本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種油菜組織特異性啟動(dòng)子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)的應(yīng)用，本發(fā)明提供的油菜組織特異性啟動(dòng)子能夠調(diào)控目的基因在植物花藥或花粉中特異轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。

背景技術(shù)：

高等植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)控制。外源dna序列通過連接到特定的啟動(dòng)子從而啟動(dòng)在植物宿主中的表達(dá)，因此啟動(dòng)子類型的選擇決定了基因的表達(dá)時(shí)間和部位。近些年比較熱門的研究對(duì)象是組織特異啟動(dòng)子，這些組織特異啟動(dòng)子主要包括葉片、韌皮部、維管束和根等器官特異表達(dá)啟動(dòng)子以及花粉、花器官、果實(shí)、種子等生殖器官特異表達(dá)啟動(dòng)子(宋揚(yáng)等，植物組織特異性啟動(dòng)子研究。生物技術(shù)通報(bào)，2007，(4)：21-24)。耿安奇等從白菜型油菜、甘藍(lán)型油菜、菜苔、甘藍(lán)中分離了4個(gè)啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)化煙草，gus染色分析其為花器官特異表達(dá)的啟動(dòng)子(gengaq,zhaozj,niexl,etal.expressionanalysisoffourflower-specificpromotersofbrassicaspp.intheheterogeneoushosttobacco[j].africanjournalofbiotechnology,2009,8(20).)。ariizumi等分離了ltp12,xth3和pga4的啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)化擬南芥，gus染色表明這3個(gè)啟動(dòng)子為花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子，且在表達(dá)時(shí)期上存在差異(ariizumit,amagaim,shibatad,etal.comparativestudyofpromoteractivityofthreeanther-specificgenesencodinglipidtransferprotein,xyloglucanendotransglucosylase/hydrolaseandpolygalacturonaseintransgenicarabidopsisthaliana[j].plantcellreports,2002,21(1):90-96.)。從玉米中克隆的zmglu1基因啟動(dòng)子,連接gus報(bào)告基因后轉(zhuǎn)化至煙草中，檢測(cè)分析結(jié)果玉米的zmglu1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了gus基因在煙草根部高效表達(dá)(gur,zhaol,zhangy,etal.isolationofamaizebeta-glucosidasegenepromoterandcharacterizationofitsactivityintransgenictobacco[j].plantcellreports,2006,25(11):1157-1165.)。

以上這些報(bào)道都是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不同的植物間進(jìn)行啟動(dòng)子功能分析的例子，這些實(shí)例表明利用模式植物擬南芥、煙草等作為受體，通過轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)告基因分析證實(shí)來自于其他植物的啟動(dòng)子的功能是被廣泛認(rèn)可和接受的。本發(fā)明從油菜中分離的一種組織特異啟動(dòng)子的功能鑒定就是通過模式植物擬南芥完成的，最終在油菜中驗(yàn)證。正是基于這個(gè)方法的成功應(yīng)用，可以對(duì)組織特異啟動(dòng)子的功能進(jìn)行快速的體內(nèi)驗(yàn)證，越來越多的組織特異啟動(dòng)子被報(bào)道，這些都可能成為植物基因工程領(lǐng)域有實(shí)用價(jià)值的組織特異啟動(dòng)子。組織特異啟動(dòng)子成功應(yīng)用的例子之一是通過基因工程調(diào)控植物花粉育性、創(chuàng)造植物雄性不育系、恢復(fù)系和保持系，已在一些作物上獲得成功。

