本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌及其利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乳酸是一種廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織和化工等行業(yè)的多用途的有機(jī)酸。作為一種多功能的綠色平臺(tái)化合物，乳酸被認(rèn)為是一種很有前景和良好發(fā)展?jié)摿Φ木?xì)化學(xué)品。傳統(tǒng)的乳酸菌生產(chǎn)方法主要分為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，采用微生物發(fā)酵法可以通過不同的菌株，根據(jù)不同的需要生產(chǎn)光學(xué)純的l-乳酸或d-乳酸。目前采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸主要存在兩個(gè)瓶頸問題。一方面，發(fā)酵法采用可發(fā)酵糖如葡萄糖、淀粉等成本較高；另一方面，發(fā)酵過程中滅菌、下游分離純化成本較高。針對(duì)第一個(gè)瓶頸問題，可以采用更多廉價(jià)的可再生原材料，如農(nóng)業(yè)廢棄物中的淀粉或木質(zhì)纖維素材料，及工業(yè)和城市廢棄物等作為原材料發(fā)酵產(chǎn)乳酸，不僅大大降低乳酸的生產(chǎn)成本，還可以解決部分環(huán)境問題，變廢為寶。針對(duì)第二個(gè)瓶頸問題，可以選育一些嗜熱的芽孢桿菌來進(jìn)行發(fā)酵。由于嗜熱芽孢桿菌對(duì)外界環(huán)境耐受性強(qiáng)，發(fā)酵溫度高，雜菌污染幾率低，故無需對(duì)設(shè)備等進(jìn)行滅菌實(shí)行開放式發(fā)酵，降低了能源、人力等成本。因此，從上述兩個(gè)瓶頸問題的解決方法來看，選育耐高溫的，可以同時(shí)利用五碳糖和六碳糖為發(fā)酵底物的菌株是解決問題的關(guān)鍵。對(duì)于上述問題，申請(qǐng)公布號(hào)為cn102690764的中國發(fā)明專利公開了一種用于制備l-乳酸的凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用方法，該菌株能夠以五碳糖或六碳糖為原料，進(jìn)行發(fā)酵后得到l-乳酸，且其產(chǎn)量也較高，但是該菌株主要是以木糖醇生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物為原料，尤其是以玉米芯水解液中提取的木糖為原料，而且其在發(fā)酵過程中需要補(bǔ)加碳源，因此，其應(yīng)用受到了極大的限制。申請(qǐng)公布號(hào)為cn102643874的中國發(fā)明專利公開了芽孢桿菌利用玉米秸稈水解液生產(chǎn)聚合級(jí)l-乳酸的方法，具體公開了該芽孢桿菌能夠以玉米秸稈水解液作為唯一碳源發(fā)酵得到l-乳酸，其l-乳酸產(chǎn)量可達(dá)80g/l(每升發(fā)酵液生產(chǎn)80gl-乳酸)，雖然其也能夠利用玉米秸稈水解液生產(chǎn)l-乳酸，但其產(chǎn)量有待提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌，其中所述的芽孢桿菌bc-tj的保藏編號(hào)為cgmccno.14044。本發(fā)明還提供了上述凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌在制備乳酸中的應(yīng)用，尤其是制備l-乳酸中的應(yīng)用。在上述通過凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌制備乳酸的應(yīng)用中，其原料可為木質(zhì)纖維素水解液。示例性地，木質(zhì)纖維素選自玉米秸稈、小麥秸稈、稻草秸稈或其他農(nóng)作物秸稈中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含上述凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌。示例性的，所述培養(yǎng)基為上述凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌發(fā)酵后的培養(yǎng)基。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基中還包含木質(zhì)纖維素水解液。示例性的，木質(zhì)纖維素水解液為玉米秸稈水解液、小麥秸稈水解液、稻草秸稈水解液或其他農(nóng)作物秸稈水解液。優(yōu)選地，所述玉米秸稈是經(jīng)過酸水解或酶水解或酸酶聯(lián)和水解所得的水解液。本發(fā)明還提供上述凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌經(jīng)過遺傳修改而制備的芽孢桿菌。本發(fā)明還提供制備乳酸的制備方法，其包括通過上述凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素，優(yōu)選為木質(zhì)纖維素水解液。示例性的，木質(zhì)纖維水解液為玉米秸稈水解液、小麥秸稈水解液、稻草秸稈水解液或其他農(nóng)作物秸稈水解液。具體地，本發(fā)明所述的制備乳酸的方法包括：將凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌接種于含有木質(zhì)纖維素水解液(例如玉米秸稈水解液、小麥秸稈水解液、稻草秸稈水解液或其他農(nóng)作物秸稈水解液)的處理培養(yǎng)基中，在適宜溫度下發(fā)酵。