本發(fā)明涉及分子生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種長(zhǎng)鏈非編碼rna在對(duì)骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估及預(yù)防方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著全球人口老齡化程度日益加劇，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴(yán)重威脅社會(huì)公共衛(wèi)生的疾病之一。骨質(zhì)疏松在我國(guó)老年人中的發(fā)病率達(dá)到15.7％[1]，其最嚴(yán)重的后果是骨質(zhì)疏松性骨折，給患者的身心健康造成嚴(yán)重威脅、家庭造成極大的拖累、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。因而，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的早發(fā)現(xiàn)及防治顯得尤為重要。目前骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)室檢查有：(1)血鈣、磷和堿性磷酸酶：在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中，血清鈣、磷以及堿性磷酸酶水平通常是正常的，骨折后數(shù)月堿性磷酸酶水平可增高。(2)血甲狀旁腺激素：原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥者血甲狀旁腺激素水平可正?；蛏摺?3)骨更新的標(biāo)記物：骨質(zhì)疏松癥患者部分血清學(xué)生化指標(biāo)可以反應(yīng)骨轉(zhuǎn)換(包括骨形成和骨吸收)狀態(tài)，這些生化測(cè)量指標(biāo)包括：骨特異的堿性磷酸酶(反應(yīng)骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(反應(yīng)骨吸收)、骨鈣素(反應(yīng)骨形成)、ⅰ型原膠原肽(反應(yīng)骨形成)、尿吡啶啉和脫氧吡啶啉(反應(yīng)骨吸收)、ⅰ型膠原的n-c-末端交聯(lián)肽(反應(yīng)骨吸收)。(4)晨尿鈣/肌酐比值：正常比值為0.13±0.01，尿鈣排量過(guò)多則比值增高，提示有骨吸收率增加可能。然而目前采取的實(shí)驗(yàn)室檢查方法準(zhǔn)確度還不夠。骨質(zhì)疏松癥的輔助檢查：臨床上主要是通過(guò)影像學(xué)和骨密度測(cè)定，而輔助檢查的對(duì)象一般是晚期患者，不能用于早期骨質(zhì)疏松癥患者的篩查。骨的塑性和重建主要通過(guò)成骨細(xì)胞(osteoblast,ob)和破骨細(xì)胞(osteoclast,oc)實(shí)現(xiàn)，成骨細(xì)胞增加骨形成，破骨細(xì)胞減少骨生成，對(duì)于保持骨重塑過(guò)程的動(dòng)態(tài)耦聯(lián)平衡至關(guān)重要。大量研究結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松過(guò)中的ob和oc事件都出現(xiàn)了異常，這一變化的背后是ob和oc內(nèi)特定分子基因的表達(dá)失調(diào)。在基因表達(dá)的過(guò)程中各層次調(diào)節(jié)因素的變化最終都會(huì)導(dǎo)致基因的表達(dá)失調(diào)。過(guò)去的研究結(jié)果顯示在基因表達(dá)的過(guò)程中不同層次調(diào)節(jié)因素的變化最終都會(huì)導(dǎo)致基因的表達(dá)失調(diào)。在這些因素中，具有調(diào)節(jié)功能的非編碼rna的表達(dá)異常在近年來(lái)越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。非編碼rna是一類沒(méi)有蛋白編碼功能的基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，越來(lái)越多的證據(jù)表明非編碼rna在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的眾多過(guò)程中都有所參與。lncrna(longnoncodingrna)是序列長(zhǎng)度大于等于200nt的一類非編碼rna。在過(guò)去的十年間，研究者們發(fā)現(xiàn)了許多l(xiāng)ncrna，這些lncrna被證實(shí)在人體生物學(xué)過(guò)程的每一個(gè)方面例如染色體劑量補(bǔ)償、染色體印跡、染色質(zhì)重塑、染色質(zhì)集結(jié)、轉(zhuǎn)錄、剪切、細(xì)胞分化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、胞內(nèi)運(yùn)輸、干細(xì)胞重編碼和熱休克反應(yīng)等等都發(fā)揮了重要的作用。非編碼rna有許多亞類，除了研究較為透徹的microrna，越來(lái)越多的證據(jù)顯示lncrna在機(jī)體的很多生物學(xué)過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，此外lncrna的表達(dá)失調(diào)還與許多人類疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，例如神經(jīng)退變和腫瘤。