本發(fā)明屬于熒光定量pcr領(lǐng)域，具體涉及一種多重?zé)晒鈖cr法檢測幽門螺旋桿菌耐藥基因突變的試劑盒。

背景技術(shù)：

幽門螺旋桿菌(hp)感染是一個全球性的問題，全世界人群感染率為50%。它與慢性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等消化道疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，根除hp是防治上述疾病的重要環(huán)節(jié)。在中國、歐洲等多個針對hp處理的共識意見中，均推薦含ppi和兩種抗生素(阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑中的兩種)的三聯(lián)療法作為根除hp治療的一線方案。隨著hp根除治療的普及和推廣，越來越多的患者在接受首次治療后hp不能被根除。有多種因素可能導(dǎo)致三聯(lián)療法治療失敗，hp對抗生素耐藥是導(dǎo)致根除失敗的主要原因。

hp對抗生素耐藥的問題在全球均比較普遍。megraud報道，1990～2002年全球hp對甲硝唑的原發(fā)耐藥率，日本最低，為9％～12.4％，墨西哥最高，為76.3％。其他多數(shù)國家和地區(qū)為20％~40％；hp對克拉霉素的原發(fā)耐藥率，英國和德國最低，為4％，墨西哥最高，為25％；hp對阿莫西林的耐藥情況多數(shù)地區(qū)報道為0，伊拉克最高，為0.9％，英國為0.4％。近年hp對抗生素的耐藥問題呈現(xiàn)出日益嚴(yán)重的趨勢。一項意大利的研究顯示，在過去15年內(nèi)，hp對克拉霉素的耐藥率增加了1倍，從1989～1990年的10.2％增加至2004～2005年的21.3％。香港地區(qū)hp對甲硝唑和克拉霉素的耐藥率從1997～2001年的29％和4.5％分別上升至39％和7.8％。北京地區(qū)hp對甲硝唑和克拉霉素的耐藥率分別從1999~2000年的36％和10％上升至2001~2002年的43％和18％，但幾年間僅發(fā)現(xiàn)l株阿莫西林耐藥菌株。本研究結(jié)果顯示，在中國地區(qū)，hp對甲硝唑耐藥已非常普遍，平均耐藥率為75.6％，對克拉霉素的耐藥率也已達(dá)27.6％，且85.1％對克拉霉素耐藥的菌株同時對甲硝唑耐藥，說明在中國地區(qū)，hp對甲硝唑和克拉霉素耐藥的問題已相當(dāng)嚴(yán)重，但hp對阿莫西林耐藥并不常見，其平均耐藥率為2.7％。

甲硝唑價格便宜，在胃內(nèi)具有高穩(wěn)定性和高活性，多年來一直被作為hp根除治療的主要藥物之一，在婦科疾病和口腔疾病的治療中甲硝唑也被廣泛應(yīng)用，這可能是導(dǎo)致hp對甲硝唑耐藥率迅速增加的原因之一。克拉霉素被認(rèn)為是hp根除治療方案中最有效的抗生素，由于其價格較高，幾年前在中國并不常用于hp的根除治療。隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，克拉霉素在臨床上的應(yīng)用也越來越廣泛，不但被用于hp的根除治療，在其他感染性疾病中也被廣泛應(yīng)用，從而導(dǎo)致hp對克拉霉素的耐藥率增加；此外，其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物如紅霉素、阿奇霉素等與克拉霉素存在交叉耐藥。前者的廣泛應(yīng)用也是導(dǎo)致hp對克拉霉素耐藥的原因之一。盡管阿莫西林在臨床的應(yīng)用也非常廣泛，但是在世界各地，hp對阿莫西林的耐藥率均較低，這可能與hp對阿莫西林耐藥的特殊機(jī)制有關(guān)，hp并非通過產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶而對阿莫西林耐藥。

