本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應用，具體涉及菊酯類農藥半抗原及其制備方法和應用，屬于食品安全免疫學檢測技術領域。

背景技術：

菊酯類農藥具有殺蟲譜廣、藥效迅速、對光和熱穩(wěn)定、藥效時間長等特點，在農業(yè)、林業(yè)、公共衛(wèi)生等領域廣泛使用，但其對生態(tài)系統(tǒng)及人類健康存在危害，尤其對蜜蜂及水生生物具有高毒性。世界衛(wèi)生組織(who)和聯(lián)合國糧農組織(fao)對菊酯類農藥在蔬果上的殘留制定了嚴格限量標準，我國也對該類農藥制定了限量標準(gb2763-2016)。

目前，菊酯類農藥的檢測方法主要是色譜法，包括氣相色譜(gc)、高效液相色譜(hplc)、質譜法(ms)及氣相色譜-質譜聯(lián)用(gc-ms)或液相色譜-質譜聯(lián)用法(hplc-ms)等。儀器分析方法具有靈敏度高的優(yōu)點，但費用較昂貴，技術要求高，不適用現(xiàn)場快速篩查大量樣品。

免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析是以抗原與抗體之間特異性識別和可逆性結合反應為基礎的痕量分析方法，由于具有特異性強、靈敏度高、簡單、快速、費用低和適于現(xiàn)場大批量樣品篩選等優(yōu)點，已在環(huán)境和食品安全等分析領域中得到廣泛應用。建立小分子化合物的免疫分析方法的關鍵是能夠制備出對小分子化合物具有高親和力和高選擇性的抗體，而半抗原的合成又是制備優(yōu)質抗體的基礎。半抗原設計的關鍵是盡可能地保留原待測物質的特征結構，并在適當?shù)奈恢靡牒线m的連接臂和與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團。不同結構的連接臂、不同的偶聯(lián)方法或連接臂的引入位置，都影響后續(xù)制備的抗體的靈敏度和特異性。另外，作為家族類化合物，多種菊酯類農藥在食品與環(huán)境中的累積毒性是嚴重的隱含風險，因此合成高效價、具有菊酯類共同結構特征的通用抗原，制備具有廣譜識別的抗體成為菊酯類農藥免疫分析研究的重點。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種菊酯類農藥半抗原及其制備方法，以及該半抗原與人血清白蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫動物制備的單克隆抗體。經(jīng)試驗數(shù)據(jù)驗證，制備的單克隆抗體對溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯戊菊酯、苯氯菊酯6種菊酯類農藥具有較好的檢測靈敏度，可以用來建立菊酯類農藥多殘留的免疫學檢測方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)：

一種菊酯類農藥半抗原，其分子結構式為：

上述菊酯類農藥半抗原的制備方法，包括如下步驟：

取[氰基-(3-苯氧基)-甲基]2溴乙酸酯1.0g，加n,n-二甲基甲酰胺溶解，加碳酸氫鈉0.72g，充分攪拌混勻后，加1-氨基-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸0.45g，60℃攪拌反應4h；停止反應，加水乙酸乙酯萃取，靜置分層，有機相無水硫酸鈉干燥，蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯＝1:1洗脫分離，得到環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原1.1g，即為菊酯類農藥半抗原，收率97.35％。

上述菊酯類農藥半抗原在免疫檢測中的應用，具體包括由所述菊酯類農藥半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的菊酯類農藥人工抗原，及由所得的菊酯類農藥人工抗原免疫動物制備的單克隆抗體。

其中所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述單克隆抗體是由保藏編號為cgmccno.13842的菊酯類單克隆抗體雜交瘤細胞株f-3-2分泌產生的，應用于菊酯類農藥的多殘留免疫檢測。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明提供的菊酯類農藥半抗原既最大程度地保留了菊酯類農藥母核的化學結構，又通過化學合成改造引入了可以與蛋白質偶聯(lián)的—cooh，合成方法簡單，純度、產率較高；

(2)本發(fā)明制備得到的菊酯類農藥人工抗原免疫動物得到的單克隆抗體，效價達到了2×10⁵，說明本發(fā)明合成的抗原具有優(yōu)良的免疫原性，合成抗原過程中完整地保留了半抗原分子的原始結構；

(3)本發(fā)明提供的單克隆抗體特異性好，與溴氰菊酯的交叉反應率為100％，與氯氟氰菊酯的交叉反應率為50.9％，與氟胺氰菊酯的交叉反應率為103.6％，與氟氯氰菊酯的交叉反應率為70.7％，與氯戊聚酯的交叉反應率為74.4％，與苯氯菊酯的交叉反應率為69.0％，可應用于菊酯類農藥的多殘留免疫檢測。

生物材料樣品保藏：一株菊酯類單克隆抗體雜交瘤細胞株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2017年05月05日，保藏編號為cgmccno.13842。

