本發(fā)明屬于細(xì)菌遺傳改造技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌高效遺傳重組方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自然轉(zhuǎn)化(naturaltransformation)技術(shù)構(gòu)建基因缺失株，是于2010成功應(yīng)用于霍亂弧菌的基因編輯，并隨后不斷的予以完善。該方法的理論基礎(chǔ)是基于細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化(naturaltransformation)原理，弧菌營(yíng)養(yǎng)饑餓條件下通過幾丁質(zhì)誘導(dǎo)可成為自然感受態(tài)攝取外源dna，當(dāng)外源dna與自身靶基因同源時(shí)可與細(xì)菌靶基因發(fā)生同源重組交換。但該技術(shù)還未在擬態(tài)弧菌上應(yīng)用成功?；蛉笔У姆椒ㄟ€包括：自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的基因重組技術(shù)和λ-red重組技術(shù)。自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的基因重組技術(shù)如下：1、通過含有抗性基因和靶基因同源的自殺質(zhì)粒；2、通過結(jié)合轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)化的方式將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入打靶菌株，自殺質(zhì)粒的同源部分會(huì)與細(xì)菌靶基因發(fā)生同源重組交換；3、通過抗生素平板對(duì)陽性缺失株進(jìn)行篩選。該技術(shù)實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，重組效率低下。

λ-red重組技術(shù)如下：1、電轉(zhuǎn)化將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入目的菌株，加入l-阿拉伯糖培養(yǎng)(pkd46質(zhì)?？赏ㄟ^l-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)exo、beta和gam蛋白，gam蛋白可抑制核酸酶降解打靶dna，exo和beta蛋白介導(dǎo)打靶dna發(fā)生同源重組)；2、電擊轉(zhuǎn)化打靶dna；3、通過抗生素平板對(duì)陽性缺失株進(jìn)行篩選；λ-red重組技術(shù)基于大腸桿菌λ噬菌體開發(fā)的基因敲除技術(shù)，較為廣泛的應(yīng)用于大腸桿菌或與大腸桿菌親緣性相近的物種；擬態(tài)弧菌由于與大腸桿菌親緣性較遠(yuǎn)將導(dǎo)致敲除效率低下；且操作繁瑣。

現(xiàn)已能通過λ-red重組技術(shù)構(gòu)建擬態(tài)弧菌的基因缺失，但是其缺點(diǎn)如下：第一、λ-red重組技術(shù)基于大腸桿菌λ噬菌體開發(fā)的基因敲除技術(shù)，較為廣泛的應(yīng)用于大腸桿菌或與大腸桿菌親緣性相近的物種；擬態(tài)弧菌由于與大腸桿菌親緣性較遠(yuǎn)將導(dǎo)致敲除效率低下；第二、需通過兩次電轉(zhuǎn)將pkd46質(zhì)粒和打靶dna轉(zhuǎn)化至目的菌株，操作過程繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問題，提供了一種基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌高效遺傳重組方法及應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌高效遺傳重組方法，包括以下步驟：

1)以擬態(tài)弧菌sccf01株基因組為模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物對(duì)擴(kuò)增目的基因上臂序列和下臂序列；以pkd4質(zhì)粒為模板，使用kan引物對(duì)擴(kuò)增卡那霉素抗性基因片段；

2)將擴(kuò)增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段進(jìn)行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合pcr產(chǎn)物；

3)將步驟2)獲得融合pcr產(chǎn)物與受體擬態(tài)弧菌sccf01株進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，經(jīng)過對(duì)抗性標(biāo)記基因的篩選，獲得擬態(tài)弧菌sccf01株的缺失株。

進(jìn)一步地，步驟1)中的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系均為：buffer10μl，dntpmixture4μl，10μm特異性的引物對(duì)上、下游引物各1μl，模板1μl，2.5u/μldnapolymerase0.5μl，ddh2o32.5ul。

進(jìn)一步地，步驟1)中的pcr擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35個(gè)循環(huán)72℃延伸10min。

