本發(fā)明涉及一組snp位點(diǎn)基因分型引物及其在小麥品種鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

snp(singlenucleotidepolymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、檢測(cè)通量高、數(shù)據(jù)容易整合和標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最有效dna標(biāo)記方法之一，在作物的品種鑒定中得到應(yīng)用，也被國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(upov)被推薦作為品種鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的優(yōu)選標(biāo)記。目前針對(duì)snp的分型檢測(cè)方法有多種，不同的方法在檢測(cè)通量及成本上差異較大，其中kasp分型法是比較經(jīng)濟(jì)適用的方法之一，具有位點(diǎn)擴(kuò)展性性強(qiáng)、操作便捷、結(jié)果容易分析等特點(diǎn)，尤其適合大量樣本的少量snp位點(diǎn)的分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一組小麥snp位點(diǎn)基因分型引物及其在小麥品種鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)16個(gè)snp位點(diǎn)的產(chǎn)品在小麥品種鑒定中的應(yīng)用；

所述16個(gè)snp位點(diǎn)如下所示：

第1個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列1自5’端第51位核苷酸，該snp為t/c多態(tài)；

第2個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列2自5’端第51位核苷酸，該snp為a/c多態(tài)；

第3個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列3自5’端第51位核苷酸，該snp為t/c多態(tài)；

第4個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列4自5’端第51位核苷酸，該snp為a/g多態(tài)；

第5個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列5自5’端第51位核苷酸，該snp為t/c多態(tài)；

第6個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列6自5’端第51位核苷酸，該snp為a/g多態(tài)；

第7個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列7自5’端第51位核苷酸，該snp為a/c多態(tài)；

第8個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列8自5’端第51位核苷酸，該snp為t/c多態(tài)；

第9個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列9自5’端第51位核苷酸，該snp為t/g多態(tài)；

第10個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列10自5’端第51位核苷酸，該snp為t/g多態(tài)；

第11個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列11自5’端第51位核苷酸，該snp為a/c多態(tài)；

第12個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列12自5’端第51位核苷酸，該snp為a/g多態(tài)；

第13個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列13自5’端第51位核苷酸，該snp為a/g多態(tài)；

第14個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列14自5’端第51位核苷酸，該snp為t/g多態(tài)；

第15個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列15自5’端第51位核苷酸，該snp為t/c多態(tài)；

第16個(gè)snp位點(diǎn)：小麥基因組中序列表中序列16自5’端第51位核苷酸，該snp為t/c多態(tài)。

所述“用于檢測(cè)16個(gè)snp位點(diǎn)的產(chǎn)品”為引物組合；所述引物探針組合由16個(gè)引物組組成；

引物組1由引物f1-1、引物f1-2和引物r1組成；所述引物f1-1為序列表的序列17所示的單鏈dna分子；所述引物f1-2為序列表的序列18所示的單鏈dna分子；所述引物r1為序列表的序列19所示的單鏈dna分子；

引物組2由引物f2-1、引物f2-2和引物r2組成；所述引物f2-1為序列表的序列20所示的單鏈dna分子；所述引物f2-2為序列表的序列21所示的單鏈dna分子；所述引物r2為序列表的序列22所示的單鏈dna分子；

引物組3由引物f3-1、引物f3-2和引物r3組成；所述引物f3-1為序列表的序列23所示的單鏈dna分子；所述引物f3-2為序列表的序列24所示的單鏈dna分子；所述引物r3為序列表的序列25所示的單鏈dna分子；

引物組4由引物f4-1、引物f4-2和引物r4組成；所述引物f4-1為序列表的序列26所示的單鏈dna分子；所述引物f4-2為序列表的序列27所示的單鏈dna分子；所述引物r4為序列表的序列28所示的單鏈dna分子；

引物組5由引物f5-1、引物f5-2和引物r5組成；所述引物f5-1為序列表的序列29所示的單鏈dna分子；所述引物f5-2為序列表的序列30所示的單鏈dna分子；所述引物r5為序列表的序列31所示的單鏈dna分子；

引物組6由引物f6-1、引物f6-2和引物r6組成；所述引物f6-1為序列表的序列32所示的單鏈dna分子；所述引物f6-2為序列表的序列33所示的單鏈dna分子；所述引物r6為序列表的序列34所示的單鏈dna分子；