目前利用基因工程創(chuàng)造雄性不育的策略主要是利用花粉或花藥特異啟動(dòng)子與外源基因融合，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，適時(shí)地阻斷花粉發(fā)育的過程從而達(dá)到雄性不育的目的。marianic等利用煙草花藥絨氈層特異啟動(dòng)子ta29與rnaset1或barnase融合在一起，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草和油菜，獲得了穩(wěn)定的雄性不育的轉(zhuǎn)化株(marianc,debeuckeleerm,truettnerj,etal.inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene[j].nature,1990,347:737-741.)。兩年后，marianic等又用ta29驅(qū)動(dòng)barstar基因，創(chuàng)建了上述雄性不育系的恢復(fù)(marianic,gosselev,debeuckeleerm,etal.achimaericribonuclease-inhibitorgenerestoresfertilitytomalesterileplants[j].nature,1992,357(6377):384-387.)。由此可見，即使不同的植物之間的體內(nèi)環(huán)境不同以及基因間存在互作差異，即使是與煙草性質(zhì)差異較大的植物，只要具有保守的核心啟動(dòng)區(qū)域和相應(yīng)保守的調(diào)控元件，就可以在其他不同植物中發(fā)揮啟動(dòng)下游基因穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)的生物學(xué)功能。

通過基因工程手段調(diào)控花粉育性、創(chuàng)造植物不育系、保持系及恢復(fù)系的關(guān)鍵之一是植物花粉或花藥啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性和特異性。目前已知的驅(qū)動(dòng)活性高且特異性良好的油菜花藥或花粉特異啟動(dòng)子還相對(duì)較少，而油菜因其基因組較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜等原因，在花藥發(fā)育分子機(jī)制方面的研究不多，更多的是參考模式植物擬南芥中的相關(guān)研究。因此油菜花藥和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆和鑒定，為油菜中利用基因工程調(diào)控花粉育性和創(chuàng)造植物雄性不育系提供新的調(diào)控元件，從而為油菜雜種優(yōu)勢(shì)資源在油菜育種中的充分利用打下基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種油菜組織特異性啟動(dòng)子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)的應(yīng)用，所述的油菜組織特異性啟動(dòng)子序列為seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種油菜組織特異性啟動(dòng)子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)的應(yīng)用，包括利用本領(lǐng)域成常規(guī)手段，將包含有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，即可達(dá)到調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)；seqidno.5所示的啟動(dòng)子序列可調(diào)控目的基因在植物花粉中特異表達(dá)，利用上述方法看創(chuàng)建基因工程不育系、保持系或恢復(fù)系。以上所述方案中，所述的植物為蕓薹屬植物，優(yōu)選的為油菜或擬南芥。

所述目的基因可以是促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，或者是引起pcd過程的關(guān)鍵基因，更具體的如油菜的半胱氨酸蛋白酶基因、β-1、3-葡聚糖酶基因，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞毒素基因、細(xì)胞凋亡基因或者可選自原核調(diào)控系統(tǒng)，還可以是顯性的雄性不育基因。

所述的重組植物表達(dá)載體中還可含有選擇標(biāo)記基因。所述的標(biāo)記基因通常包括提供抗生素抗性或除草劑抗性的基因，諸如：潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。

可以采用任何一種的植物轉(zhuǎn)化方法將本發(fā)明所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到受體植物的細(xì)胞、組織中，得到轉(zhuǎn)化體；再由轉(zhuǎn)化體通過植物組織培養(yǎng)方法再生得到完整的植株及其無性系或其后代；所述的轉(zhuǎn)化方法包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、顯微注射、電穿孔法、微粒轟擊等；所述的受體植物包括蕓薹屬植物；優(yōu)選的，所述的受體植物為油菜。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明將seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5的序列分別與報(bào)告基因可操作的連接，構(gòu)建得到重組植物表達(dá)載體；以擬南芥和油菜為受體材料，利用農(nóng)桿菌gv3101介導(dǎo)，將重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥和油菜中，不同轉(zhuǎn)化子的gus染色表明，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4或seqidno.5所示所示的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在花藥中特異表達(dá)，而在角果、根、莖、葉等其它組織部位里沒有表達(dá)活性；seqidno.5所示的序列能夠驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在花粉中特異表達(dá)，其它組織部位不表達(dá)。說明seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示的啟動(dòng)子片段都具有組織特異性啟動(dòng)子的功能。本發(fā)明對(duì)油菜花藥和花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆和鑒定，為油菜中利用基因工程調(diào)控花粉育性和創(chuàng)造植物雄性不育系提供新的調(diào)控元件，從而為油菜雜種優(yōu)勢(shì)資源在油菜育種中的充分利用打下基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是啟動(dòng)子片段seqidno.1和seqidno.5檢測(cè)電泳圖；

