本發(fā)明屬于合成生物學和生物能源技術領域，具體涉及一種基于樹干畢赤酵母合成菌株發(fā)酵木糖生產衣康酸的構建方法。以樹干畢赤酵母(pichiastipitisfpl-uc7)為宿主，異源表達密碼子優(yōu)化的衣康酸合成途徑，過表達細胞質順烏頭酸酶基因aco，獲得樹干畢赤酵母衣康酸合成菌株，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中高效發(fā)酵木糖生產衣康酸的方法。
背景技術：
衣康酸作為一種重要的c5二羧酸化合物，被美國能源部列為二十一世紀有限發(fā)展的12中平臺化合物之一，可廣泛應用于化工、醫(yī)藥、農業(yè)等領域，具有極其廣闊的市場和應用價值。衣康酸的生產方法有微生物發(fā)酵粉和化學合成法。化學合成法又可分為檸檬酸合成法和順酐合成法，因檸檬酸合成法生產成本較高，工業(yè)上已不再采用，而順酐法雖然生產成本低、選擇性高，但未實現(xiàn)工業(yè)化。而生物發(fā)酵粉因原料易得，工藝技術成熟等優(yōu)點成為國內外工業(yè)化生產衣康酸的主導方法?，F(xiàn)階段，微生物發(fā)酵生產衣康酸的工程菌株主要是土曲霉類aspergillusterreus。然而，由于土曲霉類的復雜生長形態(tài)，限制了發(fā)酵過程的可控性和工業(yè)化規(guī)模；同時由于該絲狀真菌的特異性重組頻率低，基因工程手段在其菌種改造方面仍很困難，這些因素限制了衣康酸產量的進一步提高。近年來，采用合成生物學，使用非曲霉菌生物合成衣康酸的研究得到了廣泛發(fā)展。利用大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌及酵母菌等模式菌株為宿主，異源表達衣康酸合成途徑，用葡萄糖或甘油為碳源經發(fā)酵后衣康酸產量達到0.17-7.8g/l(trinhct(2012)elucidatingandreprogrammingescherichiacolimetabolismsforobligateanaerobicn-butanolandisobutanolproduction.appl.microbiol.biotechnol.95(4):1083-1094)。然而，以木糖等價格更為低廉的原料為碳源，采用合成生物菌株發(fā)酵生產衣康酸的研究未見報道。
作為木質纖維素的重要組成部分，木糖在總的單糖中能占到30％，因此高效利用木糖生產目標代謝物是發(fā)展生物質經濟的關鍵問題之一。自然中存在能夠天然代謝木糖的微生物，如樹干畢赤酵母具有寬廣的碳源代謝能力，能高效代謝木糖，同時具有耐低ph和高糖等優(yōu)點。利用樹干畢赤酵母發(fā)酵木糖產乙醇、富馬酸已見報道(trinhct(2012)elucidatingandreprogrammingescherichiacolimetabolismsforobligateanaerobicn-butanolandisobutanolproduction.appl.microbiol.biotechnol.95(4):1083-1094)。這些結果為利用該菌株發(fā)酵木糖合成衣康酸奠定了理論基礎和操作平臺。
本發(fā)明首次以樹干畢赤酵母(pichiastipitisfpl-uc7)為宿主，異源表達經密碼子優(yōu)化的來源于土曲霉的順烏頭酸脫羧酶基因cad，構建衣康酸合成途徑，并過表達宿主菌的細胞質順烏頭酸酶基因aco。獲得了樹干畢赤酵母衣康酸合成菌株，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中高效發(fā)酵木糖生產衣康酸。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種基于樹干畢赤酵母合成菌株發(fā)酵木糖生產衣康酸的構建方法。采用具有天然木糖代謝能力的樹干畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7為宿主，異源表達經密碼子優(yōu)化的來自土曲霉的順烏頭酸脫羧酶cad，進一步過表達樹干畢赤酵母fpl-uc7細胞質順烏頭酸酶aco，獲得了樹干畢赤酵母衣康酸合成菌株。本發(fā)明構建過表達cad和aco基因的生產衣康酸工程菌株方法，對開發(fā)生物質生產衣康酸具有現(xiàn)實意義和指導價值。本發(fā)明采用如下技術方案。
本發(fā)明的技術方案如下：
一種基于樹干畢赤酵母合成菌株發(fā)酵木糖生產衣康酸的構建方法；以樹干畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7為宿主菌株，異源表達cad基因和過表達aco基因，其構建步驟如下：
(1)密碼子優(yōu)化土曲霉cad基因，并進行全基因合成；
(2)設計樹干畢赤酵母定位細胞質的aco基因引物；
(3)以樹干畢赤酵母fpl-uc7基因組dna為模板，擴增aco基因片段；
(4)建立連入cad和aco編碼基因的過表達載體py26tef-gpd-ia1；
(5)電轉化過表達載體py26tef-gpd-ia1到樹干畢赤酵母fpl-uc7感受態(tài)細胞，對轉化菌株進行木糖補料發(fā)酵實驗。
所述步驟(1)cad基因擴增引物序列
cad-f5’-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3’(bamhi酶切位點)