引物組7由引物f7-1、引物f7-2和引物r7組成；所述引物f7-1為序列表的序列35所示的單鏈dna分子；所述引物f7-2為序列表的序列36所示的單鏈dna分子；所述引物r7為序列表的序列37所示的單鏈dna分子；

引物組8由引物f8-1、引物f8-2和引物r8組成；所述引物f8-1為序列表的序列38所示的單鏈dna分子；所述引物f8-2為序列表的序列39所示的單鏈dna分子；所述引物r8為序列表的序列40所示的單鏈dna分子；

引物組9由引物f9-1、引物f9-2和引物r9組成；所述引物f9-1為序列表的序列41所示的單鏈dna分子；所述引物f9-2為序列表的序列42所示的單鏈dna分子；所述引物r9為序列表的序列43所示的單鏈dna分子；

引物組10由引物f10-1、引物f10-2和引物r10組成；所述引物f10-1為序列表的序列44所示的單鏈dna分子；所述引物f10-2為序列表的序列45所示的單鏈dna分子；所述引物r10為序列表的序列46所示的單鏈dna分子；

引物組11由引物f11-1、引物f11-2和引物r11組成；所述引物f11-1為序列表的序列47所示的單鏈dna分子；所述引物f11-2為序列表的序列48所示的單鏈dna分子；所述引物r11為序列表的序列49所示的單鏈dna分子；

引物組12由引物f12-1、引物f12-2和引物r12組成；所述引物f12-1為序列表的序列50所示的單鏈dna分子；所述引物f12-2為序列表的序列51所示的單鏈dna分子；所述引物r12為序列表的序列52所示的單鏈dna分子；

引物組13由引物f13-1、引物f13-2和引物r13組成；所述引物f13-1為序列表的序列53所示的單鏈dna分子；所述引物f13-2為序列表的序列54所示的單鏈dna分子；所述引物r13為序列表的序列55所示的單鏈dna分子；

引物組14由引物f14-1、引物f14-2和引物r14組成；所述引物f14-1為序列表的序列56所示的單鏈dna分子；所述引物f14-2為序列表的序列57所示的單鏈dna分子；所述引物r14為序列表的序列58所示的單鏈dna分子；

引物組15由引物f15-1、引物f15-2和引物r15組成；所述引物f15-1為序列表的序列59所示的單鏈dna分子；所述引物f15-2為序列表的序列60所示的單鏈dna分子；所述引物r15為序列表的序列61所示的單鏈dna分子；

引物組16由引物f16-1、引物f16-2和引物r16組成；所述引物f16-1為序列表的序列62所示的單鏈dna分子；所述引物f16-2為序列表的序列63所示的單鏈dna分子；所述引物r16為序列表的序列64所示的單鏈dna分子。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在小麥品種鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合的試劑盒，所述試劑盒的用途為鑒定小麥品種。

本發(fā)明保護(hù)一種鑒定小麥品種的方法(方法甲)，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)小麥品種在所述16個(gè)snp位點(diǎn)上的基因型；根據(jù)基因型確定待鑒定小麥的品種。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定小麥品種的方法(方法乙)，包括如下步驟：提取待鑒定小麥品種的基因組dna；利用所述引物組合對(duì)所述基因組dna分別進(jìn)行所述16個(gè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)，從而獲得待測(cè)小麥品種在所述16個(gè)snp位點(diǎn)上的基因型數(shù)據(jù)；根據(jù)基因型數(shù)據(jù)確定待鑒定小麥的品種。

所述方法乙具體包括如下步驟：(1)提取待鑒定小麥品種的基因組dna；(2)以步驟(1)得到的基因組dna為模板，依次采用所述引物組合中的每個(gè)snp位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的各條引物對(duì)模板進(jìn)行kasppcr擴(kuò)增；(3)對(duì)步驟(2)得到的擴(kuò)增的熒光信號(hào)進(jìn)行收集和分析，獲得待測(cè)小麥品種在所述16個(gè)snp位點(diǎn)上的基因型數(shù)據(jù)，根據(jù)基因型數(shù)據(jù)確定待鑒定小麥的品種。

所述kasppcr反應(yīng)體系具體可為：pcr混合液(kasp2×mastermix)(英國(guó)laboratoryofthegovernmentchemist，貨號(hào)：kbs-1016-002)2.5μl，正向引物1和正向引物2各0.2μl(終濃度0.2μm)，反向引物0.3μl(終濃度0.3μm)，模板0.5μl(dna含量為25-50ng/μl)，ddh2o1.3μl,總體積5μl。

