本發(fā)明屬于環(huán)境生物工程和水處理領(lǐng)域，具體涉及一種以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法。
背景技術(shù)：
：隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和人們生活水平的提高，含氮污染物的排放量迅速增加，水環(huán)境中氮污染的問題日趨嚴(yán)重，成為國際社會(huì)面臨的一個(gè)重大問題。國內(nèi)水體中氮的污染以硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮形式氮的污染最為嚴(yán)重，而生物除氮是去除水體中氮污染的最有效的方法之一。生物脫氮技術(shù)通常有硝化工藝和反硝化工藝組成。硝化工藝以去除氨氮為主，雖然能把氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，但是不能徹底將氮素從水體中去除。反硝化工藝則能從根本上消除氮素對環(huán)境的污染。反硝化細(xì)菌是反硝化作用發(fā)生的主體，然而，游離的反硝化細(xì)菌在污水處理的過程中存在諸多不足，可以考慮通過微生物固定化技術(shù)解決這一問題。微生物固定化技術(shù)是將特選的微生物固定在選擇的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適宜條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)。這種技術(shù)應(yīng)用于廢水處理，有利于提高生物反應(yīng)器內(nèi)微生物（尤其是特殊功能的微生物）的濃度，有利于微生物抵抗不利環(huán)境的影響，有利于反應(yīng)后的固液分離，縮短處理所需的時(shí)間。常見的固定化載體和包埋材料為聚乙烯醇、海藻酸鈉、瓊脂、明膠等。然而將反硝化細(xì)菌固定在這些化學(xué)載體上常會(huì)抑制菌體活性，一定程度上會(huì)影響到反硝化細(xì)菌處理污水脫氮的能力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法，是由以下步驟獲得的：1）由斜面上取兩環(huán)副球菌接種至富集培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心去除上清液，得菌體；將菌體懸浮于無菌生理鹽水中，得反硝化細(xì)菌菌懸液；本發(fā)明的副球菌（paracoccussp.）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所），編號(hào)：cgmccno.13607。2）由斜面上取兩環(huán)綠色木霉接種至固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成孢子，用無菌水洗滌孢子，低溫保存，得孢子懸浮液；本發(fā)明的綠色木霉（trichodermaviride）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所），編號(hào)：cgmccno.3.6619。3）將反硝化細(xì)菌菌懸液和孢子懸浮液接種至菌絲球培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，得綠色木霉為載體固定化反硝化細(xì)菌的混合菌絲球。所述步驟1）中，無菌生理鹽水的濃度為0.9%；菌體與無菌生理鹽水的質(zhì)量比為1：50-250。所述步驟1）中，富集培養(yǎng)基的組成如下：kno30.1-10g/l，蛋白胨0.1-20g/l，牛肉膏0.1-20g/l，k2hpo4·3h2o0.1-5g/l，mgso4·7h2o0.1-5g/l，余量為水。所述步驟1）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100-200r/min，培養(yǎng)溫度為19-35℃，培養(yǎng)時(shí)間為12-72h。所述步驟2）中，固體培養(yǎng)基為pda瓊脂培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為20-32℃，培養(yǎng)時(shí)間為3-15d；低溫保存溫度為2-6℃；孢子懸浮液的濃度為1.06×105個(gè)/l-3.12×105個(gè)/l。本發(fā)明的pda瓊脂培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯300g/l、葡萄糖20g/l、瓊脂18g/l，余量為水。所述步驟3）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100-200r/min，培養(yǎng)溫度為20-32℃，培養(yǎng)時(shí)間為2-7d。所述步驟3）中，所述菌絲球培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖10-20g/l，硝酸鉀2-5g/l，k2hpo4·3h2o0.5-3g/l，nh4cl1-3g/l，mgso4·7h2o0.1-1.5g/l，余量為水。所述步驟3）中，反硝化細(xì)菌菌懸液的接種量為4-20%，v/v；所述孢子懸浮液的接種量為6.34×105個(gè)/l-7.92×107個(gè)/l。所述混合菌絲球在污水中的接種量為4-15%，在15-35℃、ph值為6-10的條件下培養(yǎng)。所述污水中硝酸鹽氮的濃度為500mg/l以下。