cad-r5’-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3’(ecori酶切位點)。
所述步驟(2)aco基因擴增引物序列
aco-f5’-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3’(noti酶切位點)
aco-r5’-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3’(sacii酶切位點)。
所述步驟(4)將全基因合成的cad基因擴增后，用bamhi-ecori雙酶切，與同樣用bamhi-ecori雙酶切的py26tef-gpd質粒連接，獲得質粒py26tef-gpd-cad；將質粒py26tef-gpd-cad和aco基因分別用noti-sacii雙酶切，連接后即獲得過表達質粒py26tef-gpd-ia1。
所述步驟(5)將過表達載體質粒擴增提純后，采用電轉化方法轉入宿主菌株，通過尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型固體平板篩選，篩選獲得發(fā)酵木糖生產衣康酸的樹干畢赤酵母合成菌株，然后對該合成菌株進行發(fā)酵試驗，檢測衣康酸產量。
所述木糖補料發(fā)酵條件為：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低于10％，ph恒定維持6.5，發(fā)酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：木糖20-40g/l，無氨基酵母氮源(ynb)1-2g/l，尿素1-3g/l。
本發(fā)明的樹干畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7為荷蘭微生物保藏中心pichiastipitiscbs6054，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型衍生菌株。
發(fā)酵木糖生產衣康酸工程菌株構建步驟詳細說明如下：
(1)根據(jù)ncbi報道的土曲霉cad(genbankaccessionno.ab326105.1)基因的dna序列，設計pcr擴增引物cad-f/r，cad基因序列經密碼子優(yōu)化后進行全基因合成；
(2)根據(jù)ncbi報道的樹干畢赤酵母aco(genbankaccessionno.xm_001386043)基因的dna序列，利用在線工具mitoprot(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)預測線粒體定位序列，并設計定位細胞質的pcr擴增引物aco-f/r；
(3)以樹干畢赤酵母fpl-uc7基因組dna為模板，擴增定位于細胞質的aco基因片段；
(4)建立連入cad和aco編碼基因的過表達載體py26tef-gpd-ia1，熱激轉化到大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性轉化子，進行pcr和雙酶切驗證，并進行重組質粒py26tef-gpd-ia1的擴增提取；
(5)電轉化過表達載體py26tef-gpd-ia1到樹干畢赤酵母fpl-uc7感受態(tài)細胞，在尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型固體平板上(轉化子篩選培養(yǎng)基)篩選陽性轉化子，進行pcr和雙酶切驗證，對驗證正確的轉化子進行3l發(fā)酵罐補料發(fā)酵試驗，檢測衣康酸的產量。
pcr引物序列為：
(1)cad基因擴增引物序列
cad-f5’-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3’(bamhi酶切位點)
cad-r5’-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3’(ecori酶切位點)
(2)aco基因擴增引物序列
aco-f5’-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3’(noti酶切位點)
aco-r5’-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3’(sacii酶切位點)
將全基因合成的cad基因擴增后，用bamhi-ecori雙酶切，與同樣用bamhi-ecori雙酶切的py26tef-gpd質粒連接，獲得質粒py26tef-gpd-cad；將質粒py26tef-gpd-cad和aco基因分別用noti-sacii雙酶切，連接后即獲得過表達質粒py26tef-gpd-ia1，重組質粒py26tef-gpd-ia1構建圖譜見附圖。將過表達載體質粒擴增提純后，采用電轉化方法轉入宿主菌株，通過尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型固體平板(轉化子篩選培養(yǎng)基)篩選，篩選獲得發(fā)酵木糖生產衣康酸的樹干畢赤酵母合成菌株，然后對該合成菌株進行發(fā)酵試驗，檢測衣康酸產量。
本發(fā)明利用合成生物學手段在樹干畢赤酵母中pichiastipitisfpl-uc7實現(xiàn)衣康酸合成途徑及優(yōu)化，成功構建了發(fā)酵木糖生產衣康酸的工程菌株。采用本發(fā)明基因工程菌進行衣康酸3l發(fā)酵罐補料發(fā)酵實驗，衣康酸合成產量達到了1.52g/l。本發(fā)明構建的樹干畢赤酵母合成菌株在利用合成生物學高效發(fā)酵生物質生產衣康酸中發(fā)揮重大的作用，具有重大的潛力和廣闊的應用價值。