然而到目前為止還沒(méi)有一項(xiàng)針對(duì)骨質(zhì)疏松癥過(guò)程中l(wèi)ncrna表達(dá)情況的研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N長(zhǎng)鏈非編碼lncrna-od1在骨質(zhì)疏松癥檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明可以用來(lái)診斷骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，可進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估及預(yù)防，并從長(zhǎng)鏈非編碼rna的角度揭示骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的潛在機(jī)制。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種長(zhǎng)鏈非編碼lncrna-od1，其是由位于第18號(hào)染色體的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生而來(lái)：chr18:77343316-77345492，hg19，基因序列長(zhǎng)度為2177bp。本申請(qǐng)人還提供了一種所述的長(zhǎng)鏈非編碼lncrna-od1在制備預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥的試劑、試劑盒或基因芯片中的應(yīng)用。本申請(qǐng)人還提供了一種預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥的定量pcr檢測(cè)試劑盒，包括用于檢測(cè)上述的長(zhǎng)鏈非編碼lncrna-od1的正向引物：tacactgaccccacagcctatg；和反向引物：catttcccaagcaggtttcc。本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：本發(fā)明的目的是通過(guò)基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)確定骨質(zhì)疏松過(guò)程中l(wèi)ncrna是否會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)，了解lncrna在骨質(zhì)疏松發(fā)病過(guò)程中所發(fā)揮的作用，可為骨質(zhì)疏松早期診斷提供新的線索，并有助于豐富骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子機(jī)制。運(yùn)用血液分子診斷標(biāo)記物，能顯著提高診斷的準(zhǔn)確性，并對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)病過(guò)程中l(wèi)ncrna所發(fā)揮的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)手段是利用高通量lncrna芯片技術(shù)首先在不同骨質(zhì)疏松癥血液標(biāo)本及健康對(duì)照者血液標(biāo)本進(jìn)行l(wèi)ncrna表達(dá)譜的系統(tǒng)篩查，接著通過(guò)逐步擴(kuò)大臨床樣本驗(yàn)證，確定可能與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的目標(biāo)lncrna。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)目標(biāo)lncrna結(jié)合臨床病理資料分析，并進(jìn)行細(xì)胞體外功能實(shí)驗(yàn)及初步機(jī)制研究，以揭示目標(biāo)lncrna對(duì)骨質(zhì)疏松癥破骨細(xì)胞功能的影響與潛在的調(diào)控途徑。本發(fā)明利用lncrna芯片分別在骨質(zhì)疏松癥患者的血液中進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)19415個(gè)骨質(zhì)疏松癥差異表達(dá)lncrna。將骨質(zhì)疏松癥血液中l(wèi)ncrna的表達(dá)量與正常血液中相比較，其中相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)的lncrna作為是表達(dá)差異的lncrna。結(jié)果相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上變化的共3636個(gè)，2倍以上上調(diào)的共2612個(gè)，2倍以上下調(diào)的共1024個(gè)，我們將均值foldchange提高到5倍及以進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5倍以上上調(diào)的共9個(gè)，5倍以上下調(diào)的共6個(gè)。