目前，臨床上用于幽門螺旋桿菌耐藥檢測的方法主要有藥敏實驗，pcr-測序法，實時熒光pcr法。（1）pcr-測序法：此方法為在pcr結(jié)束后將pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，從測序結(jié)果判斷突變情況，測序法操作復(fù)雜、檢測周期長、成本較高。（2）藥敏實驗：此方法為取得樣本后，先進(jìn)行培養(yǎng)，然后再進(jìn)行藥敏實驗，步驟復(fù)雜、耗時長。（3）實時熒光pcr法：實時熒光pcr法只需一步擴(kuò)增，無需后續(xù)操作就能得到耐藥基因突變結(jié)果，靈敏度高、特異性好，操作簡單且易于實現(xiàn)自動化檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多重?zé)晒鈖cr法檢測幽門螺旋桿菌耐藥基因突變的試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本試劑盒能對胃黏膜組織樣本中的幽門螺旋桿菌耐藥基因突變進(jìn)行檢測，判斷其是否存在耐藥性。包含的藥物及耐藥基因突變位點為：克拉霉素（2142a>g、2143a>g、2182c>t），四環(huán)素（926-928aga>ttc），奎諾酮類（asn87-lys；ala88-val；asp91-gly），阿莫西林（s414r、y484c、t541i和p600t）。本發(fā)明所述試劑盒能夠在短時間內(nèi)得到準(zhǔn)確的結(jié)果，適用于臨床上幽門螺旋桿菌個體化用藥的指導(dǎo)。

試劑盒共包含7個組分：克拉霉素耐藥反應(yīng)緩沖液，四環(huán)素耐藥反應(yīng)緩沖液，奎諾酮類耐藥反應(yīng)緩沖液，阿莫西林耐藥反應(yīng)緩沖液，酶混合液，陽性對照，陰性對照，

克拉霉素耐藥反應(yīng)緩沖液包含clw上游引物、clw探針、2142下游引物、2143下游引物、2182下游引物、內(nèi)控引物及探針、dntps、mgcl2、kcl；

四環(huán)素耐藥反應(yīng)緩沖液包含tet引物及探針、內(nèi)控引物及探針、dntps、mgcl2、kcl；

奎諾酮耐藥反應(yīng)緩沖液包含lt下游引物、lt探針、lt87上游引物、lt88上游引物、lt91上游引物、內(nèi)控引物及探針、dntps、mgcl2、kcl；

阿莫西林耐藥反應(yīng)緩沖液包含s414r引物及探針、y484c引物及探針、t541i引物及探針、p600t引物及探針、內(nèi)控引物及探針、dntps、mgcl2、kcl。

酶混合液包含熱啟動taq酶及ung酶；

陽性對照包含克拉霉素耐藥突變質(zhì)粒、四環(huán)素耐藥突變質(zhì)粒、奎諾酮耐藥突變質(zhì)粒、阿莫西林耐藥突變質(zhì)粒、內(nèi)控質(zhì)粒及te水；

陰性對照包含te水。

引物探針序列：

質(zhì)粒序列：

質(zhì)粒制備方法：

委托廈門紐克泰生物技術(shù)有限公司合成上述質(zhì)粒序列，然后通過ta克隆的方法，將該序列連接至pgem-t載體上，轉(zhuǎn)化到j(luò)m109大腸桿菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒并稀釋至5.0×10⁸copies/ml備用。

試劑組分配方：

克拉霉素耐藥反應(yīng)緩沖液配方：tris（三羥甲基氨基甲烷）（ph9.0）40mmol/l，kcl（氯化鉀）80mmol/l，mgcl2（氯化鎂）2.0mmol/l，甲酰胺3%，硫酸銨40mmol/l，dntps（datp:dgtp:dctp:dttp:dutp為2:2:2:2:1）0.9mmol/l，clw上游引物333nmol/l，2142、2143、2182下游引物各333nmol/l，clw探針100nmol/l，內(nèi)控上游引物200nmol/l，內(nèi)控下游引物200nmol/l，內(nèi)控探針50nmol/l。