本發(fā)明的混合菌絲球可在30℃條件下烘干至恒重，30℃以下保存；烘干至恒重的混合菌絲球可大大縮小所占空間，方便貯存和運(yùn)輸，30℃以下保存可保存一年以上，且具有較好的溶脹性，遇水能迅速恢復(fù)原狀，可大規(guī)模的應(yīng)用于污水處理中。本發(fā)明的有益效果：1.本發(fā)明以綠色木霉培養(yǎng)形成的菌絲球?yàn)樯镔|(zhì)載體，通過副球菌和綠色木霉同時(shí)混合培養(yǎng)，使副球菌吸附在菌絲球的表面及內(nèi)部空隙中，獲得混合菌絲球，從而將副球菌牢牢固定在菌絲球上，應(yīng)用于污水中，顯著提高污水中氮素去除率。綠色木霉以硝酸鹽氮作為氮源合成自身所需的營養(yǎng)物質(zhì)，直接降低廢水中硝酸鹽氮含量；副球菌通過反硝化進(jìn)程將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成無毒的氮?dú)忉尫诺酱髿庵?，從而降低廢水中氮素含量。2.本發(fā)明以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法具有操作簡便、培養(yǎng)時(shí)間短、可重復(fù)使用、沉降性能好的優(yōu)點(diǎn)，制備的混合菌絲球可顯著降低水體中的氮素含量，改善水質(zhì)狀況，使污水達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，且無亞硝酸鹽積累，降低環(huán)境污染，對于大規(guī)模利用副球菌處理污水具有重要意義。附圖說明圖1為本發(fā)明制備的混合菌絲球的照片。圖2為本發(fā)明制備的混合菌絲球的掃描電鏡圖。圖3為本發(fā)明測試?yán)?對模擬人工污水中cod去除率曲線。圖4為本發(fā)明測試?yán)?對模擬人工污水中硝酸鹽氮降解率曲線。圖5為本發(fā)明測試?yán)?對模擬人工污水中cod去除率曲線。圖6為本發(fā)明測試?yán)?對模擬人工污水中硝酸鹽氮降解率曲線。圖7為本發(fā)明測試?yán)?對周邊河道污水中cod去除率和硝酸鹽氮降解率曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明的以下實(shí)施例僅用來說明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，這些實(shí)施方式不能理解為是對本發(fā)明的限制。其它的任何在未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡化，均視為等效的置換方式，落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊要求，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的副球菌（paracoccussp.）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所），編號(hào)：cgmccno.13607。本發(fā)明的綠色木霉（trichodermaviride）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所），編號(hào)：cgmccno.3.6619。本發(fā)明的pda瓊脂培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯300g/l、葡萄糖20g/l、瓊脂18g/l，余量為水。實(shí)施例1一種以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法，是由以下步驟獲得的：1）由斜面上取兩環(huán)副球菌接種至富集培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心去除上清液，得菌體；將菌體懸浮于無菌生理鹽水中，得反硝化細(xì)菌菌懸液；所述步驟1）中，無菌生理鹽水的濃度為0.9%；菌體與無菌生理鹽水的質(zhì)量比為1：50。所述步驟1）中，富集培養(yǎng)基的組成如下：kno310g/l，蛋白胨0.1g/l，牛肉膏20g/l，k2hpo4·3h2o0.1g/l，mgso4·7h2o5g/l，余量為水。所述步驟1）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100r/min，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為12h。2）由斜面上取兩環(huán)綠色木霉接種至固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成孢子，用無菌水洗滌孢子，低溫保存，得孢子懸浮液；所述步驟2）中，固體培養(yǎng)基為pda瓊脂培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時(shí)間為3d；低溫保存溫度為6℃；孢子懸浮液的濃度為1.06×105個(gè)/l。3）將反硝化細(xì)菌菌懸液和孢子懸浮液接種至菌絲球培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，得綠色木霉為載體固定化反硝化細(xì)菌的混合菌絲球。所述步驟3）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時(shí)間為2d。所述步驟3）中，所述菌絲球培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖20g/l，硝酸鉀2g/l，k2hpo4·3h2o3g/l，nh4cl1g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，余量為水。