我們初步篩選出15個(gè)在上述不同組間比較中均呈現(xiàn)顯著差異的lncrna，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大臨床樣本(骨質(zhì)疏松癥組25例，正常組25例)的sybrgreen定量pcr驗(yàn)證，共獲得2個(gè)與芯片結(jié)果基本一致的新lncrna，而其中一個(gè)在體外破骨細(xì)胞分化中表達(dá)明顯增多，并命名為lncrna-od1，通過(guò)pcr表達(dá)分析，提示lncrna-od1可能可能在骨質(zhì)疏松癥破骨細(xì)胞分化發(fā)生進(jìn)展中起到促進(jìn)作用。本發(fā)明的原理是：破骨細(xì)胞的起源和特征破骨細(xì)胞是骨骼的細(xì)胞成分之一，是生理狀態(tài)下唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞。破骨細(xì)胞來(lái)源于造血干細(xì)胞的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位，是由其分化來(lái)的單核細(xì)胞融合而成。破骨細(xì)胞數(shù)量增多及其骨吸收活性增強(qiáng)，是骨質(zhì)疏松癥骨量丟失的一個(gè)重要方面。本發(fā)明充分利用課題組前期建立的骨質(zhì)疏松癥完備的臨床資料和血液標(biāo)本庫(kù)，針對(duì)上述現(xiàn)實(shí)問(wèn)題，重點(diǎn)關(guān)注血液?jiǎn)魏思?xì)胞，從而為進(jìn)一步在骨質(zhì)疏松癥臨床樣本中驗(yàn)證目標(biāo)lncrna的可信性提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。近年來(lái)隨著研究的不斷深入，愈來(lái)愈多的新lncrna被發(fā)現(xiàn)，但多存在零散報(bào)道，一直缺乏在生物信息學(xué)方面對(duì)lncrna進(jìn)行系統(tǒng)描述。本發(fā)明直接關(guān)注在骨質(zhì)疏松癥血液?jiǎn)魏思?xì)胞中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的lncrna，并通過(guò)擴(kuò)大臨床標(biāo)本量和體外破骨細(xì)胞分化進(jìn)一步分析其表達(dá)差異，從而確定可能在骨質(zhì)疏松癥血液中發(fā)揮功能的lncrna。針對(duì)lncrna-od1序列，本發(fā)明的發(fā)明人查閱ucsc(http://www.genome.ucsc.edu/)hg19數(shù)據(jù)庫(kù)與ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在位于第18號(hào)染色體(chr18:77343316-77345492，hg18)，基因序列長(zhǎng)度為2177bp，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度為760nt。本發(fā)明首次在骨質(zhì)疏松癥血液?jiǎn)魏思?xì)胞中進(jìn)行長(zhǎng)鏈非編碼rna(lncrna)表達(dá)譜的系統(tǒng)篩查、分析，獲得了19615個(gè)骨質(zhì)疏松癥差異表達(dá)的lncrnas。首次發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松癥破骨細(xì)胞分化相關(guān)的lncrna，即lncrna-od1。本發(fā)明在一系列基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際臨床的中，存在很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為血液樣本rna提取和芯片的部分質(zhì)控結(jié)果，其中，a為rna電泳圖；b為實(shí)驗(yàn)所用的部分芯片外觀圖；c為芯片篩查后產(chǎn)生的掃描圖。圖2為隨機(jī)選取的5個(gè)探針號(hào)序列在原先用于芯片篩查的cdna上進(jìn)行定量pcr驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)定量pcr所反映的op和nc的相對(duì)差異倍數(shù)值與芯片篩查所反映的倍數(shù)值之間均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖3為差異lncrna的篩選，其中，a為散點(diǎn)圖；b為分聚類熱圖。圖中紅色代表相對(duì)高表達(dá)，綠色代表相對(duì)低表達(dá)。圖4為2個(gè)差異的lncrna分別在op組和nc組血液的差異表達(dá)。a為探針tr170015126；b為tr170015138。圖5為目標(biāo)lncrna-od1的選擇，其中，a為誘導(dǎo)分化的破骨細(xì)胞，左邊圖為陰性對(duì)照，右邊圖為分化的破骨細(xì)胞，包體大，多核等特征；b為探針tr170015126和tr170015138在破骨細(xì)胞分化中的mrna表達(dá)；c為lncrna-od1基因在ucsc數(shù)據(jù)庫(kù)上的位置圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和操作方法，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。1、方法1.1骨質(zhì)疏松組：隨意抽取醫(yī)院骨科收治的10例原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的患者，男、女各5例，年齡65-75歲。