四環(huán)素耐藥反應(yīng)緩沖液配方：tris（三羥甲基氨基甲烷）（ph9.0）40mmol/l，kcl（氯化鉀）80mmol/l，mgcl2（氯化鎂）2.0mmol/l，甲酰胺3%，硫酸銨40mmol/l，dntps（datp:dgtp:dctp:dttp:dutp為2:2:2:2:1）0.9mmol/l，tet上游引物333nmol/l，tet下游引物333nmol/l，tet探針100nmol/l，內(nèi)控上游引物200nmol/l，內(nèi)控下游引物200nmol/l，內(nèi)控探針50nmol/l。

喹諾酮類耐藥反應(yīng)緩沖液配方：tris（三羥甲基氨基甲烷）（ph9.0）40mmol/l，kcl（氯化鉀）80mmol/l，mgcl2（氯化鎂）2.0mmol/l，甲酰胺3%，硫酸銨40mmol/l，dntps（datp:dgtp:dctp:dttp:dutp為2:2:2:2:1）0.9mmol/l，lt87、lt88、lt91上游引物各333nmol/l，lt下游引物333nmol/l，lt探針100nmol/l，內(nèi)控上游引物200nmol/l，內(nèi)控下游引物200nmol/l，內(nèi)控探針50nmol/l。

阿莫西林耐藥反應(yīng)緩沖液配方：tris（三羥甲基氨基甲烷）（ph9.0）40mmol/l，kcl（氯化鉀）80mmol/l，mgcl2（氯化鎂）2.0mmol/l，甲酰胺3%，硫酸銨40mmol/l，dntps（datp:dgtp:dctp:dttp:dutp為2:2:2:2:1）0.9mmol/l，s414r、y484c、t541i、p600t上游引物各333nmol/l，s414r、y484c、t541i、p600t下游引物各333nmol/l，s414r、y484c、t541i、p600t探針各50nmol/l，內(nèi)控上游引物200nmol/l，內(nèi)控下游引物200nmol/l，內(nèi)控探針50nmol/l。

酶混合液配方：熱啟動taq酶2u/μl，ung酶0.1u/μl。pcr擴(kuò)增條件為：38℃5分鐘，95℃10分鐘；進(jìn)入以下循環(huán)：95℃15秒，63℃40秒，10循環(huán)；95℃15秒，58℃40秒（采集熒光），40循環(huán)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：1、靈敏度達(dá)到500copies/ml；2、實時熒光pcr法檢測，只需一次擴(kuò)增即可得到結(jié)果，免去后續(xù)測序或雜交檢測步驟；3、突變檢出比例達(dá)到0.1%；4、在反應(yīng)中加入內(nèi)控，能夠?qū)崟r監(jiān)控反應(yīng)成功與否。

有益效果：1、減少實驗步驟、縮短檢測時間，提高檢測效率；2、采用多重實時熒光pcr法檢測，降低檢測成本；3、降低患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；4、為幽門螺旋桿菌治療提供指導(dǎo)，提高一次治療成功率。

附圖說明

圖1克拉霉素（2142a>g）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖2克拉霉素（2143a>g）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖3克拉霉素（2182c>t）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖4四環(huán)素（926-928aga>ttc）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖5奎諾酮類（asn87-lys）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖6奎諾酮類（ala88-val）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖7奎諾酮類（asp91-gly）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖8阿莫西林（s414r）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖9阿莫西林（y484c）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖10阿莫西林（t541i）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

