本發(fā)明屬于水產(chǎn)病害微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可同時(shí)檢測(cè)鰻鱺皰疹病毒(eelherpesvirus，ehv)、日本鰻鱺表皮細(xì)胞壞死病毒(japaneseeelendothelialcells-infectingvirus，jeecv)和花鰻鱺多瘤病毒(anguillamarmoratapolyoma-likevirus，ampv)三種dna病毒的多重pcr引物組、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界主要的鰻鱺養(yǎng)殖國(guó)家之一，其產(chǎn)值在我國(guó)的水產(chǎn)品出口貿(mào)易中占有重要地位。養(yǎng)殖的品種主要日本鰻鱺(a.japonica)、歐洲鰻鱺(a.anguilla)、美洲鰻鱺(a.rostrata)、花鰻鱺(a.marmorata)。由于大規(guī)模的集約化養(yǎng)殖，重大病毒性疫病爆發(fā)日益頻繁，造成巨額的經(jīng)濟(jì)損失。明確疾病的的致病病原是有效開(kāi)展疾病防控的重要前提。我們率先在國(guó)內(nèi)建立了多種鰻鱺病毒的檢測(cè)方法，開(kāi)展了相關(guān)病毒的流行病學(xué)調(diào)查。鰻鱺皰疹病毒(eelherpesvirus,ehv)、日本鰻鱺內(nèi)皮細(xì)胞壞死病毒(japaneseeelendothelialcells-infectingvirus,jeecv)和花鰻鱺多瘤病毒(anguillamarmoratapolyoma-likevirus，ampv)同屬于dna病毒，這三種病毒對(duì)鰻鱺的致病性均表現(xiàn)為爛鰓、出血等癥狀，在臨床診斷上難以區(qū)分。我們分別建立了這三種病毒的pcr檢測(cè)方法，分別檢測(cè)耗時(shí)費(fèi)力；同時(shí)，也多次發(fā)現(xiàn)它們有混合感染的情況。

ehv是一種具有囊膜的雙鏈dna病毒，曾給多國(guó)歐洲鰻鱺和日本鰻鱺的養(yǎng)殖業(yè)者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，其也是引起野生歐洲鰻鱺減少的重要因素。我們前期的研究表明，其可在歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、美洲鰻鱺和花鰻鱺上檢出。臨床和病理學(xué)研究表明，ehv可引起“爛鰓”、“脫粘”、“紅頭”等典型癥狀。但現(xiàn)有的pcr檢測(cè)都是根據(jù)ehv的dna聚合酶基因序列設(shè)計(jì)引物，因dna聚合酶基因高度保守，在檢測(cè)時(shí)可能會(huì)檢出鰻鱺虹彩病毒，表現(xiàn)為ehv假陽(yáng)性。

jeecv是一種雙鏈環(huán)狀dna病毒，具有與多瘤病毒的大t抗原基因同源且高度保守的ltlg基因,是日本鰻鱺內(nèi)皮細(xì)胞壞死病(viralendothelialcellnecrosisofeel,vecne)的致病病原。自上世紀(jì)80年代，vecne就經(jīng)常爆發(fā)，給日本鰻鱺的養(yǎng)殖業(yè)者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。其致病的典型癥狀包括鰻鱺的鰭條變紅，腹部膨脹，鰓、肝臟充血等。我們?cè)趪?guó)內(nèi)首次建立了jeecv的pcr檢測(cè)方法，并成功應(yīng)用于疾病的診斷。

ampv與jeecv一樣，具有多瘤病毒的ltlg基因。序列分析表明，我們從患病的花鰻鱺中擴(kuò)增到的序列與中國(guó)臺(tái)灣分離的ampv有較大差異，同源性為94％。ampv可引起花鰻鱺爛鰓、體表出血等典型癥狀。

因此，亟需提供一種檢測(cè)這三種病毒的多重pcr引物組，發(fā)明檢測(cè)試劑盒及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)這三種病毒的同時(shí)檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種方便快捷、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高、且能同時(shí)檢測(cè)鰻鱺皰疹病毒(eelherpesvirus，ehv)、日本鰻鱺表皮細(xì)胞壞死病毒(japaneseeelendothelialcells-infectingvirus，jeecv)和花鰻鱺多瘤病毒(anguillamarmoratapolyoma-likevirus，ampv)的多重pcr檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種在同一pcr反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)ehv，jeecv和ampv的多重pcr引物組及多重pcr檢測(cè)試劑盒，并通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明根據(jù)獲得的的核酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增ehv，jeecv和ampv的特異性引物，避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體，并對(duì)引物擴(kuò)增序列的特異性進(jìn)行分析，獲得由6條核酸序列組成，可同時(shí)對(duì)ehv，jeecv和ampv具有高的擴(kuò)增靈敏性和特異性的引物組，包括：seqidno：1-6；具體的，可以分為由seqidno.1、seqidno.2所示的核苷酸序列組成的用于檢測(cè)ehv的引物組1，由seqidno.3、seqidno.4所示的核苷酸序列組成的用于檢測(cè)jeecv的引物組2和由seqidno.5、seqidno.6所示的核苷酸序列組成的用于檢測(cè)ampv的引物組3組成。