納入標(biāo)準(zhǔn)符合：《中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)》第二稿。無(wú)明顯的心肝肺等其它疾病，無(wú)引起繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的各種疾病，排除由于甲狀腺、腫瘤、糖尿病等其它嚴(yán)重疾病引起骨代謝者。正常組：選取年齡65-75歲的健康門診志愿者10例，男、女各5例。兩組之間的年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.01)，具有可比性。所有研究對(duì)象均知情同意。1.2血液rna提?。翰捎胻ripurelsreagent用于全血有核細(xì)胞的rna抽提，1ml的全血可得到10μg左右的totalrna。1.3totalrna合成cdna、反轉(zhuǎn)錄合成firststrandcdna、體外轉(zhuǎn)錄合成crna；采用rneasyminikitc檢測(cè)rna純度；crna反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行熒光標(biāo)記。1.4芯片雜交1.4.1標(biāo)記產(chǎn)物雜交準(zhǔn)備經(jīng)extractii試劑盒純化后的標(biāo)記產(chǎn)物，洗脫體積在30μl左右。如果進(jìn)行單通道芯片雜交，將單管標(biāo)記(cy3-dctp或cy5-dctp)純化洗脫產(chǎn)物抽真空濃縮或補(bǔ)水體積至27.5μl備用。如果進(jìn)行雙通道芯片雜交，將1管cy3-dctp標(biāo)記純化產(chǎn)物與另外1管cy3-dctp標(biāo)記純化產(chǎn)物混合后，共計(jì)60μl左右抽真空濃縮至27.5μl備用。1.4.2雜交體系配制、雜交反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析將單通道芯片雜交或雙通道芯片雜交步驟中準(zhǔn)備好的標(biāo)記產(chǎn)物，取100μl雜交液加樣至雜交蓋片圍欄中，“agilent”標(biāo)簽面朝下輕輕蓋上圍欄，安裝好agilent雜交盒并旋緊后，可輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)雜交盒，檢查各個(gè)亞陣的雜交腔體內(nèi)液體是否流動(dòng)。將雜交盒安裝在雜交爐的轉(zhuǎn)子上，注意對(duì)稱安裝，同時(shí)在托盤中加入適量超純水后，45℃雜交過(guò)夜。結(jié)束后，取出芯片在博奧slidewasher8芯片洗干儀進(jìn)行清洗，清洗程序如下：洗液i：0.2％sds，2×ssc，42℃120s清洗2遍。洗液ii：0.2％sds，2×ssc，42℃80s清洗3遍。清洗程序完成后，離心甩干，待掃描。使用agilent芯片掃描儀(g2565ca)對(duì)清洗后的芯片進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。1.5芯片數(shù)據(jù)分析1.5.1差異表達(dá)的mrna和incrna的篩選獲得的lncrnas數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)折疊倍率(foldchange，fc)篩選，篩選出所有差異表達(dá)的incrnas，參數(shù)選擇標(biāo)準(zhǔn)為p<0.05，fc>2foldor<-2fold；篩選后分別統(tǒng)計(jì)差異高表達(dá)和差異低表達(dá)的incrnas和mrnas數(shù)據(jù)。使用agilentfeatureextraction(v10.7)軟件對(duì)雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)。然后使用agilentgenespring軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析。1.5.2real-timepcr挑選芯片雜交結(jié)果中表達(dá)量倍數(shù)變化較大的lncrna進(jìn)行real-timepcr驗(yàn)證，分別以骨質(zhì)疏松癥血液和正?；颊哐后w外反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板，采用bio-rad熒光定量pcr儀，sybrgreen熒光染料參入法相對(duì)定量。以gapdh作為內(nèi)參，計(jì)算表達(dá)量差異倍數(shù)。1.6體外破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞集落刺激因子(maerophagecolonystimulatingfactor，m-csf)和細(xì)胞分化因子(receptoractivatorofnuclearfoetor—kbligand，rankl)體外誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。2、結(jié)果2.1rna抽提及芯片掃描及質(zhì)控結(jié)果如圖1所示，針對(duì)所有用于芯片篩查的血液中提取的總rna來(lái)做好rna質(zhì)控檢測(cè)。