進(jìn)一步地，所述目的基因?yàn)閠lh基因，其對(duì)應(yīng)的目的基因上臂和目的基因下臂引物對(duì)分別是tlh-up和tlh-down引物對(duì)，所述tlh-up引物對(duì)包括tlh-up-f和tlh-up-r，其核苷酸序列分別為seqidno.1和seqidno.2所示；所述tlh-down引物對(duì)包括tlh-down-f和tlh-down-r，其核苷酸序列分別為seqidno.3和seqidno.4所示；所述kan引物對(duì)包括kan-f和kan-r，其核苷酸序列分別為seqidno.5和seqidno.6所示。

進(jìn)一步地，步驟2)中的融合具體為：

第一步pcr反應(yīng)體系：buffer5μl，dntpmixture2μl，模板各1μl，模板包括卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段膠回收產(chǎn)物，2.5u/μldnapolymerase0.25μl，ddh2o16ul；pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

第二步pcr反應(yīng)體系buffer10μl，dntpmixture4μl，10μm目的基因上臂序列上游引物和目的基因下臂序列下游引物各1μl，模板1μl，模板為第一步反應(yīng)pcr產(chǎn)物，2.5u/μldnapolymerase0.5μl，ddh2o7.5ul；pcr擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39個(gè)循環(huán)72℃延伸10min。

進(jìn)一步地，步驟3)中的自然轉(zhuǎn)化具體為：

3.1)將保存于-80℃的擬態(tài)弧菌sccf01株復(fù)蘇于lb培養(yǎng)基或者接種于tcbs瓊脂培養(yǎng)基，含30℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于10mllb液體培養(yǎng)基，在30℃條件下180r/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.4，將5ml菌液8000×g離心5min，棄上清后使用1ml滅菌無葡萄糖m9培養(yǎng)液洗滌一次后，再用1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液重懸，其中，無葡萄糖m9培養(yǎng)液中加入32mmmgso4和5mmcacl2；

3.2)向重懸菌加入80mg高溫滅菌后的幾丁質(zhì)，30℃孵育24h；

3.3)輕輕吸去孵育后的上清，重新加入1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液重懸和dna總量大于500ng的重組片段pcr產(chǎn)物，30℃孵育24h，其中，無葡萄糖m9培養(yǎng)液中加入32mmmgso4和5mmcacl2；

3.4)將孵育后的細(xì)菌渦旋振蕩20s，吸取100μl菌液涂于lb+kan平板上篩選缺失株。

本發(fā)明還提供一種上述的基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌高效遺傳重組方法在構(gòu)建擬態(tài)弧菌缺失株中應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明操作過程相較于自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的基因重組技術(shù)和λ-red重組技術(shù)，無需電轉(zhuǎn)質(zhì)?；虼虬衐na，操作簡(jiǎn)單。

2)本發(fā)明重組效率高，減少通過抗生素平板對(duì)陽性缺失株進(jìn)行篩選的工作量。

3)該技術(shù)方案敲除基因僅需要3天就可完成，縮短研究周期。

4)本發(fā)明可用于研究擬態(tài)弧菌基因功能以及開發(fā)擬態(tài)弧菌基因缺失疫苗。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明融合pcr反應(yīng)；

圖2是本發(fā)明自然轉(zhuǎn)化流程示意圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中卡那霉素基因檢測(cè)和tlh基因檢測(cè)；其中，a表示卡那霉素基因檢測(cè)，1代表陽性對(duì)照，2代表△tlh-sccf01，3代表wt-sccf01，4代表陰性對(duì)照，m為mark標(biāo)記；b表示tlh基因檢測(cè)；1代表△tlh-sccf01，2代表wt-sccf01，3代表陰性對(duì)照；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中tonb1基因檢測(cè)和exbb1-exbd1基因檢測(cè)；其中，a為tonb1基因檢測(cè)，1代表△tonb1，2代表wt-sccf01，3代表陰性對(duì)照，m為mark標(biāo)記；b為exbb1-exbd1基因檢測(cè)，1代表△exbb1-exbd1，2代表wt-sccf01，3代表陰性對(duì)照，m為mark標(biāo)記；c為tonb1基因檢測(cè)(1～3泳道)和exbb1-exbd1基因檢測(cè)(4～6泳道)：1代表△exbb1-exbd1-tonb1，2代表wt-sccf01，3代表陰性對(duì)照；4代表△exbb1-exbd1-tonb1，5代表wt-sccf01，6代表陰性對(duì)照，m為mark標(biāo)記；