圖11阿莫西林（p600t）耐藥突變檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1

1、試劑配制

（1）克拉霉素耐藥反應(yīng)緩沖液的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/l的trizma^?hcl80μl，0.5mol/l的trizma^?base720μl，100mmol/l的mgcl2200μl，5mol/l的kcl160μl，甲酰胺300μl，1mol/l的硫酸銨400μl，100mmol/l的dntps90μl，100μmol/l的clw上游引物33.3μl，100μmol/l的2142、2143、2182下游引物各33.3μl，100μmol/l的clw探針10μl，100μmol/l的內(nèi)控上游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控下游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控探針5μl。用滅菌超純水補(bǔ)足體積到10ml，混勻后，按1.5ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）四環(huán)素耐藥反應(yīng)緩沖液的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/l的trizma^?hcl80μl，0.5mol/l的trizma^?base720μl，100mmol/l的mgcl2200μl，5mol/l的kcl160μl，甲酰胺300μl，1mol/l的硫酸銨400μl，100mmol/l的dntps90μl，100μmol/l的tet上游引物33.3μl，100μmol/l的tet下游引物33.3μl，100μmol/l的tet探針10μl，100μmol/l的內(nèi)控上游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控下游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控探針5μl。用滅菌超純水補(bǔ)足體積到10ml，混勻后，按1.5ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）喹諾酮類耐藥反應(yīng)緩沖液的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/l的trizma^?hcl80μl，0.5mol/l的trizma^?base720μl，100mmol/l的mgcl2200μl，5mol/l的kcl160μl，甲酰胺300μl，1mol/l的硫酸銨400μl，100mmol/l的dntps90μl，100μmol/l的lt87、lt88、lt91上游引物各33.3μl，100μmol/l的lt下游引物33.3μl，100μmol/l的lt探針10μl，100μmol/l的內(nèi)控上游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控下游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控探針5μl。用滅菌超純水補(bǔ)足體積到10ml，混勻后，按1.5ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）阿莫西林耐藥反應(yīng)緩沖液的配制

取10ml容量瓶，分別加入0.5mol/l的trizma^?hcl80μl，0.5mol/l的trizma^?base720μl，100mmol/l的mgcl2200μl，5mol/l的kcl160μl，甲酰胺300μl，1mol/l的硫酸銨400μl，100mmol/l的dntps90μl，100μmol/l的s414r、y484c、t541i、p600t上游引物各33.3μl，100μmol/l的s414r、y484c、t541i、p600t下游引物各33.3μl，100μmol/l的s414r、y484c、t541i、p600t探針各5μl，100μmol/l的內(nèi)控上游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控下游引物20μl，100μmol/l的內(nèi)控探針5μl。用滅菌超純水補(bǔ)足體積到10ml，混勻后，按1.5ml/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）酶混合液的配制

取10ml容量瓶，分別加入5000u/ml的熱啟動taq酶4ml，5000u/ml的ung酶0.2ml。用滅菌超純水補(bǔ)足體積到10ml，混勻后，按50μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）陰性對照的配制

取10ml容量瓶，加入te水定容至10ml，按50μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（7）陽性對照的配制（濃度為5.0×10³copies/ml）

取10ml容量瓶，分別加入5.0×10⁵copies/ml的霉素耐藥突變質(zhì)粒（2142a>g、2143a>g、2182c>t）、四環(huán)素耐藥突變質(zhì)粒（926-928aga>ttc）、奎諾酮耐藥突變質(zhì)粒（asn87-lys；ala88-val；asp91-gly）、阿莫西林耐藥突變質(zhì)粒（s414r、y484c、t541i和p600t）和內(nèi)控質(zhì)粒（質(zhì)粒委托廈門紐克泰生物技術(shù)有限公司合成）各100μl。用te水定容至100ml，混勻后，按50μl/支分裝到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、核酸提取

采用已備案的核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度計測核酸純度，其od260/od280應(yīng)在1.6~2.0之間。

3、加樣上機(jī)

（1）反應(yīng)混合物配制

取出克拉霉素耐藥反應(yīng)緩沖液、四環(huán)素耐藥反應(yīng)緩沖液、喹諾酮類耐藥反應(yīng)緩沖液、阿莫西林耐藥反應(yīng)緩沖液、酶混合液室溫放置，使其充分溶解，配制反應(yīng)混合物（每測試配置體系：29.5μl反應(yīng)液+0.5μl酶混合液），按照需要計算好試劑用量，充分混合均勻后，3000-5000g離心5秒。

（2）加樣

取28μl的上述pcr反應(yīng)液分裝至pcr反應(yīng)管、八連條或96孔pcr反應(yīng)板的n個上樣孔中，分別加入樣本dna、陽性對照或陰性對照各2μl。將管蓋或封膜密封后，輕輕混勻并短暫離心，置入熒光pcr擴(kuò)增儀內(nèi)。