其中泳道m(xù)：dnamarker；泳道1：seqidno.1所示的啟動(dòng)子；泳道2：seqidno.5所示的啟動(dòng)子。

圖2為表達(dá)載體pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost的示意圖。

圖3為啟動(dòng)子seqidno.1啟動(dòng)子元件示意圖。

圖4為啟動(dòng)子seqidno.1轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織器官的gus染色。

其中，a為14d整株苗；b為莖生葉；c為花序；d為花蕾；e為5mm長(zhǎng)角果；f為10mm長(zhǎng)角果。

圖5為啟動(dòng)子seqidno.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織器官的gus染色示意圖；

其中，a為14d整株苗；b為莖生葉；c為花序；d為花蕾；e為5mm長(zhǎng)角果；f為10mm長(zhǎng)角果。

圖6為啟動(dòng)子seqidno.5轉(zhuǎn)基因擬南芥gus染色花藥的半薄切片。

其中，s11為花藥發(fā)育第11期；s12為花藥發(fā)育第12期；s13為花藥發(fā)育第13期；s14為花藥發(fā)育第14期，bar＝20μm。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1：

油菜組織特異啟動(dòng)子seqidno.1～seqidno.5的克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用ctab法提取油菜中雙11葉片基因組dna，以此dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μl。

擴(kuò)增啟動(dòng)子seqidno.1的引物為：

1-f：5′-(sali)cgcgtcgacccatcttactccaatagtattttgg-3'、1-r：5′-(smai)ccccgggccgttcttcttttcaatatttaaaa-3；

擴(kuò)增啟動(dòng)子seqidno.2的引物為：

2-f：5′-(sali)cgcgtcgacatggagaacttaaatagacaaatac-3'、2-r：5′-(smai)ccccgggccgttcttcttttcaatatttaaaa-3；

擴(kuò)增啟動(dòng)子seqidno.3的引物為：

3-f:5′-(sali)cgcgtcgacatggagaacttaaatagacaaatac-3'、3-r：5′-(smai)ccccgggaatcagattatttaagctgtctaaa-3；

擴(kuò)增啟動(dòng)子seqidno.4的引物為：

4-f：5′-(sali)cgcgtcgacatgaaacgaaagccacctc-3'、4-r：5′-(smai)ccccgggccgttcttcttttcaatatttaaaa-3；

擴(kuò)增啟動(dòng)子seqidno.5的引物為：

5-f：5′-(sali)cgcgtcgacatgaaacgaaagccacctc-3'和5-r：5′-(smai)ccccgggaatcagattatttaagctgtctaaa-3。

50μl體系如下：

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2min，然后以98℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1.0％質(zhì)量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，pcr產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后，37℃酶切(sali和smai)2h，再次回收，分別與植物表達(dá)載體pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost在4℃過夜連接，熱激法轉(zhuǎn)化并挑取單克隆，pcr檢測(cè)陽性后送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與參考基因組序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5完全一致，即獲得了含有目的啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，分別命名為pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-1，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-2，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-3，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-4和pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-5。

實(shí)施例2：

啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)的應(yīng)用：

1)啟動(dòng)子融合報(bào)告基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥

實(shí)施例1構(gòu)建成功的含有啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的單克隆大腸桿菌菌液37℃活化并提取質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)法將pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-1，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-2，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-3，pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-4和pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-5分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素(50μg/ml)和利福平(50μg/ml)的平板上培養(yǎng)后挑取單克隆，用啟動(dòng)子的克隆引物檢測(cè)，確定陽性克隆。28℃活化陽性農(nóng)桿菌菌液，采用花序浸染法(zhangx,henriquesr,linss,etal.agrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod[j].natureprotocols,2006,1(2):641-646.)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，浸染2次后收獲的種子，經(jīng)消毒后均勻地鋪在含有濃度為50μg/ml卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，獲得的存活綠苗初步認(rèn)定為陽性植株。將它們移栽到蛭石中，待植株長(zhǎng)至5-7片真葉時(shí)取一個(gè)葉片，ctab法提取葉片基因組dna，對(duì)其進(jìn)行pcr鑒定，引物為啟動(dòng)子特異擴(kuò)增引物，反應(yīng)體系和程序如實(shí)施例1所述。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr反應(yīng)產(chǎn)物，大小與目的啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的大小一致。結(jié)果表明5個(gè)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入擬南芥，收獲各陽性單株的t1代種子。

