復(fù)染液到雜交區(qū)域，蓋上蓋玻片，置-25~-15℃暗處復(fù)染20分鐘以上；所述復(fù)染液由以下重量份數(shù)的組分組成：革蘭氏染色液5~7份，氯化鎂1~3份，檸檬酸0.2~0.6份，熒光素0.5~0.7份，海藻酸鈉0.1~0.3份；

8）使用物鏡對樣本進(jìn)行掃描，確定樣本是否有異質(zhì)性。

所述步驟2）熒光探針溶解還包括下列步驟：用移液槍沖洗探針管底部和管壁，振蕩混勻20~40s，離心20~40s，放35~40℃水浴保溫溶解5~15分鐘；重復(fù)上述過程2~3次，將配制好的探針溶液備用或分裝冰凍避光保存。

所述步驟6）考普林缸還用于盛放預(yù)處理液、洗液和酶緩沖液，將所述洗液預(yù)熱至72~74℃，將所述預(yù)處理液預(yù)熱至75~85℃，將所述酶緩沖液預(yù)熱至36~38℃。

所述洗液室溫下的ph值為7.0±0.2；所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

所述步驟3）預(yù)處理包括如下步驟：a）將涂片60~70℃預(yù)熱5~10min，用浸蠟脫蠟透明液脫蠟2次每次10~20min，用無水乙醇脫水2次每次3~5min；所述浸蠟脫蠟透明液為異構(gòu)烷烴型；b）依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度復(fù)水，各0.5~2min，吸去殘余溶液；c）放在已經(jīng)預(yù)熱到75~85℃的預(yù)處理液中保溫20~40min，取出在純化水中浸泡1~2min，吸去殘余溶液；d）取40~60mg胃蛋白酶干粉溶解在已預(yù)熱至36~38℃的酶緩沖液中，浸入消化20~30min；e）在純化水中浸泡1~2min，依次在85%乙醇、70%乙醇、純化水中梯度脫水，各0.5~2min，干燥備用。

所述步驟c）中所述預(yù)處理液為0.9~1.1mol/l的硫氰酸鈉溶液。

所述酶緩沖液為0.01mol/l的稀鹽酸，室溫下的ph值為2.0±0.2。

所述掃描的結(jié)果中有異質(zhì)性的特征為有融合細(xì)胞。