（3）上機(jī)檢測

（1）循環(huán)條件設(shè)置

（2）檢測模式：

4、結(jié)果判斷

（1）陰性對照fam通道、hex通道的cp/ct應(yīng)＞36或無讀值，rox通道的cp/ct應(yīng)cp/ct＞33或無讀值；陽性對照fam通道、hex通道的cp/ct應(yīng)≦36，rox通道的cp/ct應(yīng)≦33；

（2）樣本測試結(jié)果應(yīng)以下表判斷：

實施例2

1、試劑特異性驗證

（1）實驗樣本

采取6份特異性樣本對試劑的特異性進(jìn)行驗證，分別為大腸桿菌、空腸彎曲菌、沙門氏菌、腸道病毒71型、科薩奇病毒16型、輪狀病毒。

（2）實驗過程

采用本方法所述試劑分別檢測以上6份特異性樣本，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的特異性。

（3）實驗結(jié)果

6份特異性樣本檢測結(jié)果皆為陰性，表明試劑特異性好，無交叉反應(yīng)情況。具體結(jié)果見下表：

特異性檢測結(jié)果

2、試劑精密性驗證

（1）實驗樣本

采用hp耐藥陽性對照對試劑的精密性進(jìn)行驗證。

（2）實驗過程

用本方法所述試劑重復(fù)檢測以上樣本20次，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的精密性。

（3）實驗結(jié)果

本試劑盒檢測精密性樣本的批內(nèi)變異系數(shù)（cv值）＜5%，表明試劑重復(fù)性好。具體結(jié)果見下表：

精密性檢測結(jié)果

3、試劑最低檢測限驗證

（1）實驗樣本

將hp耐藥陽性對照稀釋為5.0×10²copies/ml，作為最低檢測限樣本。

（2）實驗過程

本方法所述試劑分別重復(fù)檢測以上最低檢測限樣本20次，分析檢測結(jié)果，驗證試劑的最低檢測限。

（3）實驗結(jié)果

檢測兩種質(zhì)粒最低檢測限樣本均為陽性，試劑的最低檢測限為0.5ng/μl。具體結(jié)果見下表：

實施例3：檢測60例臨床樣本的結(jié)果

1、按照實施例1所示的配制方法，配制試劑盒相關(guān)組分，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、于南京軍區(qū)福州總院獲得60例臨床胃黏膜石蠟切片樣本，采用嘉興雅康博貝南生物科技有限公司石蠟組織核酸提取試劑（磁珠法）提取60例臨床樣本的基因組dna，用紫外分光光度計檢測dna樣本的純度，60例樣本od260/od280皆在1.6~2.0之間。

3、按照實施例1所示的步驟，進(jìn)行dna加樣并上熒光定量pcr儀進(jìn)行檢測，本次使用的儀器為bio-radcfx96。

4、按照實施例1所示判斷標(biāo)準(zhǔn)，對結(jié)果進(jìn)行判讀并統(tǒng)計，結(jié)果如下表：

檢測結(jié)果見附圖1~11。圖中兩條擴(kuò)增曲線1條為耐藥突變檢測擴(kuò)增曲線，另一條為內(nèi)控擴(kuò)增曲線。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>嘉興雅康博貝南生物科技有限公司

<120>多重?zé)晒鈖cr法檢測幽門螺旋桿菌耐藥基因突變的試劑盒

<130>32

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aaacttgcgagaataattgcg21

<210>15

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cacgacttctaaaatccctgat22

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

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<210>17

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

gaagcggccgaaaagtg17

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

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<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

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<210>20

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

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<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

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<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

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<210>23

<211>22

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<213>人工序列

<400>23

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<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

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<210>25

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

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<210>26

<211>19

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<213>人工序列

<400>26

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<210>27

<211>20

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<213>人工序列

<400>27

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<210>28

<211>20

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<213>人工序列

<400>28

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<210>29

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<213>人工序列

<400>29

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<213>人工序列

<400>30

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<210>31

<211>90

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<213>人工序列

<400>31

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<210>32

<211>227

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<213>人工序列

<400>32

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<210>33

<211>175

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

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caagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactga120

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