本發(fā)明涉及多肽藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化分離西曲瑞克的方法。

背景技術(shù)：

西曲瑞克是一種合成的10肽，是一種有效的黃體酮釋放激素抑制素(lhrh)受體拮抗劑，它能控制卵巢的刺激作用，預(yù)防不成熟卵泡過早排出，幫助受孕。并可用于治療乳腺癌和婦科癌，子宮內(nèi)膜異位癥、性早熟、子宮肌瘤、卵巢雄激素過多和經(jīng)前綜合癥。由于西曲瑞克的自身物理性質(zhì)而易被胃腸道中的酵素分解破壞，不能通過口服使用，因此常作注射用西曲瑞克制劑，通過皮下或肌肉注射吸收，迅速發(fā)揮作用。

西曲瑞克的序列如下：

ac-d-2-nal-d-4cpa-d-3pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2

目前尚未有西曲瑞克純化方法的專利或文獻(xiàn)，但從西曲瑞克的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)看，毒性雜質(zhì)：脫酰胺西曲瑞克和乙?；髑鹂穗s質(zhì)是產(chǎn)品純度控制的關(guān)鍵點。

在生產(chǎn)西曲瑞克的過程中，我們也發(fā)現(xiàn)脫酰胺西曲瑞克雜質(zhì)和乙?；髑鹂穗s質(zhì)比較難分離，嚴(yán)重影響產(chǎn)品收率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種純化分離西曲瑞克的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種純化分離西曲瑞克的方法，包括如下步驟：

步驟1、將西曲瑞克粗品溶解于乙腈水溶液中，超聲處理，濾膜過濾，得到粗品溶液待用；

步驟2、使用高效液相色譜法對粗品溶液進(jìn)行分離純化：色譜柱為反相色譜柱，流動相a為磷酸二氫鈉水溶液，流動相b為乙腈；用流動相a平衡反相色譜柱后，將粗品溶液載入到反相色譜柱中，采用梯度洗脫分離純化；

步驟3、將分離純化后，純度達(dá)99.5％以上目的肽溶液于水溫不超過38℃下進(jìn)行減壓旋蒸濃縮，得到濃縮液待用；

步驟4、用醋酸水溶液平衡反相色譜柱后，將濃縮液上樣至反相色譜柱中，用醋酸水溶液/乙腈體系進(jìn)行轉(zhuǎn)鹽；

步驟5、轉(zhuǎn)好醋酸鹽且純度99.5％以上目的肽溶液于水溫不超過38℃下進(jìn)行減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到粉末狀西曲瑞克產(chǎn)品。

進(jìn)一步地，步驟2流動相a為質(zhì)量濃度0.03wt％～6.0wt％的磷酸二氫鈉水溶液，并用磷酸調(diào)ph至2.5～4.5。

進(jìn)一步地，步驟2流動相a為質(zhì)量濃度0.2wt％～0.8wt％的磷酸二氫鈉水溶液，并用磷酸調(diào)ph至3.0～4.0。

進(jìn)一步地，步驟2按體積分?jǐn)?shù)設(shè)置流動相梯度，0到60分鐘a：b由80～65：20～35到40～25：60～75。

進(jìn)一步地，步驟1中西曲瑞克粗品純度不低于80％，脫酰胺西曲瑞克雜質(zhì)含量不高于5％，乙?；髑鹂穗s質(zhì)含量不高于1.5％。

進(jìn)一步地，步驟1中乙腈水溶液為20-40v/v％乙腈水溶液。

進(jìn)一步地，步驟1中用孔徑為0.45μm濾膜過濾。

進(jìn)一步地，反相色譜柱內(nèi)的固定相為c18或c8反相填料。

進(jìn)一步地，步驟4用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液平衡反相色譜柱后，將濃縮液上樣至反相色譜柱中，用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的0.05～1.0v/v％醋酸水溶液洗脫，收集洗脫液即轉(zhuǎn)好醋酸鹽的肽溶液。