引物對(duì)的特異性檢測(cè)結(jié)果表明，該pcr反應(yīng)體系特異性好。檢測(cè)ehv的引物組1對(duì)錦鯉皰疹病毒(koiherpesvirus，khv)、鰻鱺虹彩病毒(eeliridovirus，eiv)等同源性較近的病毒無(wú)非特異性擴(kuò)增，檢測(cè)jeecv的引物組2對(duì)ampv無(wú)特異性擴(kuò)增，檢測(cè)ampv的引物組3對(duì)jeecv無(wú)特異性擴(kuò)增。

引物對(duì)的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果表明，該多重pcr檢測(cè)方法均可以檢測(cè)最低10個(gè)拷貝的ehv，jeecv和ampv。

ehv，jeecv和ampv多重pcr檢測(cè)試劑盒包括上述6條核酸序列組成的引物組，pcr緩沖液，dntp，taqdna聚合酶，ddh2o及陽(yáng)性對(duì)照dna質(zhì)粒組成。其中，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒為連接pmd19-t載體的ehv，jeecv和ampv的擴(kuò)增序列，濃度均為108拷貝/μl，擴(kuò)增的dna序列如下：

ehv質(zhì)粒pmd19-ehv的插入序列為seqidno.7；

jeecv質(zhì)粒pmd19-jeecv的插入序列為seqidno.8；

ampv質(zhì)粒pmd19-ampv的插入序列為seqidno.9。

用上述檢測(cè)引物組及檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ehv，jeecv和ampv的多重pcr檢測(cè)的方法如下：

制備待測(cè)樣品dna模板

利用組織基因組dna提取試劑盒或病毒基因組dna提取試劑盒提取待檢樣品中的基因組dna。

pcr檢測(cè)

取2μl上述方法中提取的樣品dna作為pcr模板，在冰上配制如下pcr反應(yīng)體系：

置于pcr儀進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：

預(yù)變性：94℃3分鐘；

循環(huán)：94℃變性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，40個(gè)循環(huán)；

延伸：72℃5分鐘；

結(jié)果判定

取10μlpcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳，如果電泳結(jié)果在240bp位置有擴(kuò)增條帶，表示病料中具有ehv；如果電泳結(jié)果在505bp位置有擴(kuò)增條帶，表示病料中具有jeecv；如果電泳結(jié)果在793bp位置有擴(kuò)增條帶，表示病料中具有ampv。如果電泳結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)多條條帶，表示病料中具有與條帶大小對(duì)應(yīng)病毒的混合感染。如果在上述三處位置均無(wú)可見(jiàn)擴(kuò)增條帶，表示病料中無(wú)上述三種病毒。

本發(fā)明還包括引物組在制備同時(shí)檢測(cè)鰻鱺皰疹病毒ehv、日本鰻鱺表皮細(xì)胞壞死病毒jeecv和花鰻鱺多瘤病毒ampv的制品中的應(yīng)用。所述的制品包括用于檢測(cè)三種魚(yú)類病毒的試劑盒、基因探針、基因芯片等。其中，基因探針、基因芯片的制作方法可參考現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明提供的多重pcr檢測(cè)引物組、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可在同一pcr反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)和鑒別ehv，jeecv和ampv，具有操作簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)；而且本發(fā)明可根據(jù)擴(kuò)增長(zhǎng)度的不同直接判定結(jié)果，更高效、實(shí)用。

附圖說(shuō)明

圖1是利用引物組1、引物組2、引物組3進(jìn)行擴(kuò)增特異性鑒定的電泳圖。m：dl2000標(biāo)準(zhǔn)分子量marker；1：ehv；2：khv；3：eiv；4：jeecv；5：ampv；6：ampv；7：jeecv；

圖2是利用引物組和試劑盒鑒定ehv，jeecv，ampv的電泳圖。m：dl2000標(biāo)準(zhǔn)分子量marker；1：ehv；2：jeecv；3：ampv；

圖3是利用引物組和試劑盒鑒定ehv，jeecv，ampv的靈敏度電泳圖。m：dl2000標(biāo)準(zhǔn)分子量marker；1：108copies；2：107copies；3：106copies；4：105copies；5：104copies；6：103copies；7：102copies；8：100copies；9：陰性對(duì)照；

圖4是利用上述引物組和試劑盒鑒定ehv,jeecv，ampv病料的電泳圖。m：dl2000標(biāo)準(zhǔn)分子量marker；1：陽(yáng)性對(duì)照；2：ehv和jeecv混合感染；3：ehv和ampv混合感染；4：ehv；5：jeecv；6：ampv；7：未檢出病料；8：陰性對(duì)照；