所述秸稈水解液為秸稈的酸水解液或酶水解液或酸酶聯(lián)合水解液。示例性的，上述制備方法包括：將活化后的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj種子液，接種到處理培養(yǎng)基中，在30℃-60℃，優(yōu)選的為50℃條件下靜置培養(yǎng)直至培養(yǎng)基中總還原糖和l-乳酸含量穩(wěn)定時(shí)結(jié)束發(fā)酵。示例性的，上述所述酸酶聯(lián)和水解液的制備方法包括：1)將秸稈(例如玉米秸稈、小麥秸稈、稻草秸稈或其他農(nóng)作物秸稈)浸泡在稀硫酸中進(jìn)行預(yù)處理，且任選地，將處理過的秸稈進(jìn)行水洗，過濾，烘干后用于酶解；2)在上述預(yù)處理后的秸稈中加入纖維素酶液和β-葡萄糖苷酶酶液酶解處理；和3)將酶解后的產(chǎn)物靜置或離心，收集上清，即為秸稈水解液。本發(fā)明還提供包含上述凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj或由其傳代而產(chǎn)生的芽孢桿菌的培養(yǎng)物或其加工物。本發(fā)明篩選出了一種凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj，其保藏編號(hào)為cgmccno.14044。該菌株為兼性厭氧菌株，在有氧和無氧條件下均能生長，且發(fā)酵溫度高，發(fā)酵過程中，雜菌污染幾率小，無需對(duì)設(shè)備等進(jìn)行滅菌，實(shí)行開放式發(fā)酵，降低了能源、人力等成本。該菌株利用木質(zhì)纖維素水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸，其產(chǎn)量可達(dá)160±1.5g/l，光學(xué)純度達(dá)100％，發(fā)酵生產(chǎn)能力為2.2g/l/h。其在發(fā)酵過程中，無需補(bǔ)充還原性糖，能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，其在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的潛力。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1菌株的分離及篩選試驗(yàn)過程所用培養(yǎng)基如下：富集培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有木糖10g，酵母粉10g，其余為蒸餾水，ph6.0，115℃滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有木糖50g，酵母粉10g，其余為蒸餾水，ph6.0，115℃滅菌20min。生長培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有木糖30g，酵母粉10g，caco310g，瓊脂粉15～20g，ph6.5，115℃滅菌20min。種子培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖50g，酵母粉10g，caco320g，其余為蒸餾水，ph6.5，115℃滅菌20min。處理培養(yǎng)基：氣爆玉米秸稈水解液100～150ml，酵母粉10g，caco330g，ph6～7，115℃滅菌20min。采集河北農(nóng)村堆肥樣品，稱取1g置于20ml富集培養(yǎng)基中，50℃富集培養(yǎng)12h。置于80℃水浴鍋中加熱20min，殺死不形成芽孢的菌體，取出后進(jìn)行梯度稀釋分離。待長出單菌落后，挑選生長速度快和產(chǎn)透明圈面積大的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。將純化后的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中50℃靜置培養(yǎng)48h，采用生物傳感分析儀sba-40d測定l-乳酸含量。生物傳感分析儀sba-40d是以l-乳酸為底物，與氧氣、水在酶的催化作用下生成h2o2。h2o2透過酶膜的內(nèi)層在鉑金電極表面失去電子還原成h2o，鉑電極獲得電子產(chǎn)生電流信號(hào)，該電流信號(hào)與h2o2的濃度成比例，而h2o2濃度與底物濃度成線性比例關(guān)系。通過比較被測物和標(biāo)準(zhǔn)樣品產(chǎn)生的h2o2量，就可計(jì)算出被測樣品中底物的含量。經(jīng)過多次重復(fù)篩選，選取出一種乳酸產(chǎn)量最高的菌株bc-tj，將其保存并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2菌株bc-tj的菌落形態(tài)特征與生理生化特征將菌株bc-tj接種于生長培養(yǎng)基上生長24h后，觀察其菌落呈圓形，表面光滑，呈乳白色，邊緣平滑。革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞形態(tài)為桿狀，菌體大小為(0.7～0.9)×(3～5)μm，內(nèi)生芽孢。該菌株的適宜生長溫度為30℃～60℃，最適生長ph為5.5～6.5。在生理生化試驗(yàn)中，明膠液化、吲哚實(shí)驗(yàn)和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣為陰性；淀粉水解、v.p實(shí)驗(yàn)為陽性，60℃有氧條件和厭氧條件下均能生長。