骨質(zhì)疏松癥血液中提取總rna為25ug，分光光度計(jì)結(jié)果顯示，樣品中提取rna的吸收值均在1.6-2.2之間，經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測(cè)，28s:18srrna條帶亮度清晰、完整，判定所有樣本的rna的質(zhì)量均符合芯片實(shí)驗(yàn)要求(圖1a)，所用rna質(zhì)控合格。利用affymetrixhumantranscriptomearray2.0芯片，按照操作流程規(guī)范，在上海伯豪生物公司進(jìn)行芯片篩查，質(zhì)控結(jié)果均合格圖(1b、1c)。2.2芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的定量pcr驗(yàn)證由圖2可見(jiàn)，在同時(shí)骨質(zhì)疏松癥組(op)和健康對(duì)照組(nc)的比較中，驗(yàn)證表達(dá)譜芯片篩查基因的可靠性，通過(guò)定量pcr所反映的相對(duì)表達(dá)差異倍數(shù)與芯片篩查數(shù)據(jù)一致，可進(jìn)一步進(jìn)行后期的生物信息學(xué)分析以及目標(biāo)lncrna的篩選。2.3差異lncrna的篩選如圖3所示，利用affymetrix公司提供的gghta芯片，按照操作流程規(guī)范進(jìn)行芯片篩查(圖3b)。芯片掃描圖像經(jīng)過(guò)nimbkscan軟件和agilentgenespringgx軟件分析處理后，得到骨質(zhì)疏松癥組與正常對(duì)照組的lncrnas表達(dá)數(shù)據(jù)；再經(jīng)過(guò)折疊倍率(foldchange)篩選獲得顯著差異表達(dá)的lncrna數(shù)據(jù)。如圖3a所示散點(diǎn)圖分析2倍以上表達(dá)量的改變，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的lncrna，觀察表達(dá)量2倍以上改變的lncrna的分布及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步對(duì)對(duì)數(shù)據(jù)定量分析，共檢測(cè)出19615個(gè)lncrna，將骨質(zhì)疏松癥血液中l(wèi)ncrna的表達(dá)量與正常血液中相比較，其中相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)的lncrna作為是表達(dá)差異的lncrna。結(jié)果相對(duì)表達(dá)量比值在2倍以上變化的共3638個(gè)，2倍以上上調(diào)的共2612個(gè)，2倍以上下調(diào)的共1026個(gè)，結(jié)果按生物學(xué)重復(fù)的結(jié)果的均值foldchange＝2.0，p<0.05篩選出的有差異變化的lncrna數(shù)量太多，我們將均值foldchange提高到5倍及以進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5倍以上上調(diào)的共9個(gè)，5倍以上下調(diào)的共6個(gè)。2.4目標(biāo)lncrna的驗(yàn)證我們選擇9個(gè)上調(diào)的lncrnas，6個(gè)下調(diào)的lncrnas共15個(gè)lncrna在更大樣本中骨質(zhì)疏松癥組(op)和健康對(duì)照組進(jìn)行驗(yàn)證，op組25例，正常組25例。選擇上述15個(gè)lncrna的依據(jù)是：(1)選擇芯片篩查結(jié)果中foldchanged較大的lncrna；(2)在聚類分析的結(jié)果中，以不相同的cluster中選取lncrna；(3)在每個(gè)op患者及對(duì)照樣本中都能檢測(cè)出的lncrna。定量pcr驗(yàn)證結(jié)果顯示，之前篩選獲得的15個(gè)lncrna中，有10個(gè)lncrna在各組間的表達(dá)與芯片結(jié)果不一致，且組間比較均無(wú)顯著性差異。另外3個(gè)lncrna表達(dá)變化與芯片結(jié)果一致，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此最終獲得2個(gè)可能與op相關(guān)的lncrna，探針tr170015126和tr170015138。其在op組和nc組血液的表達(dá)均存在不同程度的顯著性差異，如圖4所示。2.5目標(biāo)lncrna的選擇——lncrna-od1將最終獲得2各自序列均通過(guò)ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或ucsc數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.ucsc.edu/)比對(duì)分析，并查閱lncrna相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，如lncrnadb(http://www.lncrnadb.org/)等均未發(fā)現(xiàn)有正式報(bào)道。如圖5所示，為了進(jìn)一步驗(yàn)證2個(gè)lncrna在op中的作用，我們用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m-csf)和破骨細(xì)胞生成因子(rankl)誘導(dǎo)人骨髓單核細(xì)胞(bmms)向破骨細(xì)胞分化(圖5a)，實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，m-csf和rankl誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞探針號(hào)tr170015126mrna表達(dá)明顯增多(p<0.05)，而探針號(hào)tr170015138表達(dá)未見(jiàn)明顯改變(p>0.05)(圖5b)?？