本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

苯乳酸(phenyllacticacid，pla)，又名2-羥基-3苯基丙酸，是一類非常重要的化合物，在醫(yī)藥及生物防腐劑等方面具有非常廣泛的應(yīng)用。苯乳酸具有與其衍生物丹參素(β-3，4一二羥基苯基乳酸鈉)相同的藥理功能，可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)的類固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成許多藥物的重要中間物，比如：降血糖藥恩格列酮(englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(statine)、抗艾滋病毒制劑、新型驅(qū)腸蟲藥pfl022a等。此外，近年來發(fā)現(xiàn)苯乳酸可作為新型的生物防腐劑，且具有非常廣泛的抗菌譜，對(duì)革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌、單核增生性李斯特菌)、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門氏菌)和真核微生物(如曲霉青霉)等均有抑制作用。而苯乳酸生物制備法因其具有高效性、高對(duì)映選擇性、高區(qū)域選擇性、反應(yīng)條件溫和、適用范圍廣及環(huán)境友好等眾多的優(yōu)點(diǎn)備受研究者關(guān)注。因此，苯乳酸及其催化合成的酶類成為近年來研究的熱點(diǎn)。

1988年，lavermicocca等從酸面團(tuán)中分離得到的l.plantarum21b,產(chǎn)生的d-苯乳酸量為56mg/l,這是首次關(guān)于乳酸菌產(chǎn)生苯乳酸的報(bào)道。隨后研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不同種屬的乳酸菌能夠產(chǎn)生苯乳酸，如李興峰等從泡菜中篩選出112株菌，其中有10株菌產(chǎn)生d-苯乳酸的量超過66.4mg/l。但是由于原始菌株的局限性，其產(chǎn)生苯乳酸的量一般都不高，且不同菌株之間有較大差異，難以達(dá)到工業(yè)產(chǎn)業(yè)化要求。

現(xiàn)有技術(shù)中，有研究者發(fā)現(xiàn)苯丙酮酸還原酶在催化苯丙酮酸反應(yīng)12h后，苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化率為91.3％。也有研究者應(yīng)用lactobacillusplantarumcect-221生產(chǎn)苯乳酸，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，2l的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)158h，苯乳酸產(chǎn)量?jī)H為0.7g/l。由此可以看出，采用發(fā)酵法制備苯乳酸的產(chǎn)率較低，產(chǎn)物提取困難，而生物轉(zhuǎn)化法制備苯乳酸的底物上載量和產(chǎn)率均有所提高，但是反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，仍不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求,需要進(jìn)一步開發(fā)高效還原酮酸的酶類。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種苯丙酮酸還原酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述苯丙酮酸還原酶的基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達(dá)seqidno.1所示苯丙酮酸還原酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以pet-28a(+)為載體表達(dá)所述苯丙酮酸還原酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述的宿主為大腸桿菌e.colibl21(de3)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌按如下步驟構(gòu)建：(1)將seqidno.1所示基因片段與與pucm-t連接后轉(zhuǎn)化宿主e.colijm109，獲得重組質(zhì)粒命名為pucm-t-lpppr；(2)將pucm-t-lpppr與pet-28a(+)質(zhì)粒均用ndei和noti進(jìn)行雙酶切，在t4dna連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pet-28a(+)-lpppr；(3)將pet-28a(+)-lpppr轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)宿主。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述基因的異源表達(dá)方法，所述方法是將所述基因工程菌接種至lb培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)至od600為0.6～0.8，加iptg至終濃度為0.4-0.6mm進(jìn)行誘導(dǎo)，18～22℃誘導(dǎo)表達(dá)7～9h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體步驟如下：以含有苯丙酮酸還原酶基因的大腸桿菌e.coli/pet-28a-lpppr為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵條件為：挑取e.coli/lpppr單菌落接種于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min培養(yǎng)過夜，按2％的接種量接種到100mllb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)至od600為0.6-0.8，加iptg至終濃度為0.4-0.6mm進(jìn)行誘導(dǎo)，18-22℃誘導(dǎo)表達(dá)7-9h。收集菌體，8000rpm離心5min收集菌體，用100mm，ph7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌2-3次，制備成100mg/ml的菌懸液。

本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述苯丙酮酸還原酶制備苯乳酸的方法，是將苯丙酮酸還原酶以16～25u/mmol苯丙酮酸的添加量加入至含葡萄糖和苯丙酮酸的反應(yīng)體系中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙酮酸和葡萄糖的質(zhì)量比為1：0.8～1。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述苯丙酮酸是以酶液、酶粉或基因工程菌的形式參與反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌的酶活為2～5u/mg菌體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以所述基因工程菌為催化劑，以25mm苯丙酮酸為底物，并加入20mm葡萄糖和50mg濕菌體，于37℃溫度下反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述反應(yīng)在ph7.0～7.5的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述磷酸緩沖液是濃度為0.1mm的na2hpo4-nah2po4,緩沖液。

