本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來驗(yàn)證化合物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)測試目前為止最為高效和可行的方法。隨著生物技術(shù)在化合物毒理學(xué)安全評價應(yīng)用領(lǐng)域和市場需求量的不斷擴(kuò)大，提高動物細(xì)胞培養(yǎng)和毒理學(xué)試驗(yàn)、延長維持時間以獲得可靠結(jié)果，成為優(yōu)化動物細(xì)胞培養(yǎng)過程和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心。眾所周知，動物細(xì)胞培養(yǎng)及毒理學(xué)試驗(yàn)的效果的經(jīng)濟(jì)性和效率起決定性作用的是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的優(yōu)化是建立高效的動物細(xì)胞培養(yǎng)和毒理學(xué)試驗(yàn)過程的核心環(huán)節(jié)。因此，根據(jù)細(xì)胞在生長、代謝和毒理學(xué)試驗(yàn)表達(dá)過程中的營養(yǎng)需求，設(shè)計動物細(xì)胞培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的成分、含量和配比是工作的重要內(nèi)容。國內(nèi)外許多商業(yè)化的培養(yǎng)基—般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清或替代物組成，顯著影響細(xì)胞生長、代謝和毒理試驗(yàn)現(xiàn)象表達(dá)這些培養(yǎng)基—般僅能確保細(xì)胞的穩(wěn)定傳代，并不能較好地支持細(xì)胞生長和毒理試驗(yàn)效果的表達(dá)，因而阻礙了細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的普及和應(yīng)用。中國專利申請cn102311938a公開了一種用于肝細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述添加組分包括：胰島素0.1～10μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白0.5～10μg/ml、亞硒酸鈉5～10μg/l、表皮生長因子1～100ng/ml、肝細(xì)胞生長因子1～100ng/ml、纖粘連蛋白0.1～1μg/ml、地塞米松0.1～10nmol/ml和胰高血糖素0.05～5μg/ml。中國專利申請cn105087465a公開了一種肝細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其包括以下組分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml；絲膠蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/ml；肝細(xì)胞生長因子5～20ng/ml；表皮生長因子10～50ng/ml；青鏈霉素100u/ml，這些用于肝細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，但是，存在價格昂貴，不利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及肝細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)等問題。市售的商業(yè)無血清培養(yǎng)基在血清替代方面多具有良好的表現(xiàn)，但在支持細(xì)胞培養(yǎng)和高效表達(dá)毒理學(xué)效果方面仍有諸多缺陷。因此，在進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)時，多數(shù)無血清培養(yǎng)基難以充分、平衡地向細(xì)胞提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基利用率很低，造成極大的浪費(fèi)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基它不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長，還能夠促進(jìn)白蛋白的合成，長時間維持細(xì)胞活力。為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇2～10mg/l，煙酰胺30～100μg/l，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.1～0.8mg/l，過氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸2～7μg/l，肌醇10～60μg/l，雷帕霉素3～12μg/l，氯化膽堿7.2～11.8mg/l，葉酸3～9μg/l，黃體酮0.2～1.6mg/l，微量元素5～23μg/l，細(xì)胞生長因子20-35μg/l，氨基酸1～30mg/l。優(yōu)選的，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇5～8mg/l，煙酰胺42～81μg/l，硫酸軟骨素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.3～0.6mg/l，過氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸3～6μg/l，肌醇25～42μg/l，雷帕霉素5～8μg/l，氯化膽堿8.5～10.2mg/l，葉酸4～7μg/l，黃體酮0.7～1.3mg/l，微量元素5～23μg/l，細(xì)胞生長因子20-35μg/l，氨基酸5～18mg/l。本發(fā)明提供的培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供肝細(xì)胞的生存和最低的生理活動。膽固醇作為一種脂類，參與形成細(xì)胞膜，過氧化氫酶能夠清除自由基，保護(hù)肝細(xì)胞免受超氧自由基損害等，胰島素可通過作用于肝細(xì)胞表面的胰島素受體，增強(qiáng)肝細(xì)胞對能源的攝入和利用，同時促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)的rna、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞的活力與功能。硫酸軟骨素能增加細(xì)胞的信使核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成以及具有促進(jìn)細(xì)胞代謝的作用，與其他原料配合使用，能夠達(dá)到更好的提高肝細(xì)胞的增殖倍數(shù)和細(xì)胞活率的效果。本發(fā)明對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類沒有特殊的要求，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員所常知，例如，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為f12或rmpi1640培養(yǎng)基。細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，以及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的功能。優(yōu)選的，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子組成，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子的重量比為1:(1.2～3.6)。優(yōu)選的，本發(fā)明的培養(yǎng)基中還含有微量元素，所述微量元素為微量金屬元素和/或維生素，所述微量金屬元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣中的至少一種。優(yōu)選的，所述維生素為維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1、維生素b2、維生素b5、維生素b6、維生素b12、維生素b13、維生素b15、對氨基苯甲酸中的至少一種。氨基酸是維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)元素之一，優(yōu)選的，本發(fā)明的培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中還含有氨基酸，所述所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸、l-異亮氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-酪氨酸、l-賴氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-色氨酸、l-纈氨酸、l-天冬氨酸和l-天冬酰胺中的至少一種優(yōu)選的，所述抗生素為鏈霉素和/或青霉素。一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至6.7-7.3，在3～8℃下攪拌2～5h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用微米濾膜過濾，除菌后，即得。優(yōu)選的，所述微米膜為孔徑為0.1～0.3微米的濾膜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：本發(fā)明的培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，干細(xì)胞生長良好，細(xì)胞形態(tài)、密度與含有血清的培養(yǎng)基相當(dāng)，且細(xì)胞功能和活力明顯優(yōu)于含血清培養(yǎng)基，克服了傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基的缺陷；本發(fā)明培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基搭配合理，各成分間協(xié)同作用，能提供細(xì)胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長，還能夠促進(jìn)白蛋白的合成，長時間維持細(xì)胞活力。