本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

二十世紀(jì)以來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為工業(yè)化生產(chǎn)生物活性物質(zhì)、疫苗、載體，如單克隆抗體、藥用蛋白質(zhì)、基因工程藥物等常用的手段，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與基因工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)密切相關(guān)，在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了關(guān)鍵的核心作用。此外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的日臻完善，促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)純化技術(shù)、病毒培養(yǎng)技術(shù)等的發(fā)展。從當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、無(wú)血清培養(yǎng)是近年來(lái)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的方向。

目前，許多獸用疫苗都通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過(guò)程往往需要使用血清，而血清的存在增加了細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物安全性的不確定因素，具有可能導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)、批次間差異大、易受污染和成本較高等缺點(diǎn)。此外，血清中成分較為復(fù)雜，多含有分子量較大的組分，影響病毒的分離純化，且容易被支原體感染，這一現(xiàn)實(shí)問(wèn)題已經(jīng)成為動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應(yīng)用發(fā)展動(dòng)力。隨著無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用提供了必要的技術(shù)支撐，無(wú)血清培養(yǎng)已成為包括疫苗在內(nèi)的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)的總趨勢(shì)。

無(wú)血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿足病毒的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來(lái)的諸多不利因素。因此，發(fā)展無(wú)血清培養(yǎng)基是利用病毒生產(chǎn)疫苗重要條件。目前已有一些市售細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，但是現(xiàn)有市售無(wú)血清培養(yǎng)基存在細(xì)胞增殖不夠理想、價(jià)格昂貴等缺陷。

中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01410467191.2的發(fā)明專利申請(qǐng)文件，無(wú)血清培養(yǎng)基及其用途和一種豬病毒的培養(yǎng)方法，該無(wú)血清培養(yǎng)基以mem為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加的氨基酸及其他組分多達(dá)45種，組分非常復(fù)雜。

因此，現(xiàn)有技術(shù)存在細(xì)胞貼壁性差，組分過(guò)于復(fù)雜，細(xì)胞增殖速率不夠理想等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，它具有病毒繁殖可控，安全性高的特點(diǎn)。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：亞油酸2～10mg/l，硫辛酸30～100μg/l，核黃素0.2-0.5mg/l，抗生素13-16μm，胰島素0.9-1.3mg/l，過(guò)氧化氫酶10-17mg/l，全反式維甲酸2～7μg/l，纖粘連蛋白14-22μg/l、脂質(zhì)型牛血清蛋白180～420mg/l，肌醇10～60μg/l，鹽酸硫胺3～12μg/l，葉酸3～9μg/l，黃體酮0.2～1.6mg/l，微量元素5～23μg/l，細(xì)胞生長(zhǎng)因子20-35μg/l，抗氧化劑2～15mg/l、氨基酸1～42mg/l。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供病毒的生存和最低的生理活動(dòng)。硫辛酸與本發(fā)明所用其他原料協(xié)同作用，能夠提高病毒的細(xì)胞活率，另外，硫辛酸還起到抗氧化的作用，過(guò)氧化氫酶能夠清除自由基，保護(hù)病毒免受超氧自由基損害等，胰島素可通過(guò)作用于病毒表面的胰島素受體，增強(qiáng)病毒對(duì)能源的攝入和利用，同時(shí)促進(jìn)病毒內(nèi)的rna、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)病毒的活力與功能，纖粘連蛋白能夠促進(jìn)病毒的黏附，及其貼壁生長(zhǎng)。

本發(fā)明對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的種類沒(méi)有特殊的要求，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員所常知，例如，所述培養(yǎng)基選自mem培養(yǎng)基、dmem培養(yǎng)基、dmem-f12培養(yǎng)基(1:1)、hb培養(yǎng)基、bem培養(yǎng)基中的一種。

氨基酸是維持病毒生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)元素之一，優(yōu)選的，所述氨基酸選自賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、精氨酸和谷氨酰胺中的至少一種。

優(yōu)選的，所述氨基酸包括以下重量份的物質(zhì)：賴氨酸1-2g、色氨酸1.5-2g、苯異亮氨酸0.5-1g、纈氨酸0.5-2g、蘇氨酸1-1.5g、亮氨酸0.5-1g、甘氨酸0-1g、異亮氨酸0-1.5g、絲氨酸0.5-1g、天冬氨酸0.5-1.5g、精氨酸0.5-1g和谷氨酰胺0-1.5g；

抗氧化劑能夠防止培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生氧化，優(yōu)選的，所述抗氧化劑為抗壞血酸、谷胱甘肽、維生素e、類胡蘿卜素、尿酸、枸櫞酸、edta、泛醌和多酚類抗氧化劑中的一種或幾種。