本發(fā)明還提供所述苯丙酮酸還原酶及表達(dá)所述苯丙酮酸還原酶的基因工程菌在食品、生物、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明提供了一種苯丙酮酸還原酶，能夠顯著提高苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化效率，使其在以葡萄糖和苯丙酮酸底物的反應(yīng)體系中，經(jīng)過5h反應(yīng)后，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.38％，e.e.值為99.9％。

附圖說明

圖1為反應(yīng)底物及產(chǎn)物的hplc圖譜；

圖2為重組質(zhì)粒pet-28a(+)-lpppr的構(gòu)建示意圖；

圖3為轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行圖；其中，ppa為苯丙酮酸；pla為苯乳酸。

具體實(shí)施方式

苯丙酮酸和苯乳酸標(biāo)品均購(gòu)自上海sigma公司；流動(dòng)相均購(gòu)自美國(guó)tedia天地試劑公司，高效液相色譜柱c-18(4.6×250mm,5μm)購(gòu)自德國(guó)bischoff有限公司。采用高效液相色譜儀waterse2695(美國(guó)waters公司)對(duì)樣品進(jìn)行分析。流動(dòng)相為均含有0.05％的三氟乙酸的甲醇(b)和水(a)的混合液，梯度洗脫程序?yàn)椋?～15min由20％b線性變化至65％b，15～16min由65％b線性變化至100％并保持3min，19～20min由100％b線性變化至20％，流速1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫30℃。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，色譜柱為c18柱。苯丙酮酸及苯乳酸的出峰時(shí)間如圖1所示，苯丙酮酸的出峰時(shí)間為11.790min，苯乳酸的出峰時(shí)間為12.831min。

酶活測(cè)定方法：反應(yīng)在30℃條件下，連續(xù)測(cè)定3min在340nm吸收值的變化。酶活定義為：在30℃、ph7.0的條件下，每分鐘消耗1μmolnadh所需的酶量為一個(gè)酶活單位(1μmol/min＝1u)

實(shí)施例1植物乳桿菌苯丙酮酸還原酶基因的獲得及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)特異性引物：

lpppr-f：5’-catatgatgaaaattttaatgtat-3’，含ndei酶切位點(diǎn)。

lpppr-r：5’-gcggccgcttaaaaggcgtgggccgt-3’，含noti酶切位點(diǎn)。

提取植物乳桿菌的基因組dna，以植物乳桿菌基因組dna為模板，lpppr-f和lpppr-r為引物，進(jìn)行pcr：94℃變性5min，30個(gè)循環(huán)(94℃30s、50℃30s和72℃60s)，72℃保溫10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析、割膠回收目的基因，與pucm-t連接，轉(zhuǎn)化e.colijm109，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌液pcr鑒定和dna測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pucm-t-lpppr。將測(cè)序正確的pucm-t-lpppr與pet-28a(+)質(zhì)粒均用ndei和noti進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在t4dna連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pet-28a(+)-lpppr，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定；將pet-28a(+)-lpppr轉(zhuǎn)化入e.colibl21(de3)中。

實(shí)施例2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

將e.colibl21-lpppr單菌落接種于2ml含100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min培養(yǎng)過夜；按2％接種量轉(zhuǎn)接于100mllb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至od600為0.6～0.8時(shí)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行的誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)條件為：添加iptg至終濃度0.4-0.6mmol/l，18-22℃誘導(dǎo)7-9h。收集菌體，用磷酸鈉緩沖液(na2hpo4-nah2po4,100mmol/l,ph7.0)洗滌2-3次，加入同樣緩沖液懸浮得到菌濃為100mg/ml的菌懸液。對(duì)反應(yīng)后的笨乳酸濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，d-苯乳酸濃度達(dá)7.05～7.79mm。

實(shí)施例3d-苯乳酸的制備

在1.5mlep管中加入400μl苯丙酮酸(終濃度25mm)，再加入100μl葡萄糖(終濃度為20mm)，加入500μl菌懸液(酶活為19.7u/mg濕菌體)，40℃反應(yīng)5h。定時(shí)取樣至甲醇中進(jìn)行稀釋，離心后過0.22μm有機(jī)濾膜，進(jìn)hplc進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)進(jìn)程曲線如圖2所示，在反應(yīng)210min后，苯丙酮酸含量已低于5mm，在反應(yīng)進(jìn)行5h后苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化率為98.38％，e.e.>99.9％，d-苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到4.15g/l。

對(duì)照例1

按實(shí)施例2的方式對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)，區(qū)別在于調(diào)整誘導(dǎo)溫度為16℃，在其余條件相同的條件下，d-苯乳酸濃度僅6.55～6.62mm。

對(duì)照例2

按實(shí)施例2的方式對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)，區(qū)別在于調(diào)整誘導(dǎo)溫度為25℃，在其余條件相同的條件下，d-苯乳酸濃度僅4.35～5.01mm。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的。

sequencelisting

<110>江南大學(xué)

<120>一種植物乳桿菌來源的苯丙酮酸還原酶及應(yīng)用

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