2)轉(zhuǎn)基因擬南芥不同組織器官的gus染色

在含有濃度為50μg/ml卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上篩選各陽性單株的t1代種子，每個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)載體確定符合孟德爾遺傳定律3:1分離的單拷貝的株系3-5個(gè)，在t3代進(jìn)行不同組織(14d整株苗，開花后的莖、葉片、花序、5mm長(zhǎng)角果、10mm長(zhǎng)角果)進(jìn)行g(shù)us染色，步驟如下：

(1)收集擬南芥材料到小離心管中或小玻璃瓶中(事先加入預(yù)冷的90％丙酮)，冰上放置，直到收集完所有樣品。

(2)材料收集完后在冰上放置20min。

(3)丙酮處理完，用預(yù)冷的gus染色緩沖液漂洗組織約10min。gus染色緩沖液的成分見下表。

gus染色緩沖液的成分

(4)換掉染色緩沖液，加入含有x-gluc的gus染液，抽真空15-30min。gus染液成分見下表。

gus染液的成分

(5)37℃染色過夜。

(6)去掉染液。在室溫下將染色樣品依次置于20％、35％、50％、70％乙醇溶液中，每個(gè)處理30min，其中在70％乙醇中，染色組織可以長(zhǎng)期保存或觀察。

用olympusdp72數(shù)碼成像系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果照相并保存圖片。各株系的gus染色結(jié)果均表明：?jiǎn)?dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4可以驅(qū)動(dòng)gus基因在擬南芥的花藥中特異表達(dá)，其它組織和器官中均不表達(dá)(圖4)；啟動(dòng)子seqidno.5驅(qū)動(dòng)gus基因在擬南芥花粉中特異表達(dá)(圖5)。

3)啟動(dòng)子seqidno.5轉(zhuǎn)基因擬南芥gus染色花藥的半薄切片

為了確定啟動(dòng)子seqidno.5驅(qū)動(dòng)gus基因表達(dá)的具體時(shí)期，我們對(duì)啟動(dòng)子seqidno.5的gus染色的花藥進(jìn)行半薄切片。步驟如下：

l)脫水：保存在70％乙醇中的被gus染色的花序，分別在80％、95％和100％乙醇中逐級(jí)脫水，每級(jí)脫水2h。

2)脫水完成后，輕輕的將花序切開，分成單個(gè)的小花蕾，再進(jìn)行如下操作：

a，預(yù)滲透：將小花蕾置于預(yù)滲透液(95％乙醇：baseliquidtechnovit7100＝1：1混合)中預(yù)滲透3h。

b，滲透：小花蕾轉(zhuǎn)入適量的滲透液(1g硬化劑i溶于100mlbaseliquidteclmovit7100)中滲透8-12h。

c，包埋：每個(gè)200μl小離心管內(nèi)加入100μl的包埋劑(硬化劑ⅱ：滲透液＝1：15混合)，將單個(gè)的小花蕾用尖頭鑷子輕輕地塞入離心管內(nèi)，盡量保持小花蕾垂直向下，然后將離心管垂直放置在pcr板上。室溫下幾分鐘后即開始凝固聚合，2h后將包埋好的樣品置于37度恒溫箱內(nèi)繼續(xù)聚合，1周后即可進(jìn)行切片。

d，切片：用leicaultracutr型超薄切片機(jī)進(jìn)行切片,切片厚度為8μm，邊切片邊鏡檢(nikoneclipse80i顯微鏡)，保證切片的完整性。