所述kasppcr擴(kuò)增可在abi-viia7實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行，由儀器自帶的viia^tm7softwarev1.2.2軟件對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)進(jìn)行收集和分析(參照軟件使用說(shuō)明書(shū))。

本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定小麥品種的試劑盒，包括權(quán)利要求所述引物組合及記載有所述方法乙的說(shuō)明書(shū)。

以上任一所述小麥品種具體可為表1中所示的小麥品種。

本發(fā)明通過(guò)snp芯片技術(shù)篩選出適合品種鑒定的多態(tài)性snp位點(diǎn)，根據(jù)snp位點(diǎn)dna序列信息設(shè)計(jì)kasp分型引物，再利用kasp分型技術(shù)對(duì)44個(gè)審定小麥品種進(jìn)行了鑒定分析，評(píng)價(jià)引物鑒別能力，構(gòu)建了一組適合小麥品種鑒定snp位點(diǎn)組合及快速分型方法，為小麥品種室內(nèi)快速鑒定提供技術(shù)支撐。

附圖說(shuō)明

圖1為44個(gè)小麥品種bs00074301_51位點(diǎn)的基因分型圖。

圖2為16個(gè)snp位點(diǎn)對(duì)44個(gè)小麥品種遺傳聚類(lèi)分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。

實(shí)施例中的44個(gè)小麥品種見(jiàn)表1。表1中的所有品種均可從北京種子管理站農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)樣品庫(kù)獲得。

表144個(gè)小麥品種及來(lái)源

實(shí)施例1、用于小麥品種鑒定的snp位點(diǎn)的開(kāi)發(fā)

取22個(gè)小麥常規(guī)種(編號(hào)1-22)和2個(gè)雜交種(編號(hào)7，8)及其親本作為位點(diǎn)篩選材料，按照illumina公司提供的基于光纖微珠芯片infinium技術(shù)的操作流程進(jìn)行，利用小麥illumina90k全基因組snp芯片對(duì)這28個(gè)小麥品種進(jìn)行分型鑒定，用iscan芯片掃描儀掃描分型結(jié)果，獲得原始數(shù)據(jù)。用genomestudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得待測(cè)樣品snp位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)。

結(jié)果顯示，在81587個(gè)snp位點(diǎn)中，平均數(shù)據(jù)獲得率(callrate值)為92.8％，其中16499個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出多態(tài)性(表現(xiàn)為2或3種基因型),多態(tài)性位點(diǎn)比率為20.2％。根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失率(低于5％)、重復(fù)性、信號(hào)強(qiáng)度、以及是否符合遺傳規(guī)律，篩選出3467個(gè)snp位點(diǎn)作為小麥品種鑒定的候選位點(diǎn)，并從中挑選16個(gè)基因型分布較為均勻(每種基因型比率不小于5％)的snp位點(diǎn)(見(jiàn)表2)。

表2snp位點(diǎn)信息

實(shí)施例2、用于小麥品種鑒定的引物的開(kāi)發(fā)

針對(duì)實(shí)施例1篩選得到的16個(gè)snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，具體如表3所示。

每個(gè)snp位點(diǎn)共有3個(gè)引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。

表3中的各條引物在使用時(shí)均以工作液的形式加入至反應(yīng)體系中，引物在工作液的濃度均為5μm。

實(shí)施例3、小麥品種鑒定

1、提取表1中各小麥品種的基因組dna。

2、以步驟1得到的基因組dna為模板，依次采用表3中每個(gè)snp位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的各條引物對(duì)模板進(jìn)行kasppcr擴(kuò)增。

kasppcr反應(yīng)體系(5μl)：pcr混合液(kasp2×mastermix)(英國(guó)laboratoryofthegovernmentchemist，貨號(hào)：kbs-1016-002)2.5μl，正向引物1和正向引物2各0.2μl(終濃度0.2μm)，反向引物0.3μl(終濃度0.3μm)，模板0.5μl(dna含量為25-50ng/μl)，ddh2o1.3μl。

擴(kuò)增反應(yīng)在abi-viia7實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行，由viia^tm7softwarev1.2.2對(duì)擴(kuò)增的熒光信號(hào)進(jìn)行收集和分析。采用powermarker3.25軟件計(jì)算snp位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(pic)，ntsys-pcversion2.0軟件計(jì)算品種間的遺傳相似性系數(shù)并進(jìn)行遺傳聚類(lèi)分析。