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇7mg/l，煙酰胺63μg/l，硫酸軟骨素0.3mg/l，抗生素鏈霉素14μm，胰島素0.4mg/l，過氧化氫酶13mg/l，全反式維甲酸4μg/l，肌醇32μg/l，雷帕霉素6μg/l，氯化膽堿9.2mg/l，葉酸5μg/l，黃體酮0.9mg/l，微量元素15μg/l，細(xì)胞生長因子28μg/l，氨基酸12mg/l；所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子組成，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子的重量比為1:2；所述微量元素為鐵、銅、鋅；所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素鏈霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7.0，在5℃下攪拌4h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.2微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實(shí)施例2本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇5mg/l，煙酰胺42μg/l，硫酸軟骨素0.2mg/l，抗生素青霉素13μm，胰島素0.3mg/l，過氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸3μg/l，肌醇25μg/l，雷帕霉素5μg/l，氯化膽堿8.5mg/l，葉酸4μg/l，黃體酮0.7mg/l，微量元素5μg/l，細(xì)胞生長因子20μg/l，氨基酸5mg/l；所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子組成，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子的重量比為1:1.2；所述微量元素為微量金屬元素，所述微量金屬元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻；所述氨基酸為l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素青霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至6.7，在3℃下攪拌2h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.1微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實(shí)施例3本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基rmpi1640培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇8mg/l，煙酰胺81μg/l，硫酸軟骨素0.5mg/l，抗生素鏈霉素16μm，胰島素0.6mg/l，過氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸6μg/l，肌醇42μg/l，雷帕霉素8μg/l，氯化膽堿10.2mg/l，葉酸7μg/l，黃體酮1.3mg/l，微量元素23μg/l，細(xì)胞生長因子35μg/l，氨基酸18mg/l；所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子組成，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子的重量比為1:3.6；所述微量元素為維生素a、維生素d、維生素e；所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素鏈霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7.3，在8℃下攪拌5h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.3微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實(shí)施例4本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇2mg/l，煙酰胺30μg/l，硫酸軟骨素0.2mg/l，抗生素青霉素13μm，胰島素0.1mg/l，過氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸2μg/l，肌醇10μg/l，雷帕霉素3μg/l，氯化膽堿7.2mg/l，葉酸3μg/l，黃體酮0.2mg/l，微量元素5μg/l，細(xì)胞生長因子20μg/l，氨基酸1mg/l；所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子組成，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子的重量比為1:1.2；所述微量元素為硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣、甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸、l-異亮氨酸、l-絲氨酸；。本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素青霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7，在5℃下攪拌3h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.2微米的濾膜過濾，除菌后，即得。實(shí)施例5本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基f12培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：膽固醇10mg/l，煙酰胺100μg/l，硫酸軟骨素0.5mg/l，抗生素青霉素16μm，胰島素0.8mg/l，過氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸7μg/l，肌醇60μg/l，雷帕霉素12μg/l，氯化膽堿11.8mg/l，葉酸9μg/l，黃體酮1.6mg/l，微量元素23μg/l，細(xì)胞生長因子35μg/l，氨基酸30mg/l；所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子組成，所述細(xì)胞生長因子由表皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子的重量比為1:2.4；所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、維生素a、維生素d、維生素e；所述氨基酸為甘氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-組氨酸、l-亮氨酸；本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)肝細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入膽固醇，煙酰胺，硫酸軟骨素，抗生素青霉素，胰島素，過氧化氫酶，全反式維甲酸，肌醇，雷帕霉素，氯化膽堿，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長因子，氨基酸，混合均勻，得到混合體系1；(2)將步驟(1)的混合體系調(diào)節(jié)ph至7，在3℃下攪拌2h；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用孔徑為0.1微米的濾膜過濾，除菌后，即得。1、實(shí)驗(yàn)方法(1)將新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞，分別用實(shí)施例1～5的無血清培養(yǎng)基和含10％(v/v)胎牛血清(fbs)的william’s-e培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106cells/ml，然后加入20ml細(xì)胞懸液到40ml搖動培養(yǎng)玻璃皿中，置于搖動搖床上，速度為10cpm，在培養(yǎng)24小時，48小時和72小時取樣，分析大鼠肝細(xì)胞功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。表1：原代大鼠細(xì)胞成干細(xì)胞球比例(細(xì)胞濃度5×106cells/ml)成球率％(直徑>60微米)24h48h72h實(shí)施例174.5±2.679±3.387.5±0.2實(shí)施例269.2±1.177±3.486.4±0.2實(shí)施例368.2±3.069.5±1.284.5±0.6實(shí)施例468.5±2.169.2±0.279.3±0.2實(shí)施例567.5±3.568±0.377.3±0.6含血清53.2±3.969.4±0.265.2±0.6本發(fā)明無血清培養(yǎng)基可以支持肝細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)，密度在5×106cells/ml×107cells/ml之間時，成球率高于60％，與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)效果相當(dāng)。綜上，本發(fā)明提供的無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確且成本低廉，不含動物來源成分，能夠支持肝細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)生長，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)含血清培養(yǎng)基和現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的無血清培養(yǎng)基，可用于細(xì)胞移植、組織工程肝臟和生物人工肝支持系統(tǒng)治療，具有良好的市場應(yīng)用前景。上述描述僅是對本發(fā)明部分實(shí)施例的描述，并非對本發(fā)明范圍的任何限定，本行業(yè)的普通技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明對上述實(shí)施例做出改進(jìn)或修改，但均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12