圖5是本發(fā)明卡那霉素基因檢測(cè)；其中，1代表△tonb1，2代表△exbb1-exbd1，3代表△exbb1-exbd1-tonb1，4代表wt-sccf01，5代表陰性對(duì)照，m為mark標(biāo)記。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1

步驟1、打靶片段的構(gòu)建：使用細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(dp302)提取擬態(tài)弧菌sccf01株基因組(保藏于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)系，編號(hào)：cvm2013034)，以sccf01株基因組為模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物對(duì)擴(kuò)增目的基因上臂序列和下臂序列，pkd4質(zhì)粒為模板，使用kan引物對(duì)擴(kuò)增卡那霉素抗性基因片段，進(jìn)行重疊pcr擴(kuò)增；

三個(gè)dna片段pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系均為：buffer10μl，dntpmixture4μl，上下游引物(10μm)各1μl，模板1μl，dnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o32.5ul；pcr擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35個(gè)循環(huán)72℃延伸10min，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。淮笮◎?yàn)證正確后使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

步驟2、將擴(kuò)增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上游和下游同源臂進(jìn)行融合；

融合三個(gè)片段分兩步進(jìn)行，第一步pcr反應(yīng)體系：buffer5μl，dntpmixture2μl，模板(上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段膠回收產(chǎn)物)各1μl，dnapolymerase(2.5u/μl)0.25μl，ddh2o16ul；pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。第二步pcr反應(yīng)體系buffer10μl，dntpmixture4μl，引物(tlh-up-f和tlh-down-r10μm)各1μl，模板(第一步反應(yīng)pcr產(chǎn)物)1μl，dnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o7.5ul；pcr擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39個(gè)循環(huán)72℃延伸10min，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。大小驗(yàn)證正確后使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，膠回收產(chǎn)物使用nanodrop2000測(cè)定dna濃度，得到含有卡那霉素抗性基因片段、tlh上游和下游同源臂片段的融合pcr產(chǎn)物。

步驟3、自然轉(zhuǎn)化

步驟3.1、將保存于-80℃的擬態(tài)弧菌sccf01株復(fù)蘇于lb培養(yǎng)基或者接種于tcbs瓊脂培養(yǎng)基，含30℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于10mllb液體培養(yǎng)基，在30℃條件下180r/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.4，將5ml菌液8000×g離心5min，棄上清后使用1ml滅菌無葡萄糖m9培養(yǎng)液洗滌一次后，再用1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液(添加32mmmgso4和5mmcacl2)重懸；

步驟3.2、向重懸菌加入80mg高溫滅菌后的幾丁質(zhì)，30℃孵育24h；

步驟3.3、輕輕吸去孵育后的上清，重新加入1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液(添加32mmmgso4和5mmcacl2)重懸和dna總量大于500ng的打靶片段(重新?lián)Q液是為了防止孵育過程中細(xì)菌產(chǎn)生核酸酶降解打靶片段)，30℃孵育24h；

步驟3.4、將孵育后的細(xì)菌渦旋振蕩20s，吸取100μl菌液涂于lb+kan平板上篩選缺失株。

步驟4、缺失株特異性pcr鑒定：挑取傳代后具有卡那霉素抗性的菌落，于10mllb液體培養(yǎng)基，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜后提取基因組為模板，分別使用2對(duì)引物進(jìn)行pcr反應(yīng)鑒定缺失株，該2對(duì)引物分別為目的基因上下游引物和kan上下游引物。采用目的基因上下游引物鑒定sccf01株的目的基因是否完全通過同源重組缺失，判定結(jié)果wt-sccf01株為陽性，△目的基因-sccf01為陰性；kan-f、r引物(kan上下游引物)鑒定卡那霉素抗性基因是否重組整合進(jìn)入sccf01基因組，判定結(jié)果：wt-sccf01株為陰性，△目的基因-sccf01為陽性。

pcr反應(yīng)體系：12.5μlmix-reactionbuffer，上下游引物各1μl(10μmol/l)，模板1μl，8.5μlddh2o。pcr擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。