附圖說明
圖1：構建重組質粒py26tef-gpd-ia1圖譜。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明進行說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，本領域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應當視為在本發(fā)明的范圍內，本發(fā)明的范圍和實質有權利要求來限定。
本發(fā)明利用合成生物學的研究手段，以樹干畢赤酵母中pichiastipitisfpl-uc7為宿主，異源表達衣康酸合成途徑：來自土曲霉的順烏頭酸脫羧酶基因cad，優(yōu)化順烏頭酸酶基因aco，構建cad和aco雙基因的過表達載體py26tef-gpd-ia1，將其電轉化轉入宿主菌株，并對轉化子進行分批補料發(fā)酵木糖生產衣康酸實驗。
材料：
1.樹干畢赤酵母pichiastipitisfpl-uc7(荷蘭微生物保藏中心pichiastipitiscbs6054，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型衍生菌株)
2.taqdna聚合酶(天根生化科技有限公司，中國北京)。
3.t4連接酶以及bamhi、ecori、noti、sacii等限制性內切酶(fermentas公司產品，中國上海)。
4.質粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。
5.dna純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。
6.dna凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。
7.氨芐青霉素、尿嘧啶(sigma公司)。
8.lb液體培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10。
9.lb固體培養(yǎng)基(g/l)：蛋白胨10，酵母浸粉5，氯化鈉10，瓊脂粉20。
10.轉化子篩選培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，無氨基酵母氮源(ynb)13，瓊脂粉20。
11.種子培養(yǎng)基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
12.發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：木糖20-40，無氨基酵母氮源(ynb)1-2，尿素1-3，ph6.5。
實施例一：雙基因表達載體py26tef-gpd-ia1的構建及轉化子獲得
(1)根據(jù)ncbi報道的土曲霉cad(genbankaccessionno.ab326105.1)基因的dna序列，設計pcr擴增引物cad-f/r，cad基因序列經密碼子優(yōu)化后進行全基因合成。以全合成基因cad為模板，設計引物cad-f/r進行pcr擴增(cad-f5’-cgcggatcccggtgttacctctgagatctgtcac-3’(bamhi酶切)，cad-r5’-ccggaattcatggagacttaacagggcagttcaa-3’(ecori酶切))。將cad基因擴增片段純化、酶切、回收后，與相應酶切的py26tef-gpd質粒連接，轉化dh5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性轉化子，提取質粒，采用限制性內切酶bamhi和ecori進行雙酶切驗證，雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳獲得1.5kb左右的酶切片段，命名為py26tef-gpd-cad，對轉化子cad基因進行測序，序列為seqno.1。
(2)根據(jù)ncbi報道的樹干畢赤酵母aco(genbankaccessionno.xm_001386043)基因的dna序列，利用在線工具mitoprot(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)預測線粒體定位序列，設計定位細胞質的pcr擴增引物aco-f/r，aco-f5’-atttgcggccgcctcagaactgctgtcaga-3’(noti酶切)，aco-r5’-tccgtcgacgatcaatgctcgtca-3’(sacii酶切)。
(3)以樹干畢赤酵母fpl-uc7提取的基因組為模板，以aco-f/r為引物pcr擴增定位細胞質的aco基因片段，將所得的pcr產物經0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為分別為2.5kb左右的aco基因電泳條帶。