進(jìn)一步地，平衡、洗脫、沖洗反相色譜柱的流速根據(jù)反相色譜柱的規(guī)格進(jìn)行設(shè)定，2*25cm反相色譜柱采用5～20ml/min的流速，其它規(guī)格的反相色譜柱流速線性放大。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用反相c18或c8柱、磷酸二氫鈉緩沖體系(ph＝2.5-4.5)進(jìn)行純化分離。此純化方法能有效分離西曲瑞克中的毒性雜質(zhì)：脫酰胺雜質(zhì)和乙?；髑鹂穗s質(zhì)。本發(fā)明可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中由于脫酰胺雜質(zhì)和乙?；髑鹂穗s質(zhì)未有效分離而存在收率低的難題，大大提高西曲瑞克的純化收率，收率高達(dá)45％，降低生產(chǎn)成本。且所得西曲瑞克產(chǎn)物純度高達(dá)99.5％。本發(fā)明方法只需要一次過柱即可同時分離西曲瑞克產(chǎn)品中的毒性雜質(zhì)：脫酰胺西曲瑞克和乙酰西曲瑞克雜質(zhì)，控制雜質(zhì)含量小于0.1％，有效提高西曲瑞克產(chǎn)品的安全性。獲得的西曲瑞克不僅純度高，而且收率好，達(dá)到工業(yè)化生成的要求，具有良好的經(jīng)濟(jì)價值和廣泛的應(yīng)用前景。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做更進(jìn)一步地解釋。下列實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實施范圍。

一種純化分離西曲瑞克的方法，包括如下步驟：

步驟1、將西曲瑞克粗品溶解于20-40v/v％乙腈水溶液中，超聲處理，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，得到粗品溶液待用；西曲瑞克粗品純度不低于80％，脫酰胺西曲瑞克雜質(zhì)含量不高于5％，乙?；髑鹂穗s質(zhì)含量不高于1.5％。

步驟2、使用高效液相色譜法對粗品溶液進(jìn)行分離純化：色譜柱為反相色譜柱，固定相為c18或c8反相填料，流動相a為磷酸二氫鈉水溶液，磷酸二氫鈉水溶液為質(zhì)量濃度0.03wt％～6.0wt％的磷酸二氫鈉水溶液，并用磷酸調(diào)ph至2.5～4.5，磷酸二氫鈉濃度過低，影響洗脫能力，磷酸二氫鈉濃度過高，在生產(chǎn)過程中易析出，造成儀器和柱子損壞，ph值過高或過低，會影響毒性雜質(zhì)：脫酰胺西曲瑞克和乙?；髑鹂说姆蛛x；優(yōu)選地，為質(zhì)量濃度0.2wt％～0.8wt％的磷酸二氫鈉水溶液，并用磷酸調(diào)ph至3.0～4.0；流動相b為乙腈；用流動相a平衡反相色譜柱后，將粗品溶液載入到反相色譜柱中，采用梯度洗脫分離純化，按體積分?jǐn)?shù)設(shè)置流動相梯度，0到60分鐘a：b由80～65：20～35到40～25：60～75。平衡、洗脫、沖洗反相色譜柱的流速根據(jù)反相色譜柱的規(guī)格進(jìn)行設(shè)定，2*25cm反相色譜柱采用5～20ml/min的流速，其它規(guī)格的反相色譜柱流速線性放大。

步驟3、將分離純化后，純度達(dá)99.5％以上目的肽溶液于水溫不超過38℃下進(jìn)行減壓旋蒸濃縮至濃度約10-20mg/ml，得到濃縮液待用；

步驟4、用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液平衡反相色譜柱后，將濃縮液上樣至反相色譜柱中，用0.05～1.0v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的0.05～1.0v/v％醋酸水溶液洗脫，收集洗脫液即轉(zhuǎn)好醋酸鹽的肽溶液。