其中，1、用于融合pcr使用的dna聚合酶應(yīng)選擇高保真酶，原因：普通pcr使用的酶為taq酶，該酶易產(chǎn)生錯(cuò)配堿基，同時(shí)會(huì)在末端添加a堿基，將影響三段pcr融合。

2、幾丁質(zhì)是擬態(tài)弧菌形成自然感受態(tài)的關(guān)鍵試劑，因此幾丁質(zhì)應(yīng)選擇正確，購買的幾丁質(zhì)應(yīng)成片狀不溶于水。

3、配置m9培養(yǎng)液應(yīng)避免營(yíng)養(yǎng)成分，原因：擬態(tài)弧菌形成自然感受態(tài)重要必要條件是在饑餓狀態(tài)。

4、用于制備自然轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌的od600的取值范圍：0.3～0.5，該時(shí)期細(xì)菌生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新陳代謝活躍，更易于形成自然感受態(tài)；

5、用于孵育的無葡萄糖m9培養(yǎng)液中mgso4和cacl2的濃度分別為32mm和5mm，在該濃度條件下自然轉(zhuǎn)化率最高。

實(shí)施例2以tlh為目的基因的遺傳重組方法

1、打靶片段的構(gòu)建

使用細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(dp302)提取擬態(tài)弧菌sccf01株基因組(保藏于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)系，編號(hào)：cvm2013034)，以sccf01株基因組為模板，使用tlh-up-f、r和tlh-down-f、r(表1)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增tlh上游和下游同源臂(核苷酸序列分別如seqidno.1和seqidno.2所示)；以pkd4質(zhì)粒為模板，使用kan-f、r引物(表1)擴(kuò)增卡那霉素抗性基因片段(核苷酸序列如seqidno.3所示)。三個(gè)dna片段pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系均為：buffer10μl，dntpmixture4μl，上下游引物(10μm)各1μl，模板1μl，dnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o32.5ul；pcr擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35個(gè)循環(huán)72℃延伸10min，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。大小驗(yàn)證正確后使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

表1引物列表

注：引物序列小寫字母表示與pkd4質(zhì)粒同源。

融合三個(gè)片段分兩步進(jìn)行，如圖1所示，第一步pcr反應(yīng)體系：buffer5μl，dntpmixture2μl，模板(上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因片段膠回收產(chǎn)物)各1μl，dnapolymerase(2.5u/μl)0.25μl，ddh2o16ul；pcr反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。第二步pcr反應(yīng)體系buffer10μl，dntpmixture4μl，引物(tlh-up-f和tlh-down-r10μm)各1μl，模板(第一步反應(yīng)pcr產(chǎn)物)1μl，dnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，ddh2o7.5ul；pcr擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39個(gè)循環(huán)72℃延伸10min，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。大小驗(yàn)證正確后使用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，膠回收產(chǎn)物使用nanodrop2000測(cè)定dna濃度，得到打靶片段，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

2、自然轉(zhuǎn)化

如圖2所示，(1)將保存于-80℃的擬態(tài)弧菌sccf01株復(fù)蘇于lb培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于10mllb液體培養(yǎng)基，在30℃條件下180r/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.4，將5ml菌液8000×g離心5min，棄上清后使用1ml滅菌無葡萄糖m9培養(yǎng)液洗滌一次后，再用1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液(添加32mmmgso4和5mmcacl2)重懸；(2)向重懸菌加入80mg高溫滅菌后的幾丁質(zhì)，30℃孵育24h；(3)輕輕吸去孵育后的上清，重新加入1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液(添加32mmmgso4和5mmcacl2)重懸和dna總量大于500ng的打靶片段(重組片段pcr產(chǎn)物)，重新?lián)Q液是為了防止孵育過程中細(xì)菌產(chǎn)生核酸酶降解打靶片段，30℃孵育24h；(4)將孵育后的細(xì)菌渦旋振蕩20s，吸取100μl菌液涂于lb+kan平板上篩選缺失株。