具體實(shí)施方式

為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說(shuō)明。

(1)引物的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

細(xì)胞分離、鑒定了8株ehv，克隆了ehvorf8、orf95等6個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框序列，分析其同源性，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了6對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小均設(shè)定在約250bp。以細(xì)胞分離培養(yǎng)的ehvdna為模板，以常規(guī)的pcr方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。篩選出擴(kuò)增效率高的引物組1。

細(xì)胞分離、鑒定了3份jeecv陽(yáng)性病料，克隆了jeecvltlg的開(kāi)放閱讀框序列，分析其同源性，在保守區(qū)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小設(shè)定在約500bp。以jeecv陽(yáng)性病料中提取的基因組dna為模板，以常規(guī)的pcr方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。篩選出擴(kuò)增效率高的引物組2。

細(xì)胞分離、鑒定了5份ampv陽(yáng)性病料，克隆了ampvltlg的開(kāi)放閱讀框序列，分析其同源性，利用軟件primerprimer5.0在保守區(qū)設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小設(shè)定在約750bp。以ampv陽(yáng)性病料中提取的基因組dna為模板，以常規(guī)的pcr方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。篩選出擴(kuò)增效率高的引物組3。

(2)病料中基因組dna的提取

收集鰻鱺疑似病毒性疾病病料，取肝、脾、腎等內(nèi)臟組織，勻漿后用組織dna提取試劑盒提取基因組dna。

(3)多重pcr檢測(cè)的特異性

為檢測(cè)上述引物組擴(kuò)增的特異性，用與ehv同源性較高的khv、eiv為模板檢測(cè)引物組1擴(kuò)增ehv的特異性；因?yàn)閖eecv與ampv的親緣關(guān)系近，且未見(jiàn)其它魚(yú)類多瘤病毒的報(bào)道，因此分別以jeecv和ampv陽(yáng)性病料中提取的基因組dna為模板檢測(cè)引物組2擴(kuò)增jeecv的特異性以及引物組3擴(kuò)增ampv的特異性。結(jié)果表明，檢測(cè)ehv的引物組1僅能特異性擴(kuò)增ehv，不能擴(kuò)增khv、eiv；檢測(cè)jeecv的引物組2僅能特異性擴(kuò)增jeecv，不能擴(kuò)增ampv；檢測(cè)ampv的引物組3僅能特異性擴(kuò)增ampv，不能擴(kuò)增jeecv(如圖1所示)。

(4)多重pcr檢測(cè)方法的建立

將引物組1、引物組2、引物組3按照1：1：1的比例混合，終濃度均為10μm。分別在退火溫度55、60、65條件下進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后通過(guò)擴(kuò)增條件優(yōu)化，建立如下多重pcr檢測(cè)方法：10xpcrbuffer(mg2+plus)5μl、dntp(2.5mmeach)4μl、taqdnapolymerase(5u/μl)0.5μl、引物組2μl、補(bǔ)充ddh2o至50μl。置于pcr儀進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性：94預(yù)變性：94℃3分鐘；循環(huán)：94℃變性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸45秒，40個(gè)循環(huán)；延伸：72℃5分鐘。取10μlpcr產(chǎn)物，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。以本發(fā)明建立的檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)ehv及jeecv、ampv陽(yáng)性病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均可高效檢出相應(yīng)病毒，未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶(如圖2所示)。

(5)多重pcr的靈敏度

分別將用引物組1、引物組2、引物組3擴(kuò)增的ehv、jeecv、ampv序列連接至克隆載體pmd19-t，測(cè)序驗(yàn)證后，測(cè)定dna含量，計(jì)算拷貝數(shù)，然后將三種質(zhì)粒按照拷貝數(shù)1：1：1混合，濃度為108拷貝/μl，作為試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照。將陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行10倍的梯度稀釋，用建立的多重pcr檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法可特異性檢出最低10個(gè)拷貝的ehv、jeecv、ampv(如圖3所示)。

(6)多重pcr檢測(cè)的陽(yáng)性鰻鱺病料

為驗(yàn)證上述多重pcr檢測(cè)方法的有效性，選擇用常規(guī)pcr方法檢測(cè)ehv、jeecv、ampv陽(yáng)性的病料、混合感染病料及未檢出病料，用上述多重pcr檢測(cè)方法對(duì)病料進(jìn)行檢測(cè)，分別檢出ehv、jeecv、ampv陽(yáng)性病料，及ehv和jeecv、ehv和ampv混合感染的陽(yáng)性病料，結(jié)果與用常規(guī)pcr方法檢測(cè)的結(jié)果完全一致(如圖4所示)。

盡管已經(jīng)對(duì)上述各實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例做出另外的變更和修改，所以以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利保護(hù)范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所

<120>同時(shí)檢測(cè)三種魚(yú)類病毒的多重pcr引物組、試劑盒及方法

<130>2017

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