細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)病毒細(xì)胞的增殖，以及調(diào)節(jié)病毒細(xì)胞的功能，優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子為胰島素、白介素-2、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維生長(zhǎng)因子、皮質(zhì)醇和甲狀腺激素中的一種或幾種。

優(yōu)選的，所述微量元素為微量金屬元素和/或維生素，所述微量金屬元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳、鉻、硒、碘、鎳、氟、鉬、釩、錫、硅、鍶、硼、銣中的至少一種。

優(yōu)選的，所述維生素為維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1、維生素b2、維生素b5、維生素b6、維生素b12、維生素b13、維生素b15、對(duì)氨基苯甲酸中的至少一種。

一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入亞油酸，硫辛酸，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質(zhì)型牛血清蛋白，肌醇，鹽酸硫胺，抗氧化劑，在35～50℃混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為6.8～7.2，得到混合體系1；

(2)將上述所得溶液i冷卻至15-16℃，然后加入核黃素，抗生素，胰島素，過(guò)氧化氫酶，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，氨基酸；

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物的ph值調(diào)節(jié)為6.8～7.2，然后用微米濾膜過(guò)濾，除菌后，即得。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明病毒培養(yǎng)基能使病毒快速增殖，還能降低病毒的凋亡速度減慢，因而本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)有極大地促進(jìn)作用。

(2)本發(fā)明培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、成本低廉，適合用于病毒的大規(guī)模培養(yǎng)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基mem培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：亞油酸7mg/l，硫辛酸60μg/l，核黃素0.4mg/l，抗生素14μm，胰島素1.2mg/l，過(guò)氧化氫酶14mg/l，全反式維甲酸4μg/l，纖粘連蛋白18μg/l、脂質(zhì)型牛血清蛋白190mg/l，肌醇40μg/l，鹽酸硫胺6μg/l，葉酸6μg/l，黃體酮1.3mg/l，微量元素15μg/l，白介素-230μg/l，抗壞血酸8mg/l、氨基酸24mg/l；

所述氨基酸為賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸；

所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、錳；

本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入亞油酸，硫辛酸，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質(zhì)型牛血清蛋白，肌醇，鹽酸硫胺，抗氧化劑，在40℃混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為7.0，得到混合體系1；

(2)將上述所得溶液i冷卻至15℃，然后加入核黃素，抗生素，胰島素，過(guò)氧化氫酶，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，氨基酸；

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物的ph值調(diào)節(jié)為7，然后用微米濾膜過(guò)濾，除菌后，即得。

實(shí)施例2

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：亞油酸5mg/l，硫辛酸50μg/l，核黃素0.3mg/l，抗生素15μm，胰島素0.9mg/l，過(guò)氧化氫酶13mg/l，全反式維甲酸4μg/l，纖粘連蛋白15μg/l、脂質(zhì)型牛血清蛋白223mg/l，肌醇40μg/l，鹽酸硫胺6μg/l，葉酸7μg/l，黃體酮1.0mg/l，微量元素15g/l，白介素-225μg/l，谷胱甘肽12mg/l、氨基酸23mg/l；

所述氨基酸為蘇氨酸、亮氨酸、甘氨酸、異亮氨酸；

所述微量元素為鐵、銅、鋅、鈷、維生素a、維生素d、維生素e、維生素k；

本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入亞油酸，硫辛酸，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質(zhì)型牛血清蛋白，肌醇，鹽酸硫胺，抗氧化劑，在40℃混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為7.1，得到混合體系1；

(2)將上述所得溶液i冷卻至15℃，然后加入核黃素，抗生素，胰島素，過(guò)氧化氫酶，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，氨基酸；

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物的ph值調(diào)節(jié)為6.9，然后用微米濾膜過(guò)濾，除菌后，即得。

實(shí)施例3

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem-f12培養(yǎng)基(1:1)和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：亞油酸8mg/l，硫辛酸80μg/l，核黃素0.4mg/l，抗生素15μm，胰島素1.1mg/l，過(guò)氧化氫酶12mg/l，全反式維甲酸5μg/l，纖粘連蛋白19μg/l、脂質(zhì)型牛血清蛋白190mg/l，肌醇30μg/l，鹽酸硫胺9μg/l，葉酸6μg/l，黃體酮1.2mg/l，微量元素14μg/l，白介素-230μg/l，尿酸8mg/l、氨基酸23mg/l；

所述氨基酸為賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸；

所述微量元素為維生素a、維生素d、維生素e、維生素k、維生素b1；

本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入亞油酸，硫辛酸，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質(zhì)型牛血清蛋白，肌醇，鹽酸硫胺，抗氧化劑，在50℃混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為7.2，得到混合體系1；