3、缺失株特異性pcr鑒定

挑取傳代后具有卡那霉素抗性的菌落，于10mllb液體培養(yǎng)基，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜后提取基因組為模板，分別使用2對(duì)引物進(jìn)行pcr反應(yīng)鑒定缺失株。tlh-f、r鑒定sccf01株的tlh基因是否完全通過同源重組缺失，判定結(jié)果wt-sccf01株為陽性，△tlh-sccf01為陰性；kan-f、r引物鑒定卡那霉素抗性基因是否重組整合進(jìn)入sccf01基因組，判定結(jié)果：wt-sccf01株為陰性，△tlh-sccf為陽性。

pcr反應(yīng)體系：12.5μlmix-reactionbuffer，上下游引物各1μl(10μmol/l)，模板1μl，8.5μlddh2o。pcr擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。

缺失株特異性pcr鑒定顯示(圖3)，從圖中可以看到，構(gòu)建的缺失株不能擴(kuò)增出tlh基因，而野生菌株則能；構(gòu)建的缺失株能擴(kuò)增出卡那霉素基因條帶，而野生菌株則不能；證明卡那霉素基因成功將tlh基因替換，突變體構(gòu)建成功。

實(shí)施例3擬態(tài)弧菌遺傳重組方法可靠性的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步確認(rèn)遺傳重組方法的可靠性，本研究進(jìn)一步構(gòu)建tonb1單基因、exbb1-exbd1雙基因缺失和exbb1-exbd1-tonb1三個(gè)基因缺失的缺失株(擴(kuò)增引物見表2)；按照實(shí)施例1的方法，首先用特異性的引物擴(kuò)增目的基因上臂序列和下臂序列，同時(shí)擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)卡那霉素抗性基因，再以上述三個(gè)片段作為模板，進(jìn)行重疊pcr擴(kuò)增。所獲得pcr產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收純化后按照步驟3)方法進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化。自然轉(zhuǎn)化方法：

a)將受體菌接種于tcbs瓊脂培養(yǎng)基，含30℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于10mllb液體培養(yǎng)基，在30℃條件下180r/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.4，將5ml菌液8000×g離心5min，棄上清后使用1ml滅菌無葡萄糖m9培養(yǎng)液洗滌一次后，再用1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液重懸(添加32mmmgso4和5mmcacl2)；

b)向重懸菌加入80mg高溫滅菌后的幾丁質(zhì)，30℃孵育24h；

c)輕輕吸去孵育后的上清，重新加入1ml無葡萄糖m9培養(yǎng)液重懸(添加32mmmgso4和5mmcacl2)和dna總量大于500ng的重組片段pcr產(chǎn)物，30℃孵育24h；

d)將孵育后的細(xì)菌渦旋振蕩20s，吸取100μl菌液涂于lb+kan平板上篩選缺失株。

通過卡那霉素抗性平板篩選的菌株，利用pcr對(duì)缺失的目標(biāo)基因和卡那霉素基因進(jìn)行檢測(cè)(圖4和圖5)，從圖中可以看到，相應(yīng)缺失株均不能擴(kuò)增出缺失的目標(biāo)基因，而野生菌株則能；且相應(yīng)缺失株均能擴(kuò)增出卡那霉素基因條帶，而野生菌株則不能；證明卡那霉素基因成功將缺失的目標(biāo)基因替換，突變體構(gòu)建成功。

表2構(gòu)建打靶dna引物列表

表3pcr檢測(cè)表

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種基于自然轉(zhuǎn)化的擬態(tài)弧菌高效遺傳重組方法及應(yīng)用