附圖說明

圖1菊酯類農藥半抗原合成路線圖

圖2菊酯類農藥半抗原核磁共振氫譜圖

圖3菊酯類農藥競爭elisa標準曲線圖

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例1：菊酯類農藥半抗原合成及鑒定

菊酯類農藥半抗原的合成路線如附圖1所示。

取[氰基-(3-苯氧基)-甲基]2溴乙酸酯1.0g，加n,n-二甲基甲酰胺溶解，加碳酸氫鈉0.72g，充分攪拌混勻后，加1-氨基-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸0.45g，60℃攪拌反應4h；停止反應，加水乙酸乙酯萃取，靜置分層，有機相無水硫酸鈉干燥，蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯＝1:1洗脫分離，得到環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原1.1g，即為菊酯類農藥半抗原，收率97.35％。

取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，結果見附圖2。¹h-nmr(cdcl3,300mhz)δ：11.00(1h,s,cooh)，7.41(2h,dd,arh)，7.17(1h,dd,arh)，7.14(2h,dd,arh)，7.08(2h,dd,arh)，7.34(2h,dd,arh)，6.25(1h,s,ch)，3.51(2h,s,ch2)，2.0(1h,s,nh)，0.94(6h,s,ch3)，0.57(1h,d,ch)，0.33(1h,d,ch)。圖譜中，化學位移δ＝11.0的為化合物上羧基氫共振吸收峰，7.08～7.41為苯環(huán)上氫的吸收峰，0.94為兩個甲基氫的吸收峰，0.33～0.57為三元環(huán)上的兩個氫吸收峰，結合其他吸收峰，證明半抗原合成成功。

實施例2：菊酯類農藥人工抗原合成及鑒定

以菊酯類農藥半抗原的羧基為活性位點，用混合酸酐法與人血清白蛋白(hsa)偶聯(lián)，制備免疫原；用碳二亞胺法與卵清蛋白(ova)偶聯(lián)，制備包被原。

1.混合酸酐法制備免疫原

取環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原24mg，加二甲基亞砜0.5ml溶解，加三乙胺20μl，攪拌混勻，加氯甲酸異丁酯20μl，攪拌30min，得到半抗原活化液a液；取hsa100mg，加0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液溶解，得到b液；將a液逐滴滴加到b液中，室溫攪拌4h，0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次，得到免疫原，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.碳二亞胺法制備包被原

取環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原10mg，加n,n-二甲基甲酰胺(dmf)0.3ml溶解，加碳二亞胺(edc)13mg，攪拌30min，加n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)13mg，攪拌30min，得到半抗原活化液a液；取ova100mg，加0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液溶解，得到b液；將a液逐滴滴加到b液中，室溫攪拌4h，0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次，得到包被原，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

上述方法中也可以采用鼠血清白蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

3.人工抗原鑒定

將載體蛋白、菊酯類農藥半抗原、菊酯類農藥半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用ph7.4的pbs配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/lph7.4的pbs調零，用紫外分光光度計在波長200～800nm范圍內掃描，得到載體蛋白、菊酯類農藥半抗原、菊酯類農藥半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線，并計算其結合比。結果發(fā)現(xiàn)，三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明菊酯類農藥半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，半抗原與hsa的結合比為(17～21):1，與ova的結合比為(15～20):1。

實施例3：單克隆抗體制備純化及特性鑒定

1.動物免疫

取健康的6～8周雌性balb/c小鼠10只(分為a與b兩組，每組5只)，初次免疫用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下多點注射，每只小鼠免疫劑量為200μg免疫原；之后加強免疫每兩周頸背部皮下多點注射一次，乳化用弗氏不完全佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替弗氏不完全佐劑，采用腹腔注射，注射劑量和前面幾次相同。具體免疫步驟見表1。

表1小鼠免疫程序

第三次、四次、加強免疫后7d，對小鼠斷尾取血，elisa方法測定小鼠血清效價，具體步驟如下：

(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原做1:1000稀釋，每孔100μl包被酶標板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；

(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應2h后傾去封閉液，拍干；

(3)每孔加入50μl以pbs倍比稀釋的抗血清，25℃反應30min后傾去反應液，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(4)加pbs稀釋的酶標二抗(1:1000)100μl/孔，25℃反應30min，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應；

(6)酶標儀測定波長在450nm的od值，以樣品孔od450接近于1的稀釋倍數(shù)作為陽性血清的效價。

2.細胞融合

(1)飼養(yǎng)細胞制備：斷頸處死8～10周齡balb/c小鼠，浸泡在75％酒精中5min，隨即放入超凈工作臺內，腹部朝上放于平皿內或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側做鈍性分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mlrpmi-1640基礎培養(yǎng)液，注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內液體，注入離心管。如此反復操作3～4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20～50ml完全培養(yǎng)液重懸細胞，100μl/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

(2)脾細胞制備：加強免疫后3d，取免疫balb/c小鼠，眼眶采血后脫臼處死，在75％酒精中消毒后取脾臟，去除結締組織，制備脾細胞懸液，轉移到50ml離心管中，加rpmi-1640至30ml，1500～2000r/min離心5min，棄上清，加rpmi-1640至30ml，計數(shù)待用。