(4)將aco基因擴增片段純化、酶切、回收后，與相應酶切的py26tef-gpd-cad質粒連接，轉化dh5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性轉化子，提取質粒，采用限制性內切酶noti和sacii進行雙酶切驗證，雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳獲得2.5kb左右的酶切片段，對轉化子aco基因進行測序，序列為seqno.2，實驗表明獲得了插入序列正確的重組質粒，命名為py26tef-gpd-ia1。
雙酶切體系：dna片段15μl，bamhi/noti1μl，ecori/sacii1μl，10×buffer5μl，ddh2o28μl，37℃反應2h。
連接體系：酶切后的目的基因片段12μl，質粒載體片段7.5μl，t4連接酶0.5μl，22℃反應2h。
(5)將樹干畢赤酵母fpl-uc7感受態(tài)細胞與質粒py26tef-gpd-ia1的混合液(8μl質粒、80μl感受態(tài)細胞)轉移到預冷的2mm電轉杯中，然后用啟動電轉儀進行轉化(轉化條件：電壓1500v，電容2μf，電阻200ω，電擊4-5ms)，電擊完畢后立即加入1ml預冷的1mol/l的山梨醇溶液混勻復蘇電擊后的感受態(tài)細胞，然后轉至無菌的1.5ml離心管中，30℃水浴鍋孵育2h，5000rpm離心30s，吸去部分上清液剩余約200μl，吹吸重懸，涂布轉化子篩選培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)3-5天待轉化子長出，進行酶切和pcr驗證。驗證正確后的菌株為能利用木糖發(fā)酵衣康酸的樹干畢赤酵母合成菌株。
實施例二：樹干畢赤酵母合成菌株利用木糖生產衣康酸的分批補料發(fā)酵實驗(一)
(1)培養(yǎng)基
種子液體培養(yǎng)基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：木糖20，無氨基酵母氮源(ynb)1.0，尿素1.0，ph6.5。
(2)分批補料發(fā)酵實驗：挑取平板活化的樹干畢赤酵母單菌落接種至種子培養(yǎng)基，30℃、200rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48小時，離心收集菌體，用新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌體，再以5％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在3l發(fā)酵罐中發(fā)酵5-7天。發(fā)酵條件：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低于10％，ph恒定維持6.5，發(fā)酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。
(3)衣康酸含量的測定：發(fā)酵過程中間隔24h，吸取10ml發(fā)酵液，5000rpm離心10min，取上清液進行0.22μl有機濾膜過濾，利用高效液相色譜(hplc)進行樣品檢測分析。hplc檢測條件：色譜柱為aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流動相為15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速為0.8ml/min，柱溫為40℃，210nm處紫外檢測。測定結果表明：本發(fā)明構建獲得的樹干畢赤酵母合成菌株發(fā)酵木糖生產衣康酸的產量達到了1.2g/l。
實施例三：樹干畢赤酵母合成菌株利用木糖生產衣康酸的分批補料發(fā)酵實驗(二)
(1)培養(yǎng)基
種子液體培養(yǎng)基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：木糖30，無氨基酵母氮源(ynb)1.5，尿素2.0，ph6.5。
(2)分批補料發(fā)酵實驗：挑取平板活化的樹干畢赤酵母單菌落接種至種子培養(yǎng)基，30℃、200rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48小時，離心收集菌體，用新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌體，再以5％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在3l發(fā)酵罐中發(fā)酵5-7天。發(fā)酵條件：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低于10％，ph恒定維持6.5，發(fā)酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。
(3)衣康酸含量的測定：發(fā)酵過程中間隔24h，吸取10ml發(fā)酵液，5000rpm離心10min，取上清液進行0.22μl有機濾膜過濾，利用高效液相色譜(hplc)進行樣品檢測分析。hplc檢測條件：色譜柱為aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流動相為15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速為0.8ml/min，柱溫為40℃，210nm處紫外檢測。測定結果表明：本發(fā)明構建獲得的樹干畢赤酵母合成菌株發(fā)酵木糖生產衣康酸的產量達到了1.5g/l。