紤]到上述lncrna均是首次在op組血液樣本中通過(guò)篩選驗(yàn)證獲得，參考肌肉細(xì)胞分化(muscledifferentiation，lncrna-md1)等lncrna命名特點(diǎn)，暫將其命名為lncrna-od1。通過(guò)ucsc數(shù)據(jù)庫(kù)上的位置圖分析發(fā)現(xiàn)lncrna-od1位于第18號(hào)染色體(chr18:77343316-77345492，hg18)，基因序列長(zhǎng)度為2177bp，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度為760nt(圖5c)。重要的是lncrna-od1在op和破骨細(xì)胞分化中表達(dá)明顯增多，從臨床意義分析、體外實(shí)驗(yàn)等深入探索，提示lncrna-od1可能可能在骨質(zhì)疏松癥破骨細(xì)胞分化發(fā)生進(jìn)展中起到促進(jìn)作用。引物由上海生工生物工程有限公司代為合成，如表1所示。表1目標(biāo)lncrna-od1的引物名稱forwardprimerreverseprimerlncrna-od1gatcctgcagatgtggtcaacttaatagtggaaacagccc目標(biāo)lncrna-od1的探針序列為：gtgcatggtgcagggtgcagggtggggggctgtggggaaggtatggggggtttcgggtgcagtggggaggtgcagggggtgtggggtgcaggggtgcctccagccccagacctgctggggttgcactggttctgctgctgacaggtgacccacctgcccctgtgcgcaagtcactgaaagttttggagcctggttttcttacctgagaaatggggctgatgatcgtcctgactgatcgattggaccacccggtacaccactggcctctccgatccacaagcttcgaaagcattttcatatcaggatcctgcagatgtggtcaagacaagcactgggctgggcggggcccaagtccaggaacaggcatcctcctaagaggaaagagaccaacacggtgccatgggaggcaggcgaggttggagcaacggcacaagccagggaagctgagagcagcagatgctgggacaggtggctaggagccaccggtgcacccggggagcacgcccttgcgaggtgatgaaaaacctgctgaaatagcacagagcagcccctcccgcggtggttcatagcattcatcccctgagagcccacacaggccacaccaccggcccacagaggggaagctgaggcaggagcctaatgactcgccccaggcctcaaaacgatgtgcactggggctgtttccactattaagtcaacaatctctgcagtttctgcttaatggtctcaattaaggttctcttaataaagaacatttgtg。sequencelisting<110>無(wú)錫市第三人民醫(yī)院<120>一種長(zhǎng)鏈非編碼lncrna-od1在骨質(zhì)疏松癥檢測(cè)中的應(yīng)用<130>1<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>760<212>dna<213>人工序列<400>1gtgcatggtgcagggtgcagggtggggggctgtggggaaggtatggggggtttcgggtgc60agtggggaggtgcagggggtgtggggtgcaggggtgcctccagccccagacctgctgggg120ttgcactggttctgctgctgacaggtgacccacctgcccctgtgcgcaagtcactgaaag180ttttggagcctggttttcttacctgagaaatggggctgatgatcgtcctgactgatcgat240tggaccacccggtacaccactggcctctccgatccacaagcttcgaaagcattttcatat300caggatcctgcagatgtggtcaagacaagcactgggctgggcggggcccaagtccaggaa360caggcatcctcctaagaggaaagagaccaacacggtgccatgggaggcaggcgaggttgg420agcaacggcacaagccagggaagctgagagcagcagatgctgggacaggtggctaggagc480caccggtgcacccggggagcacgcccttgcgaggtgatgaaaaacctgctgaaatagcac540agagcagcccctcccgcggtggttcatagcattcatcccctgagagcccacacaggccac600accaccggcccacagaggggaagctgaggcaggagcctaatgactcgccccaggcctcaa660aacgatgtgcactggggctgtttccactattaagtcaacaatctctgcagtttctgctta720atggtctcaattaaggttctcttaataaagaacatttgtg760當(dāng)前第1頁(yè)12