(3)骨髓瘤細胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的(活細胞數(shù)>95％)骨髓瘤細胞，將之完全吹下，轉移到50ml離心管中，加rpmi-1640至30ml，1500～2000r/min離心5min，棄上清，加rpmi-1640至30ml，計數(shù)待用。

(4)細胞混合：脾細胞:骨髓瘤細胞＝8:1，混合，1500～2000r/min離心5min。

(5)細胞融合：將混合好的細胞離心，倒干上清，把沉淀細胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，在1min內加入1ml融合劑，融合劑為聚乙二醇(peg)4000，作用2min，并輕輕攪拌細胞，在隨后4min內加入20ml無血清的peg營養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用20～50ml完全培養(yǎng)液重懸細胞，鋪種于含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl，置培養(yǎng)箱中。

3.細胞株篩選

待細胞長至孔底的1/2～1/3時，即可進行抗體檢測。采用elisa方法對有雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)孔進行篩選，篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用多種菊酯類農藥為標準品，用間接競爭elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選出對多種菊酯類農藥標準品均具有較好抑制的孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復三次，即可得到能穩(wěn)定分泌菊酯類單克隆抗體的細胞株f-3-2。該細胞株已于2017年05月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為cgmccno.13842。

4.腹水制備

將液體石蠟注射6～8周balb/c小鼠，500μl/只。10天后將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞cgmccno.13842用rpmi-1640基礎培養(yǎng)基收集，用血球計數(shù)板和顯微鏡計數(shù)，細胞濃度在1.0×10⁶～1.5×10⁶個/ml范圍內。每只小鼠0.5ml雜交瘤細胞cgmccno.13842注射到腹腔。注意觀察在一周后小鼠腹部膨大，用無菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到兩天采集一次，這樣多次反復采集直到小鼠自然死亡。4℃下5000r/min離心5min，收集上清，并去掉腹水上層漂浮的脂肪和蛋白質膜。

5.抗體純化

單克隆抗體采用辛酸-硫酸銨方法純化，具體步驟如下：

(1)將腹水從-20℃冰箱拿出室溫解凍。腹水用雙層濾紙過濾，初步除去脂肪片、細胞碎片及其他雜質。12000r/min離心15min，取上清，棄沉淀。精確量腹水體積；

(2)1份體積的腹水與3份體積的醋酸鹽緩沖液磁力攪拌混勻，用2mol/lhcl調ph至4.5～4.8；

(3)磁力攪拌下緩慢加入正辛酸，1ml腹水加33μl正辛酸，加完后室溫磁力攪拌30min，后置4℃靜置2h；

(4)12000r/min離心5min，取上清，雙層濾紙過濾，收集濾液；

(5)量取濾液體積，加入1/10體積的0.1mol/lph7.4的pbs，用2mol/lnaoh(記錄naoh體積)調ph至7.4；

(6)將上清冰浴預冷，加硫酸銨固體至0.277g/ml，邊加邊攪拌，并于30min內加完，置4℃過夜；

(7)12000r/min離心15min，棄上清。用一定體積的0.01mol/lpbs溶解沉淀。用pb透析兩天后換0.01mol/lpbs透析兩天，收集透析液，12000r/min離心15min，取上清，置-20℃保存。

6.抗體效價測定

采用間接elisa方法測定抗體的效價為1:200000。具體步驟參考上述1.動物免疫中的內容。

7.抗體交叉反應性測定

采用間接競爭elisa方法測定，具體步驟為：

(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原做1:1000稀釋，每孔100μl包被酶標板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；

(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應2h后傾去封閉液，拍干；

(3)每孔先加入50μl系列稀釋的菊酯類農藥標準工作液(濃度分別為0、1、3、9、27、81μg/l)，然后加入50μl以pbs做1:200000稀釋的單克隆抗體，25℃反應30min后傾去反應液，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(4)加pbs稀釋的酶標二抗(1:1000)100μl/孔，25℃反應30min，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應；

(6)酶標儀測定波長在450nm的od值。

以菊酯類農藥濃度的對數(shù)值為橫坐標，以百分吸光度值(各濃度標準品od值與不加標準品孔od值的百分比)為縱坐標繪制標準曲線，見附圖3。以各曲線50％百分吸光度值的質量濃度(ic50)按下式計算交叉反應率，結果見表2，交叉反應率越小，抗體特異性越高。

式中：

si——交叉反應率，％；

y——溴氰菊酯標準工作液曲線的ic50值；

z——其他菊酯類農藥標準工作液曲線的ic50值。

表2交叉反應測定結果

注：“—”表示曲線扭曲變形，無法用于計算。

由表2可知，菊酯類農藥單克隆抗體對溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯戊聚酯、苯氯菊酯均有交叉反應，說明該抗體可以用于菊酯類農藥的多殘留免疫檢測。