(2)將上述所得溶液i冷卻至16℃，然后加入核黃素，抗生素，胰島素，過(guò)氧化氫酶，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，氨基酸；

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物的ph值調(diào)節(jié)為7.2，然后用微米濾膜過(guò)濾，除菌后，即得。

實(shí)施例4

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基hb培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：亞油酸2mg/l，硫辛酸30μg/l，核黃素0.2mg/l，抗生素13μm，胰島素0.9mg/l，過(guò)氧化氫酶10mg/l，全反式維甲酸2μg/l，纖粘連蛋白14μg/l、脂質(zhì)型牛血清蛋白180mg/l，肌醇10μg/l，鹽酸硫胺3μg/l，葉酸3μg/l，黃體酮0.2mg/l，微量元素5μg/l，白介素-220μg/l，抗壞血酸2mg/l、氨基酸1mg/l；

所述氨基酸選自賴氨酸、色氨酸；

所述微量元素為鐵、銅、鋅、維生素a、維生素d、維生素e；

本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入亞油酸，硫辛酸，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質(zhì)型牛血清蛋白，肌醇，鹽酸硫胺，抗氧化劑，在50℃混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為6.8，得到混合體系1；

(2)將上述所得溶液i冷卻至15℃，然后加入核黃素，抗生素，胰島素，過(guò)氧化氫酶，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，氨基酸；

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物的ph值調(diào)節(jié)為7.2，然后用微米濾膜過(guò)濾，除菌后，即得。

實(shí)施例5

本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基mem培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：亞油酸10mg/l，硫辛酸100μg/l，核黃素0.5mg/l，抗生素16μm，胰島素1.3mg/l，過(guò)氧化氫酶17mg/l，全反式維甲酸7μg/l，纖粘連蛋白22μg/l、脂質(zhì)型牛血清蛋白420mg/l，肌醇60μg/l，鹽酸硫胺12μg/l，葉酸9μg/l，黃體酮1.6mg/l，微量元素23μg/l，白介素-235μg/l，抗壞血酸15mg/l、氨基酸42mg/l；

所述氨基酸為賴氨酸、色氨酸、苯異亮氨酸；

所述微量元素維生素a、維生素d、維生素e、維生素k；

本發(fā)明還提供了該培養(yǎng)病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入亞油酸，硫辛酸，全反式維甲酸，纖粘連蛋白、脂質(zhì)型牛血清蛋白，肌醇，鹽酸硫胺，抗氧化劑，在40℃混合均勻，調(diào)節(jié)溶液ph值為7，得到混合體系1；

(2)將上述所得溶液i冷卻至16℃，然后加入核黃素，抗生素，胰島素，過(guò)氧化氫酶，葉酸，黃體酮，微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，氨基酸；

(3)將步驟(2)的產(chǎn)物的ph值調(diào)節(jié)為7，然后用微米濾膜過(guò)濾，除菌后，即得。

不同培養(yǎng)基對(duì)mdck細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

1、實(shí)驗(yàn)方法：在25ml方瓶中，分別用實(shí)施例1-5制得的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)mdck細(xì)胞，并以市售invitrogen公司的無(wú)血清培養(yǎng)基vp-sfm(貨號(hào)11681020)作為對(duì)照，以細(xì)胞比生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，觀察不同培養(yǎng)基中mdck細(xì)胞貼壁情況以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并以公式：細(xì)胞活性(％)＝活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100％，計(jì)算細(xì)胞活性。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：見(jiàn)表1。

用實(shí)施例1-5無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的mdck細(xì)胞，極少數(shù)呈懸浮狀態(tài)，大部分貼壁良好，與市售vp-sfm培養(yǎng)的mdck細(xì)胞生長(zhǎng)情況大致相同。由表1可知，用實(shí)施例1-4無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的mdck細(xì)胞，在培養(yǎng)72h后細(xì)胞密度達(dá)到最高，96h后細(xì)胞開(kāi)始凋亡，72h實(shí)施例1-5培養(yǎng)的細(xì)胞活性均在90％以上，比生長(zhǎng)率達(dá)到0.45以上，要比市售vp-sfm培養(yǎng)的細(xì)胞活性和比生長(zhǎng)率好，其中以實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基效果較佳。

上述描述僅是對(duì)本發(fā)明部分實(shí)施例的描述，并非對(duì)本發(fā)明范圍的任何限定，本行業(yè)的普通技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明對(duì)上述實(shí)施例做出改進(jìn)或修改，但均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。