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表1。表1菌株bc-tj的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。實(shí)施例3菌株bc-tj的16srdna序列分析為了更準(zhǔn)確的鑒定分離得到的菌株bc-tj，對(duì)該菌株bc-tj的16srdna序列進(jìn)行擴(kuò)增和比對(duì)。首先提取該菌株bc-tj的基因組dna，用于16srdna序列擴(kuò)增的模板。將靜置培養(yǎng)過夜的菌株bc-tj，12000rpm室溫離心1min收集菌體，采用細(xì)菌dna提取試劑盒進(jìn)行dna提取(天根生化科技(北京)有限公司)，方法按照說明書所述進(jìn)行。16srdna序列擴(kuò)增引物：27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’1492r：5’-ggytaccttacgactt-3’反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；5℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；后72℃延伸10min。反應(yīng)體系：模板1μl，buffer5μl，fast-pfutaq酶1μl，dntp(2.5mmeach)4μl，正反向引物(100mm)各0.4μl，ddh2o補(bǔ)足至50μl反應(yīng)體系。目的片段膠回收后送測序。序列測定結(jié)果在ncbi中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行blastn比對(duì)。結(jié)果顯示，所得序列與凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)同源性高達(dá)99％，再結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化測定結(jié)果，參考bergey’smanualofdeterminativebacteriology(holtjg等1994)確定菌株bc-tj為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)bc-tj，并將其送于保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏日期：2017年4月18日，保藏號(hào)：cgmccno.14044。實(shí)施例4凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj發(fā)酵玉米秸稈發(fā)酵液生產(chǎn)l-乳酸1.氣爆玉米秸稈水解液的獲得氣爆玉米秸稈通過蒸汽爆破設(shè)備處理。反應(yīng)條件如下：將玉米秸稈浸泡在3％的稀硫酸中2h，170℃處理5min。然后將處理過的玉米秸稈用10倍體積的水洗10次，過濾后烘干直接用于酶解。采用里氏木霉纖維素酶酶液與黑曲霉β-葡萄糖苷酶酶液處理氣爆玉米秸稈。酶解反應(yīng)體系及條件如下：底物加載量為10％(w/v)，纖維素酶為15fpu/g底物，β-葡萄糖苷酶為30cbu/g底物，反應(yīng)于50mm，ph4.8的檸檬酸緩沖液中進(jìn)行48h。酶解后的水解產(chǎn)物8000rpm離心10min，收集上清，即為氣爆玉米秸稈水解液，作為培養(yǎng)基成分在發(fā)酵過程中添加。2.乳酸含量的測定乳酸含量測定采用液相色譜法。采用waters600高效液相色譜儀系統(tǒng)，色譜柱采用手性柱chirex3126(d)-penicillami，4.6mmid×250mml。流動(dòng)相2mmol/lcuso4溶液，其中溶劑為5％的異丙醇溶液，流動(dòng)相流速為0.7ml/min，柱溫30℃，紫外檢測器波長為254nm，進(jìn)樣量為2pl，用empower積分軟件積分。待測樣品以及流動(dòng)相等使用前經(jīng)0.22μm濾膜過濾后超聲脫氣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中乳酸的含量。3.總還原糖的測定總還原糖測定采用dns法(3，5-二硝基水楊酸比色法)。首先將葡萄糖稀釋不同的梯度制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度計(jì)算。具體反應(yīng)如下：試管內(nèi)添加0.5ml的葡萄糖溶液樣品，添加0.05mm，ph4.8檸檬酸緩沖液1ml，50℃水浴反應(yīng)60min；添加3ml的dns反應(yīng)液，混勻，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫；540nm波長下，測定樣品的吸光度。4.光學(xué)純度計(jì)算l-乳酸的光學(xué)純度＝(l-乳酸產(chǎn)量-d-乳酸產(chǎn)量)/(l-乳酸產(chǎn)量+d-乳酸產(chǎn)量)×100％5.l-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)能力計(jì)算l-乳酸生產(chǎn)能力(g/l/h)＝l-乳酸產(chǎn)量(g/l)/發(fā)酵時(shí)間(h)6.凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸將保存于-80℃甘油中的菌株bc-tj劃線接種于生長培養(yǎng)基上，50℃培養(yǎng)24h活化菌種；在無菌條件下將接種環(huán)1環(huán)菌種接于含有30ml種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30℃靜置培養(yǎng)20h后作為種子；種子按10％的接種量接入處理培養(yǎng)基中，50℃靜置培養(yǎng)直到培養(yǎng)基中總還原糖和l-乳酸含量穩(wěn)定時(shí)結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后根據(jù)上述的測定方法，對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測定和計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表2。表2凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj發(fā)酵產(chǎn)l-乳酸的情況水解液(ml/l)100125150發(fā)酵完成所需時(shí)間(h)72h72h72hl-乳酸(g/l)112±2.1143±3.1160±1.5轉(zhuǎn)化率(g/ml)1.121.141.07生產(chǎn)能力(g/l/h)1.561.992.22凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj大規(guī)模生產(chǎn)l-乳酸的應(yīng)用利用本發(fā)明提供的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)l-乳酸時(shí)，將種子培養(yǎng)基以體積比為5％～20％的接種量接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要選用1m3、2m3、3m3或更大體積的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝入量為70％～80％(v/v)，不通氣攪拌，攪拌速率為80-100r/min。大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)鹽組成，本發(fā)明提供的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj的碳源和氮源選擇十分廣泛，碳源可以為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、阿拉伯糖或玉米、大米、紅薯、木薯或玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉等淀粉類物質(zhì)或玉米秸稈、小麥秸稈、稻草秸稈或其他農(nóng)作物秸稈類物質(zhì)中的一種或多種，其中淀粉類物質(zhì)經(jīng)酶法液化、糖化制備成水解糖，農(nóng)作物秸稈類物質(zhì)經(jīng)酸水解或酶水解或酸梅聯(lián)合水解制備成水解液。氮源可以為蛋白胨、酵母粉、酵母膏、牛肉膏、麥根、麩皮、米糠、玉米漿、大豆肽、棉籽蛋白等中的一種或多種。在發(fā)酵過程中按照質(zhì)量體積比加入caco3，以控制處理培養(yǎng)基的ph維持在4.5-6.5。發(fā)酵溫度為40℃～60℃，優(yōu)選的為50℃。本發(fā)明提供的保藏號(hào)為cgmccno.14044的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj在不供氧的環(huán)境下，通過半連續(xù)間歇發(fā)酵方式或中間補(bǔ)糖發(fā)酵方式生產(chǎn)高光學(xué)純度的l-乳酸。下面以玉米秸稈水解液為例說明本發(fā)明半連續(xù)間歇發(fā)酵方式或中間補(bǔ)糖發(fā)酵方式大規(guī)模生產(chǎn)l-乳酸的過程。應(yīng)用實(shí)例1半連續(xù)間歇發(fā)酵方式大規(guī)模生產(chǎn)l-乳酸將保存于-80℃甘油中的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj劃線接種于生長培養(yǎng)基中，40℃～50℃培養(yǎng)18～24h活化菌種；在無菌條件下將接種環(huán)1環(huán)菌種接于種子培養(yǎng)基中，50℃靜置培養(yǎng)20h后作為種子；種子按5％～20％的接種量接入裝有處理培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要選用1m3、2m3、3m3或更大體積的發(fā)酵罐，溫度控制在40℃～60℃，優(yōu)選的為45℃～55℃，更優(yōu)選的為50℃，厭氧發(fā)酵24～48h，不通氣攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為80～100r/min，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖殘留≤0.3g/l時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，將此發(fā)酵液的5％～20％作為種子液轉(zhuǎn)接入新鮮的處理培養(yǎng)基中進(jìn)行下一批次的發(fā)酵，其余的發(fā)酵液進(jìn)入提取工序。將其余乳酸發(fā)酵液過濾除去固形不溶物，得到乳酸鈣溶液；然后向乳酸鈣溶液中加入硫酸酸解，硫酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％，處理溫度為70℃，控制最終酸解體系的ph值為2.5。