所述步驟3）中，反硝化細(xì)菌菌懸液的接種量為20%，v/v；所述孢子懸浮液的接種量為7.92×107個(gè)/l。所述混合菌絲球在污水中的接種量為4-15%，在15-35℃、ph值為6-10的條件下培養(yǎng)。所述污水中硝酸鹽氮的濃度為500mg/l以下。隨機(jī)選取50顆本實(shí)施例制備的混合菌絲球，用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺測其粒徑約為4mm。隨機(jī)選取50顆本實(shí)施例制備的混合菌絲球，濾干表面水分后稱重，實(shí)驗(yàn)表明每顆混合菌絲球顆粒重量約為0.04g。隨機(jī)選取50顆混合菌絲球，加入50ml蒸餾水，置于搖床于30℃、300r/min條件下震蕩，24h后觀察混合菌絲球沒有出現(xiàn)破損，說明本實(shí)施例制備的混合菌絲球的穩(wěn)定性較好。對混合菌絲球采用“顏色浸潤法”測其傳質(zhì)性能，表明本實(shí)施例制備的混合菌絲球傳質(zhì)性能較好。實(shí)施例2一種以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法，是由以下步驟獲得的：1）由斜面上取兩環(huán)副球菌接種至富集培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心去除上清液，得菌體；將菌體懸浮于無菌生理鹽水中，得反硝化細(xì)菌菌懸液；所述步驟1）中，無菌生理鹽水的濃度為0.9%；菌體與無菌生理鹽水的質(zhì)量比為1：150。所述步驟1）中，富集培養(yǎng)基的組成如下：kno35g/l，蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，k2hpo4·3h2o3g/l，mgso4·7h2o3g/l，余量為水。所述步驟1）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。2）由斜面上取兩環(huán)綠色木霉接種至固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成孢子，用無菌水洗滌孢子，低溫保存，得孢子懸浮液；所述步驟2）中，固體培養(yǎng)基為pda瓊脂培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為26℃，培養(yǎng)時(shí)間為10d；低溫保存溫度為4℃；孢子懸浮液的濃度為2.10×106個(gè)/l。3）將反硝化細(xì)菌菌懸液和孢子懸浮液接種至菌絲球培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，得綠色木霉為載體固定化反硝化細(xì)菌的混合菌絲球，如圖1和圖2所示。所述步驟3）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)溫度為26℃，培養(yǎng)時(shí)間為4d。所述步驟3）中，所述菌絲球培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖15g/l，硝酸鉀4g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，nh4cl2g/l，mgso4·7h2o1g/l，余量為水。所述步驟3）中，反硝化細(xì)菌菌懸液的接種量為10%，v/v；所述孢子懸浮液的接種量為6.55×106個(gè)/l。所述混合菌絲球在污水中的接種量為4-15%，在15-35℃、ph值為6-10的條件下培養(yǎng)。所述污水中硝酸鹽氮的濃度為500mg/l以下。隨機(jī)選取50顆本實(shí)施例制備的混合菌絲球，用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺測其粒徑約為4mm。隨機(jī)選取50顆本實(shí)施例制備的混合菌絲球，濾干表面水分后稱重，實(shí)驗(yàn)表明每顆混合菌絲球顆粒重量約為0.04g。隨機(jī)選取50顆混合菌絲球，加入50ml蒸餾水，置于搖床于30℃、300r/min條件下震蕩，24h后觀察混合菌絲球沒有出現(xiàn)破損，說明本實(shí)施例制備的混合菌絲球的穩(wěn)定性較好。對混合菌絲球采用“顏色浸潤法”測其傳質(zhì)性能，表明本實(shí)施例制備的混合菌絲球傳質(zhì)性能較好。實(shí)施例3一種以綠色木霉為載體進(jìn)行反硝化細(xì)菌固定化的方法，是由以下步驟獲得的：1）由斜面上取兩環(huán)副球菌接種至富集培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心去除上清液，得菌體；將菌體懸浮于無菌生理鹽水中，得反硝化細(xì)菌菌懸液；所述步驟1）中，無菌生理鹽水的濃度為0.9%；菌體與無菌生理鹽水的質(zhì)量比為1：250。所述步驟1）中，富集培養(yǎng)基的組成如下：kno30.1g/l，蛋白胨20g/l，牛肉膏0.1g/l，k2hpo4·3h2o5g/l，mgso4·7h2o0.1g/l，余量為水。所述步驟1）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)溫度為19℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h。