e，粘片：切好的片子用細(xì)銅絲繞制的小銅網(wǎng)撈片，直接轉(zhuǎn)到滴有水的干凈載玻片上，電熱臺(tái)上展片、烘干。

f，封片：加拿大樹脂封片，永久保存。

h，觀察照相：nikoneclipse80i顯微鏡下觀察，并用ds-ril數(shù)碼照相。

gus染色花藥的半薄切片表明啟動(dòng)子seqidno.5的gus信號(hào)特異在花粉的雙核初期出現(xiàn)，持續(xù)至花粉粒成熟(圖6)。

綜合這些結(jié)果說明：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示的核苷酸序列是花藥特異啟動(dòng)子，seqidno.5是一個(gè)花粉特異啟動(dòng)子。這些特異啟動(dòng)子片段為控制植物育性提供了新的有效調(diào)控元件，對(duì)基因工程育種具有很好的應(yīng)用前景。

4)seqidno.5轉(zhuǎn)基因油菜花藥的gus染色

將pg2nhl-h2byfp-gusplus-nost-5轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中，對(duì)陽性單株進(jìn)行g(shù)us染色，發(fā)現(xiàn)gus基因只在花粉中表達(dá)，和擬南芥中結(jié)果一致。

實(shí)施例3：

啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5序列在蕓薹屬植物白菜、甘藍(lán)和油菜中的保守性

基于pcr反應(yīng)，使用實(shí)施案例1中的引物分別克隆了啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5在白菜、甘藍(lán)和油菜中的同源片段并測(cè)序，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們的序列同源性高達(dá)100％，最低的為99.78％，僅1bp差異，而且該差異不在核心啟動(dòng)子區(qū)域。這說明啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5序列在蕓薹屬植物白菜、甘藍(lán)和油菜中是高度保守。預(yù)示著啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的功能也是保守的。正如實(shí)施案例2中的seqidno.5啟動(dòng)子在擬南芥和油菜中驅(qū)動(dòng)gus基因表達(dá)的模式相同。也就是說將啟動(dòng)子seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入到白菜、甘藍(lán)和油菜中，它們驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的模式是相同的，均是花藥或花粉特異表達(dá)。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種油菜組織特異性啟動(dòng)子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)的應(yīng)用

<130>一種油菜組織特異性啟動(dòng)子在調(diào)控目的基因在植物花藥中特異表達(dá)的應(yīng)用

<160>5

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>375

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ccatcttactccaatagtattttggatcttactcattttctgtcttttgaaaacatctaa60

aacttgattatggagaacttaaatagacaaatacatttataagccgaaaactatgtcact120

acgctttgctgcttttggcatatacatgttgtttaatttactcgcatgaaacgaaagcca180

cctcacgtcgtgctattttcggtgtaaccttaacggtggatctttaaataaaaccaaact240

atttaaatttagggcacaatccaacaaaagtagtacaacacgtaaaaatcgttgcaactt300

tagacagcttaaataatctgattatgaccttttcttaaaccattcttttgttttaaatat360

tgaaaagaagaacgg375

<210>2

<211>306

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggagaacttaaatagacaaatacatttataagccgaaaactatgtcactacgctttgc60

tgcttttggcatatacatgttgtttaatttactcgcatgaaacgaaagccacctcacgtc120

gtgctattttcggtgtaaccttaacggtggatctttaaataaaaccaaactatttaaatt180

tagggcacaatccaacaaaagtagtacaacacgtaaaaatcgttgcaactttagacagct240

taaataatctgattatgaccttttcttaaaccattcttttgttttaaatattgaaaagaa300

gaacgg306

<210>3

<211>254

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atggagaacttaaatagacaaatacatttataagccgaaaactatgtcactacgctttgc60

tgcttttggcatatacatgttgtttaatttactcgcatgaaacgaaagccacctcacgtc120

gtgctattttcggtgtaaccttaacggtggatctttaaataaaaccaaactatttaaatt180

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