44個(gè)小麥品種在表2中編號(hào)為11的bs00074301_51位點(diǎn)的分型圖如圖1所示。遺傳聚類(lèi)分析結(jié)果如圖2所示(圖2中，右側(cè)數(shù)字對(duì)應(yīng)表1中的小麥品種編號(hào))。結(jié)果顯示16個(gè)snp位點(diǎn)在這些品種中的平均數(shù)據(jù)獲得率為98.6％，多態(tài)性信息量(pic)變幅為0.34-0.375之間，平均為0.365(表2)，均為中高度多態(tài)性信息引物。品種間遺傳相似性系數(shù)介于0.167-0.96之間，平均遺傳相似性系數(shù)為0.522，遺傳聚類(lèi)分析結(jié)果顯示44個(gè)小麥品種之間至少有1個(gè)以上差異位點(diǎn)，說(shuō)明該16個(gè)snp位點(diǎn)組合具有較強(qiáng)的品種鑒別能力，能正確將44個(gè)小麥品種鑒別開(kāi)，適合小麥品種鑒定。

<110>北京市種子管理站

<120>一組snp位點(diǎn)基因分型引物及其在小麥品種鑒定中的應(yīng)用

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<210>18

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

aatttgcggagcatccaggcg21

<210>19

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

ttccaatctttggcaccataaccactt27

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

cttggtagtttggttcgcct20

<210>21

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>21

ctcttggtagtttggttcgccg22

<210>22

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

cacaaagcagcaacaaacacgaccta26

<210>23

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>23

gatcattttctagttcttgaattgcaacttt31

<210>24

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>24

atcattttctagttcttgaattgcaacttc30

<210>25

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>25

acgcagagcaatgcatacttctaaagaaa29

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>26

gtgtctcgtgtgcgaccccat21

<210>27

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>27

gtctcgtgtgcgaccccac19

<210>28

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>28

aagtaggtgtgtggaggcacacttt25

<210>29

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>29

caactccaagtggcagtgaaggt23

<210>30

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>30

aactccaagtggcagtgaaggc22

<210>31

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>31

gaggttaacacttctcaaaccgaggta27

<210>32

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>32

aactaagggctagcagttccaca23

<210>33

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>33

actaagggctagcagttccacg22

<210>34

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>34

ctccttcatggttttcctctcagctt26

<210>35

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>35

atgtattgtcaaatacaaacacgccttaat30

<210>36

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>36

gtattgtcaaatacaaacacgccttaag28

<210>37

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>37

tgcagacgattcatttggactcagtaatt29

<210>38

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>38

ccgacgcattatcttgtatgttgca25

<210>39

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>39

cgacgcattatcttgtatgttgcg24

<210>40

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>40

agggcgtcaaaccagggatgaaata25

<210>41

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>41

agcgagctagagaggaagtgaaat24

<210>42

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>42

gcgagctagagaggaagtgaaac23

<210>43

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>43

tcgctgtccatcattcacctgctt24

<210>44

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>44

ccagattccatagttctgattcttcat27

<210>45

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>45

cagattccatagttctgattcttcag26

<210>46

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>46

ttgccgggtggatgtccggaat22

<210>47

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>47

cgcccaagttcatgtccgcat21

<210>48

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>48

cgcccaagttcatgtccgcag21

<210>49

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>49

cgtccagtaagctgtgaagaaggaa25

<210>50

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>50

gtagtttcaccagctgcctagaaa24

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>51

agtttcaccagctgcctagaag22

<210>52

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>52

ctggaacgagcatagcaaaatcaaactta29

<210>53

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>53

ttataagagagaaatcatttgcagcaagt29

<210>54

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>54

ataagagagaaatcatttgcagcaagc27

<210>55

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>55

cgtccatactcgttcttatgcatacaata29

<210>56

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>56

gttcttgtgctcatgcttgtctact25

<210>57

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>57

cttgtgctcatgcttgtctacg22

<210>58

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>58

ggactacctcggggtggagata22

<210>59

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>59

cgtgagcgcgattaacatatgttcat26

<210>60

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>60

gtgagcgcgattaacatatgttcac25

<210>61

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>61

agccgatcgatctctgtgtcttatattat29

<210>62

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>62

gtatttccgaccaccgcggta21

<210>63

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>63

gtatttccgaccaccgcggtg21

<210>64

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>64

tctgcgagatgcatgctaaggcaaa25