2）由斜面上取兩環(huán)綠色木霉接種至固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成孢子，用無菌水洗滌孢子，低溫保存，得孢子懸浮液；所述步驟2）中，固體培養(yǎng)基為pda瓊脂培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)時(shí)間為15d；低溫保存溫度為2℃；孢子懸浮液的濃度為3.12×105個(gè)/l。3）將反硝化細(xì)菌菌懸液和孢子懸浮液接種至菌絲球培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，得綠色木霉為載體固定化反硝化細(xì)菌的混合菌絲球。所述步驟3）中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100r/min，培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)時(shí)間為7d。所述步驟3）中，所述菌絲球培養(yǎng)基的組成如下：葡萄糖10g/l，硝酸鉀5g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，nh4cl3g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，余量為水。所述步驟3）中，反硝化細(xì)菌菌懸液的接種量為4%，v/v；所述孢子懸浮液的接種量為6.34×105個(gè)/l。所述混合菌絲球在污水中的接種量為4-15%，在15-35℃、ph值為6-10的條件下培養(yǎng)。所述污水中硝酸鹽氮的濃度為500mg/l以下。隨機(jī)選取50顆本實(shí)施例制備的混合菌絲球，用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺測其粒徑約為4mm。隨機(jī)選取50顆本實(shí)施例制備的混合菌絲球，濾干表面水分后稱重，實(shí)驗(yàn)表明每顆混合菌絲球顆粒重量約為0.04g。隨機(jī)選取50顆混合菌絲球，加入50ml蒸餾水，置于搖床于30℃、300r/min條件下震蕩，24h后觀察混合菌絲球沒有出現(xiàn)破損，說明本實(shí)施例制備的混合菌絲球的穩(wěn)定性較好。對混合菌絲球采用“顏色浸潤法”測其傳質(zhì)性能，表明本實(shí)施例制備的混合菌絲球傳質(zhì)性能較好。測試?yán)?按照表1配制模擬人工污水，調(diào)節(jié)模擬人工污水中硝酸鹽氮濃度為500mg/l，cod為500mg/l，ph為6，水溫為15℃。按照4%的接種量分別將實(shí)施例1-3制備的混合菌絲球置于100ml模擬人工污水中，對照組模擬人工污水不添加任何物質(zhì)，每隔4h取上清液檢測硝酸鹽氮和cod的濃度，cod的去除率和硝酸鹽氮降解率分別如圖3和圖4所示。表1模擬人工污水成分成分含量（g/l）成分含量（g/l）kno30.1-10mgso4·7h2o0.01-1乙酸鈉0.1-10nacl0.01-1葡萄糖0.1-5feso4·7h2o0.001-1k2hpo40.1-2mnso4·4h2o0.001-1由圖3和圖4可知，實(shí)施例1在培養(yǎng)28h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為93.22％，cod去除率為90.10％；實(shí)施例2在培養(yǎng)40h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為92.31％，cod去除率為88.64％。實(shí)施例3在培養(yǎng)44h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為89.85％，cod去除率為85.34％。測試?yán)?按照表1配制模擬人工污水，調(diào)節(jié)模擬人工污水中硝酸鹽氮濃度為277mg/l，cod為500mg/l，ph為10，水溫為35℃。按照15%的接種量分別將實(shí)施例1-3制備的混合菌絲球置于100ml模擬人工污水中，對照組模擬人工污水不添加任何物質(zhì)，每隔4h取上清液檢測硝酸鹽氮和cod的濃度，cod的去除率和硝酸鹽氮降解率分別如圖5和圖6所示。由圖5和圖6可知，實(shí)施例1在培養(yǎng)24h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為99.09％，cod去除率為96.88％；實(shí)施例2在培養(yǎng)32h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為97.26％，cod去除率為94.55％。實(shí)施例3在培養(yǎng)36h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為94.22％，cod去除率為92.00％。測試?yán)?采集曲阜市周邊河道污水，主要污染物情況如表2所示。調(diào)節(jié)該河道污水中硝酸鹽氮濃度為20mg/l，cod為80mg/l，ph為6，水溫為32℃。取2g實(shí)施例2制備的混合菌絲球于100ml模擬污水中，對照組污水不添加任何物質(zhì)，每隔4h取上清液檢測硝酸鹽氮和cod，結(jié)果如圖7所示。表2曲阜市周邊河道污水主要污染物情況cod（mg/l）總氮（mg/l）總磷（mg/l）硝酸鹽氮（mg/l）33.04.670.043.9由圖7可知，在培養(yǎng)32h時(shí)，硝酸鹽氮降解率為99.11％，cod去除率為86.12％。對所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實(shí)施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。當(dāng)前第1頁12