<130>2017

<160>30

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2114

<212>dna

<213>tlh-up

<400>1

atcggtgctccccgtctctttcggtgacgctttgtaaattacatccatttttggcacaaa60

actggcgtaactcagcgggctgatgcggttcacatcaacaggatacgtttccacccacaa120

tgcatccgttgaacggttgagcagagattcagccgttgcgtactgctggcggttccagat180

aaagctaacgttttgcgcatttttcgcactccgttcgatgcggtaatcttgcgtgttgta240

ggtcagccaacggctttgtgtgtagctggcttttgcttccaacttagctttcgggccgtt300

tttatctgcttcgacaccccccgttacgccaagctcaaagccagagacttctttacgctc360

aaagttcgcgttgacgttagtgaccgggaaagtctttagaatctgcgctttatcattcga420

agcgttgaagctgaaacgataatcctgcgctatcgcatctgttgaccattcacggaaata480

agcatccaaagtaacgtacccagccttaacttggcggtttccgagttggtcattgagatg540

aatacccgcgccagtgctgtcgtcatctaagctgatacgcacaattttggcatccggcgt600

tgccgaacccacaatgccatactgcaatgaacgctctaagttcacacggtaaatcaatga660

gatattggcatctttacaaaatggacgactgcctttgtcatttttccatagccaagaatt720

ggcgaaagtacactcttcatcgctgattgaacgattgacgttgatgtaaaaagcaacgtg780

cggcaacgtgttcgtttcattgttgttagtgacattattggcagacactgagcgacgtga840

ccgactcaacacacgctcagaacgtggggcttccagcagtgttggatccacatcctccgc900

acgatcaaacggtgtaaacagcagctcacctttatgctcagtgattacgatgaatgtatt960

agcaaacccaacaccataggtttttctaaatttcacctgcatttcggttaggcgatcagg1020

gtcagagatctgactgaaatcgaccaagatacgcaactgctggttaatcacctgctcacg1080

cagctcagctaaactgggtaattggctttcttctgattgccaatctgcagcgttgtaata1140

ttttattgcgtggttatccgcgacttggctaataatttcaacagcttcaccaacgggatc1200

actgatattcgcgaacacagtatgactagatattgcgctgaatatcgttaggattgcgat1260

tgcacaacgattgagttttggcatataaacctcactgattcagttatttttagtgttatt1320

agaagagagattttcaaacaaagtgaattaactcgaaccactgaaagaacagactagtgg1380

gaatttcattcatcactacgcacataattaagcgttatgctttaagaggataaatttaac1440

caacaccactgcaggttcaaatcatcgagcaaacccagtttgaatgcttctcgtgggtta1500

ccgtcgtcatccttgatgttgtgtggcttggggcagaactacggcttaacacataccctt1560

ttgacagaatattcaacttcttttatttgaaagaatacgtttatattctctgccaccaca1620

cttattggaatatccctaaacatgccaaaagtaaatagttgtaacggaaaatagtaacag1680

gagatcacaaattcacgcttgaaaacttattatttggcgagaattaatccttcacacaac1740

tattaattcccaatttattttttggatatttacattattcattcgcactaatttaatttg1800

aactaaattagattgaattaaatagataaaaatagaaattcattaagtgattaactttca1860

atcattaaatatcacttaagtccattcatatgaaaaataaagatcaattatgaacagaat1920

aataggagagtttatacacaaggttgatcttacttccaacctgagtaatgacagagcact1980

tctcattgacgagacaaatgtctcattcacaatacaaaagagatctgaccagatctgcag2040

tgtgtattttcaaccaataagaagaaaacgatgaaaacaagactctctctactagtgtag2100

gctggagctgcttc2114

<210>2

<211>2086

<212>dna

<213>tlh-down

<400>2

ttcatatggaccatggctaataagtacgtgatgtaagcttgaggataggatgagctccta60

tcctcaacaccacgtatttgcacaagaatttttgctttatcgccattctgttcatagcct120

taaagaaaagggaaagatggcacatttgagatgacaaaatcgaatcactctcctgctttc180

accggctcagaattgctgaatctctactatcagcgtcgggtgtcgctctttattgccttt240

atttccagtttgacctttttccctctggcaatcaaaaacctgctgattggacaaattctg300

cttggcggtttaatcattgtgtttcaatgctcattactgtttgaaatagccgccatctac360

taccagaagaaaacgccgtggggatttcggctaccactctctttggtggtgatcattgtc420

gtgctggccatccatatttttggcactcttgccagttactggctcttccctgtcatcatc480

gccattgcgttcttgcttccgccgaaagataatttattcactatcttcattatcattccc540

gcaagcatatgggcgctcatcccacatcaaacctctgaggtgactttgcgttttagtcta600

gcgatcagcgccagtgccgccattatgtatgtggttgtcgacgctctgcgtaaattgcac660