實施例四：樹干畢赤酵母合成菌株利用木糖生產衣康酸的分批補料發(fā)酵實驗(三)
(1)培養(yǎng)基
種子液體培養(yǎng)基(g/l)：木糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，ph6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：木糖40，無氨基酵母氮源(ynb)2.0，尿素3.0，ph6.5。
(2)分批補料發(fā)酵實驗：挑取平板活化的樹干畢赤酵母單菌落接種至種子培養(yǎng)基，30℃、200rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48小時，離心收集菌體，用新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基重懸菌體，再以5％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在3l發(fā)酵罐中發(fā)酵5-7天。發(fā)酵條件：1.5vvm通氣量、100-400rpm保證溶氧量不低于10％，ph恒定維持6.5，發(fā)酵72h補加60ml的無菌500g/l木糖溶液。
(3)衣康酸含量的測定：發(fā)酵過程中間隔24h，吸取10ml發(fā)酵液，5000rpm離心10min，取上清液進行0.22μl有機濾膜過濾，利用高效液相色譜(hplc)進行樣品檢測分析。hplc檢測條件：色譜柱為aminexhpx-87h(bio-rad,hercules,ca,usa)，流動相為15％甲醇+85％5mmol/l的稀硫酸，流速為0.8ml/min，柱溫為40℃，210nm處紫外檢測。測定結果表明：本發(fā)明構建獲得的樹干畢赤酵母合成菌株發(fā)酵木糖生產衣康酸的產量達到了1.3g/l。
seqno.1
cad
ggatccatgaccaaacaatctgctgactccaacgccaagtccggtgttacctctgagatctgtcactgggcctctaatttggccactgacgacatcccatccgatgtcttggagagagctaagtacttgattttggacggaatcgcctgtgcctgggttggtgccagagtcccatggtctgagaaatacgtccaggccactatgtccttcgaaccaccaggagcttgcagagtcattggttacggtcagaaacttggtccagtcgctgctgctatgaccaactctgcctttatccaggccaccgagttggacgactaccattccgaagccccacttcattctgcctccatcgttttgcctgctgtcttcgctgcctccgaagttttggctgaacaaggtaagactatttccggtatcgacgttattttggccgccatcgtcggttttgagtccggtccaagaatcggtaaggccatctacggttccgacttgttgaacaatggttggcactgtggtgctgtttacggtgctccagctggagctttggccaccggtaagttgttgggtttgactcctgactccatggaagatgccttgggtatcgcttgtacccaagcctgtggtttgatgtctgcccagtacggtggtatggttaagcgtgtccaacacggattcgccgccagaaacggtttgttgggtggattgttggctcatggtggttacgaagccatgaagggtgtcttggagcgttcctacggtggtttcttgaagatgtttaccaagggtaacggacgtgagcctccatacaaggaagaagaggtcgtcgctggattgggttctttctggcacacttttactatcagaatcaaactttacgcttgttgcggattggttcacggaccagttgaggccatcgaaaacttgcagggtcgttaccctgagttgcttaacagagccaacttgtccaacattagacacgtccacgtccagttgtccactgcttccaactcccactgtggttggattcctgaggagagaccaatttcctctattgccggtcagatgtccgtcgcctatatcttggctgttcaattggtcgaccagcagtgcttgttgtctcagttctccgagttcgacgacaacttggagagaccagaggtttgggacttggccagaaaggtcacctcctctcaatccgaggagttcgaccaggatggtaactgcttgtctgctggtcgtgtcagaatcgagttcaacgacggttcctccattaccgagtccgttgagaagcctcttggtgtcaaggagcctatgcctaacgaaagaattttgcacaagtacagaaccttggccggttctgttaccgacgagtctagagtcaaggagatcgaagatttggttttgggtttggacagattgaccgatatttccccacttcttgagttgttgaactgccctgttaagtctccattggttgaattc
seqno.2
aco
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