酸解后進(jìn)行過濾，得到酸解后乳酸溶液，加熱濃縮除去乳酸溶液中80％的水分，得到初步濃縮的乳酸溶液。將初步濃縮的乳酸溶液溫度升至40℃，加入乳酸溶液質(zhì)量1.5％的活性炭，持續(xù)攪拌25min進(jìn)行脫色處理，得到脫色后的乳酸清液，在上述清液中加入0.02倍體積的正丁醇，通過采用薄膜蒸發(fā)進(jìn)行二次濃縮脫水，控制真空度為80kpa，至乳酸清液中乳酸含量為91％，得到脫色后乳酸濃縮液。將上述乳酸濃縮液置于冰水浴中，待溫度降至15℃時(shí)，向其中加入濃縮液質(zhì)量0.5％的醋酸鈉，并邊攪拌邊緩慢加入濃縮液3倍體積的乙醇，經(jīng)過25min左右，體系的溫度降至5℃，停止降溫，過濾得到不溶固形物和乳酸濾液。將所得固形物中加入乙醇洗滌，加入量為上述乙醇使用量的0.6倍，過濾后得到沉淀物和乳酸濾液。將兩部分乳酸濾液混合，在真空度90kpa下進(jìn)行減壓蒸餾，脫除其中的有機(jī)溶劑(正丁醇、乙醇)及殘余水分。最后，通過分子蒸餾進(jìn)行精制，溫度為70℃，壓力為20pa。l-乳酸的收率為94.6％，光學(xué)純度為100％。應(yīng)用實(shí)例2中間補(bǔ)糖發(fā)酵方式大規(guī)模生產(chǎn)l-乳酸將保存于-80℃甘油中的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj劃線接種于生長培養(yǎng)基中，40℃～50℃培養(yǎng)18～24h活化菌種；在無菌條件下將接種環(huán)1環(huán)菌種接于種子培養(yǎng)基中，50℃靜置培養(yǎng)20h后作為種子；種子按5％～20％的接種量接入裝有處理培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要選用1m3、2m3、3m3或更大體積的發(fā)酵罐，溫度控制在40℃～60℃，優(yōu)選的為45℃～55℃，更優(yōu)選的為50℃，不通氣攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為80～100r/min，厭氧發(fā)酵12～24h，補(bǔ)加玉米秸稈水解液，繼續(xù)發(fā)酵，60-72h后反應(yīng)結(jié)束，發(fā)酵液進(jìn)入提取工序。將上述乳酸發(fā)酵液過濾除去固形不溶物，得到乳酸鈣溶液；然后向乳酸鈣溶液中加入硫酸酸解，硫酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％，處理溫度為70℃，控制最終酸解體系的ph值為2.5。酸解后進(jìn)行過濾，得到酸解后乳酸溶液，加熱濃縮除去乳酸溶液中80％的水分，得到初步濃縮的乳酸溶液。將初步濃縮的乳酸溶液溫度升至40℃，加入乳酸溶液質(zhì)量1.5％的活性炭，持續(xù)攪拌25min進(jìn)行脫色處理，得到脫色后的乳酸清液，在上述清液中加入0.02倍體積的正丁醇，通過采用薄膜蒸發(fā)進(jìn)行二次濃縮脫水，控制真空度為80kpa，至乳酸清液中乳酸含量為91％，得到脫色后乳酸濃縮液。將上述乳酸濃縮液置于冰水浴中，待溫度降至15℃時(shí)，向其中加入濃縮液質(zhì)量0.5％的醋酸鈉，并邊攪拌邊緩慢加入濃縮液3倍體積的乙醇，經(jīng)過25min左右，體系的溫度降至5℃，停止降溫，過濾得到不溶固形物和乳酸濾液。將所得固形物中加入乙醇洗滌，加入量為上述乙醇使用量的0.6倍，過濾后得到沉淀物和乳酸濾液。將兩部分乳酸濾液混合，在真空度90kpa下進(jìn)行減壓蒸餾，脫除其中的有機(jī)溶劑(正丁醇、乙醇)及殘余水分。最后，通過分子蒸餾進(jìn)行精制，溫度為70℃，壓力為20pa。l-乳酸的收率為93.2％，光學(xué)純度為100％。本發(fā)明提供的保藏號(hào)為cgmccno.14044的凝結(jié)芽孢桿菌bc-tj是一種新的可用于l-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的耐高溫微生物，能在不供氧的情況下同型發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純度為100％的l-乳酸，其產(chǎn)率可高達(dá)160±1.5g/l，發(fā)酵生產(chǎn)能力為2.2g/l/h。該菌株發(fā)酵玉米秸稈發(fā)酵液生產(chǎn)l-乳酸，其發(fā)酵過程簡單，無需供氧，減少了無菌空氣供給所需的能耗及發(fā)酵罐的攪拌能耗，節(jié)約了生產(chǎn)成本。該菌株的最適合發(fā)酵溫度為40℃-60℃，其較高的發(fā)酵溫度能夠使雜菌污染的機(jī)會(huì)大大減少。另外，該菌株的發(fā)酵底物為玉米秸稈、小麥秸稈、稻草秸稈或其他農(nóng)作物秸稈的水解液中的一種或多種，能夠?qū)⒂衩捉斩?、小麥秸稈、稻草秸稈等秸稈廢棄物充分利用起來，變廢為寶，避免污染環(huán)境。利用該菌株大規(guī)模發(fā)酵玉米秸稈水解液，l-乳酸的得率在93％以上，光學(xué)純度為100％，因此，該菌株能夠應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。<110>中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所<120>凝結(jié)芽孢桿菌及其制備l-乳酸的應(yīng)用<130>2017<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>16<212>dna<213>人工合成<400>2ggytaccttacgactt16當(dāng)前第1頁12