gcagagctgttttatctctccactcgtgatgctttaacaggcacactcaaccgccatcag720

ctcgatagttttttacgcaagagcatccggcgcagccagtttgcgaatgagttttcggtg780

attgcagtgatcgacattgataatttcaaaaccatcaatgatatgtacggccatgacacg840

ggagataaggtaataactcaagtggtcgagatcattaatacaaacagtcgggagttagat900

ttgctctttcgattaggaggagatgagtttctattactctttgaaaatacctcattaacg960

gaagccactatggtgatgagccacataggctgtcgggtacaaaaaacacactatcctaaa1020

catgcggaagtgaccgtcagtgtggggttagcggaggtactcaaaaacgacgatccggag1080

gtatggtttaaacgtgccgacctttctctgtatcactccaaaaaaatgggtaaaaaccgg1140

gtatgttcagacgaaaaacatgtgattgagctaaacactcaacagtgtgattctctcttg1200

aattcgcatggtcatcgttgattgatcatgacgatttgcgcaagttgagggagtaagatt1260

ccgataccgaacaagacgccttgccatttcacctgttttaaagcgagcaaaacaggtgcc1320

ataaaaaacagcacaaccaacacgggcagtaaattgacgccccctaaactcccaagcaac1380

agggaaaacagaataagtcccgccaggatccaataattcagccttagcttgaaaccaagc1440

aagccaacaaaaagcagcggagcgataagtgacagcatattaagtaacatcttctttgtt1500

tgtgatattgattctcatttaatacatcatagtccgctctgggtttaggttcaagtcaca1560

aaccacccaaaataatcattagaaaaaataatccaatctatagatttttatcgtgaacaa1620

tacatcaggaatctgttgatagataaggctatcggcaataacatctcgcgccgagagaga1680

tgctcttctcaattttttcattagctgattttaataagatattgtttttatctggagata1740

acgatgtctgcctcgctttctgtagcaaaattgaccttttttatcgctatcttggctgcg1800

gtcggccaagcgacacaaaccatgtacgtgccttctatcggttacatggcgcaagaattt1860

ttggtttcacctgcggctttgcaagcggtcatggcttgctatctgatcccttatggtttg1920

tcgcaatttgtctacggcacgctgtctgatcgcatcggccgcaaaccaatcatcattgcc1980

ggattagtcatctacattgttggctctctgattgcgttgtttgctcaccaatactcatgg2040

tttcttatcggtagctttgtacaaggcttaggcattggctgtggcg2086

<210>3

<211>1529

<212>dna

<213>kan

<400>3

aaacaagactctctctactagtgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctag60

agaataggaacttcggaataggaacttcaagatcccctcacgctgccgcaagcactcagg120

gcgcaagggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctg180

accccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagag240

aaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggac300

agcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaa360

agtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctga420

tcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttc480

tccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctg540

ctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagac600

cgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggc660

cacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactg720

gctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccga780

gaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctg840

cccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccgg900

tcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgtt960

cgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgc1020

ctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccg1080

gctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaaga1140

gcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattc1200

gcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttc1260

gaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgcc1320

ttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccag1380

cgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccagcttcaaaagcgctctgaagttc1440

ctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatggac1500

catggctaataagtacgtgatgtaagctt1529

<210>4

<211>5648

<212>dna

<213>打靶片段

<400>4

atcggtgctccccgtctctttcggtgacgctttgtaaattacatccatttttggcacaaa60

actggcgtaactcagcgggctgatgcggttcacatcaacaggatacgtttccacccacaa120

tgcatccgttgaacggttgagcagagattcagccgttgcgtactgctggcggttccagat180

aaagctaacgttttgcgcatttttcgcactccgttcgatgcggtaatcttgcgtgttgta240

ggtcagccaacggctttgtgtgtagctggcttttgcttccaacttagctttcgggccgtt300

tttatctgcttcgacaccccccgttacgccaagctcaaagccagagacttctttacgctc360

aaagttcgcgttgacgttagtgaccgggaaagtctttagaatctgcgctttatcattcga420

agcgttgaagctgaaacgataatcctgcgctatcgcatctgttgaccattcacggaaata480

agcatccaaagtaacgtacccagccttaacttggcggtttccgagttggtcattgagatg540

aatacccgcgccagtgctgtcgtcatctaagctgatacgcacaattttggcatccggcgt600

tgccgaacccacaatgccatactgcaatgaacgctctaagttcacacggtaaatcaatga660

gatattggcatctttacaaaatggacgactgcctttgtcatttttccatagccaagaatt720

ggcgaaagtacactcttcatcgctgattgaacgattgacgttgatgtaaaaagcaacgtg780

cggcaacgtgttcgtttcattgttgttagtgacattattggcagacactgagcgacgtga840

ccgactcaacacacgctcagaacgtggggcttccagcagtgttggatccacatcctccgc900

acgatcaaacggtgtaaacagcagctcacctttatgctcagtgattacgatgaatgtatt960

agcaaacccaacaccataggtttttctaaatttcacctgcatttcggttaggcgatcagg1020

gtcagagatctgactgaaatcgaccaagatacgcaactgctggttaatcacctgctcacg1080

cagctcagctaaactgggtaattggctttcttctgattgccaatctgcagcgttgtaata1140

ttttattgcgtggttatccgcgacttggctaataatttcaacagcttcaccaacgggatc1200

actgatattcgcgaacacagtatgactagatattgcgctgaatatcgttaggattgcgat1260

tgcacaacgattgagttttggcatataaacctcactgattcagttatttttagtgttatt1320

agaagagagattttcaaacaaagtgaattaactcgaaccactgaaagaacagactagtgg1380

gaatttcattcatcactacgcacataattaagcgttatgctttaagaggataaatttaac1440

caacaccactgcaggttcaaatcatcgagcaaacccagtttgaatgcttctcgtgggtta1500

ccgtcgtcatccttgatgttgtgtggcttggggcagaactacggcttaacacataccctt1560

ttgacagaatattcaacttcttttatttgaaagaatacgtttatattctctgccaccaca1620

cttattggaatatccctaaacatgccaaaagtaaatagttgtaacggaaaatagtaacag1680

gagatcacaaattcacgcttgaaaacttattatttggcgagaattaatccttcacacaac1740

tattaattcccaatttattttttggatatttacattattcattcgcactaatttaatttg1800

aactaaattagattgaattaaatagataaaaatagaaattcattaagtgattaactttca1860

atcattaaatatcacttaagtccattcatatgaaaaataaagatcaattatgaacagaat1920

aataggagagtttatacacaaggttgatcttacttccaacctgagtaatgacagagcact1980

tctcattgacgagacaaatgtctcattcacaatacaaaagagatctgaccagatctgcag2040

tgtgtattttcaaccaataagaagaaaacgatgaaacaagactctctctactagtgtagg2100

ctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactt2160

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catcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacga3000

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atcgccattctgttcatagccttaaagaaaagggaaagatggcacatttgagatgacaaa3720

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ggtgtcgctctttattgcctttatttccagtttgacctttttccctctggcaatcaaaaa3840

cctgctgattggacaaattctgcttggcggtttaatcattgtgtttcaatgctcattact3900

gtttgaaatagccgccatctactaccagaagaaaacgccgtggggatttcggctaccact3960

ctctttggtggtgatcattgtcgtgctggccatccatatttttggcactcttgccagtta4020

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tgatatgtacggccatgacacgggagataaggtaataactcaagtggtcgagatcattaa4440

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acaaaaaacacactatcctaaacatgcggaagtgaccgtcagtgtggggttagcggaggt4620

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ttcatatggaccatggctaataagtacgtgatgtaagctt40

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<212>dna

<213>人工序列

<400>8

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<212>dna

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<400>9

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<210>10

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aagcttacatcacgtacttattagccatggtccatatgaa40

<210>11

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<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gaggcacaacctgtgactcg20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cgaaaccgtgttgctctggg20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>13

actgggctatctggacaaggga22

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

tcatagaaggcggcggtggaa21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>15

attggcgagctgctctgaac20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>16

gaagcagctccagcctacactggaaccgttacaacaactc40

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<211>40

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

tgtgttgttgctgcatcgct20

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<400>23

atttcatcttgtttccattagtgtaggctggagctgcttc40

<210>24

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

cgtttcaaattggaaggctattagccatggtccatatgaa40

<210>25

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

ttcatatggaccatggctaatagccttccaatttgaaacg40

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

gccattgcggcgggtaatag20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

atcacgacggatgaagccca20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

gggatgtgaactcggtgtgc20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

actgctttgcacggtttcga20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

tttccagtaagcgcccggta20