步驟5、轉(zhuǎn)好醋酸鹽且純度99.5％以上目的肽溶液于水溫不超過38℃下進(jìn)行減壓旋蒸濃縮至10-20mg/ml，冷凍干燥，得到粉末狀西曲瑞克產(chǎn)品。

根據(jù)西曲瑞克序列，采用fmoc(n-芴甲氧羰基)策略，固相合成法逐步偶聯(lián)獲得西曲瑞克肽樹脂，經(jīng)裂解后得到386g西曲瑞克粗品，其純度為86％，脫酰胺西曲瑞克雜質(zhì)含量為2.8％和乙?；髑鹂穗s質(zhì)含量為1.1％，用于以下實施例。

實施例1

1、取西曲瑞克粗品50g，每克西曲瑞克粗品溶解于100ml35v/v％乙腈水溶液中，超聲處理，待粗品完全溶解后，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，收集濾液待用。

2、純化：反相色譜柱：以c18為固定相，柱子直徑和填裝長度為：20*25cm。流動相a：質(zhì)量濃度0.4wt％的磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)ph值至3.3；b相：乙腈。流速800ml/min。檢測波長220nm。將反相色譜柱用流動相a平衡后，將步驟1的濾液載入到反相色譜柱中。采用梯度：b％：22～62％(60min)進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。

3、濃縮：將收集的純度達(dá)99.5％以上目的肽溶液于不超過38℃下進(jìn)行減壓旋蒸濃縮，至約10-20mg/ml后備用。

4、轉(zhuǎn)鹽：將反相色譜柱用0.1v/v％醋酸水溶液平衡后，將步驟3濃縮液載入到反相色譜柱中，用0.1v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％0.1v/v％醋酸水溶液洗脫，收集轉(zhuǎn)好醋酸鹽的肽溶液。

5、將步驟4轉(zhuǎn)好醋酸鹽的肽溶液進(jìn)行減壓旋蒸濃縮至10-20mg/ml，轉(zhuǎn)至大小合適的不銹鋼盤中，冷凍干燥后得到純度大于99.5％的西曲瑞克，收率為45％。本實施例制備的西曲瑞克未檢測出乙?；髑鹂?，脫酰胺西曲瑞克檢測低于0.1％。

實施例2

1、取西曲瑞克粗品65g，每克西曲瑞克粗品溶解于100ml35v/v％乙腈水溶液中，超聲處理，待粗品完全溶解后，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，收集濾液待用。

2、純化：反相色譜柱：以c18為固定相，柱子直徑和填裝長度為：20*25cm。流動相a：質(zhì)量濃度0.8wt％磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)ph值至3.8；b相：乙腈。流速1000ml/min。檢測波長220nm。將反相色譜柱用流動相a平衡后，將步驟1的濾液載入到反相色譜柱中。采用梯度：b％：20～60％(60min)進(jìn)行洗脫，收集樣品液。

3、濃縮：將收集的純度達(dá)99.5％以上目的肽溶液于不超過38℃下進(jìn)行減壓旋蒸濃縮，至約10-20mg/ml后備用。

4、轉(zhuǎn)鹽：將反相色譜柱用0.1v/v％醋酸水溶液平衡后，將步驟3濃縮液載入到反相色譜柱中，用0.1v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％0.1v/v％醋酸水溶液洗脫，收集轉(zhuǎn)好醋酸鹽的肽溶液。

5、將步驟4轉(zhuǎn)好醋酸鹽的肽溶液進(jìn)行減壓旋蒸濃縮至10-20mg/ml，轉(zhuǎn)至大小合適的不銹鋼盤中，冷凍干燥后得到純度大于99.5％的西曲瑞克，收率為41％。本實施例制備的西曲瑞克未檢測出乙?；髑鹂?，脫酰胺西曲瑞克檢測低于0.1％。