本發(fā)明涉及文庫的構(gòu)建方法和試劑盒，更具體地，本發(fā)明涉及用于檢測染色體拷貝數(shù)變異的測序文庫構(gòu)建方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：研究表明，染色體數(shù)目的異常在已發(fā)現(xiàn)的染色體異常相關(guān)疾病中占有很大的比例(nagaoka,etal,2012)。染色體數(shù)目的異常除了可表現(xiàn)為整條染色體的數(shù)目改變(染色體非整倍體)，也可表現(xiàn)為某染色體的某一片段的拷貝數(shù)變異(如染色體微缺失微重復(fù)綜合征)。鑒于染色體異常疾病一般具有高發(fā)、危害性嚴重且缺乏有效的治療手段等特點，所以利用技術(shù)手段準(zhǔn)確檢測染色體拷貝數(shù)是否存在異常具有重要的意義。采用傳統(tǒng)核型分析技術(shù)(karyotyping)結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)(fish)或染色體微列陣分析技術(shù)(chromosomemicroarrayanalysis,cma，如acgh和snp-array)是目前臨床上用于檢測染色體拷貝數(shù)變異的主要手段和標(biāo)準(zhǔn)(nord,etal,2015)。上世紀(jì)70年代建立起的高分辨率核型分析技術(shù)(yunis,1978；trask,2002)目前仍是檢測染色體非整倍體、平衡或非平衡性結(jié)構(gòu)重排、較大片段的缺失/重復(fù)以及嵌合體等染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，但其分辨率較低(約為5mb)，無法檢出具有臨床意義的染色體較小片段的拷貝數(shù)變異。而始于上世紀(jì)80年代后期的fish技術(shù)(trask,1991)將細胞遺傳學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合，在臨床研究上檢測目標(biāo)染色體非整倍體和結(jié)構(gòu)異常等方面具有較好的應(yīng)用，但是其特異性探針的設(shè)計受到對目標(biāo)區(qū)域信息的限制，因而僅能夠得到有限的染色體信息。近年來發(fā)展起來的染色體微陣列分析技術(shù)(cma)則是一種高通量檢測基因組dna拷貝數(shù)變異的分子核型分析技術(shù)，其中相對成熟的比較基因組雜交(acgh)技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性基因芯片(snparray)技術(shù)都屬于cma技術(shù)(manningandhudgins,2010)。雖然cma技術(shù)相比于傳統(tǒng)核型分析技術(shù)具有很高的分辨率(breman,etal,2012)，但其在臨床應(yīng)用中需根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫中詳盡的染色體異常及相關(guān)臨床信息定制微陣列芯片，因此對某些罕見的或數(shù)據(jù)庫中未涵蓋的微缺失微重復(fù)(cnv)的檢測存在不足。而且，目前cma技術(shù)的難度較高和成本相對較高等特點也限制了其在欠發(fā)達地區(qū)的廣泛應(yīng)用。因此，為了更廣泛地排查和診斷染色體疾病，需要一種在保證檢測通量和分辨率的前提下能夠準(zhǔn)確檢測染色體拷貝數(shù)變異的經(jīng)濟、簡單的方法。近些年日益成熟的高通量測序技術(shù)(nextgenerationsequencing,ngs)因其通量高、準(zhǔn)確性高、靈敏性高、自動化程度高和運行成本低等突出的優(yōu)勢，使其在臨床研究中得到廣泛的應(yīng)用(xuan,etal,2013)。目前通過ngs數(shù)據(jù)檢測cnv最常用的原理是基于計算深度(read-depth)來實現(xiàn)的，即通過將某區(qū)段的深度與預(yù)先校正得到的理論值進行計算比較以判定該區(qū)段是否存在cnv,這種方法對于單端測序和雙端測序都適用(yoon,etal,2009；mason-suares,etal,2016)。在ngs文庫制備的過程中通常會采用標(biāo)準(zhǔn)的pcr來擴增隨機片段，而pcr不可避免的擴增偏好則會對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性造成影響(vandijk,etal,2014；head,etal,2014；goodwin,etal,2016)。因此，建立一種簡單的不依賴pcr的建庫方法對于提高染色體非整倍性尤其是cnv的檢測準(zhǔn)確性至關(guān)重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)檢測染色體拷貝數(shù)變異的方法在分辨率、全基因組覆蓋程度、通量和成本等方面的不足，同時克服ngs建庫過程中pcr擴增偏好性帶來的問題，提供了一種不依賴pcr的檢測染色體拷貝數(shù)變異的測序文庫構(gòu)建方法和試劑盒。采用該方法和試劑盒對待測樣本進行染色體拷貝數(shù)變異檢測，可實現(xiàn)對染色體非整倍體和染色體微缺失微重復(fù)綜合征的篩查和診斷。在第一個方面，本發(fā)明提供一種用于檢測染色體拷貝數(shù)變異的測序文庫構(gòu)建方法，其主要包括以下步驟：(1)利用雙鏈dna片段化酶將待測dna隨機片段化；(2)對片段化后的dna進行末端補平和3’端懸a；(3)將末端補平并3’端懸a的dna與測序接頭連接，獲得連接產(chǎn)物；(4)純化所述連接產(chǎn)物，獲得測序文庫，其中步驟(1)-(3)在單一反應(yīng)管中完成。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的方法構(gòu)建測序文庫的主要步驟。在一個實施方案中，待測dna的起始含量優(yōu)選為10-260ng。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，為滿足一定的上機測序要求，適合的文庫總量應(yīng)不低于2fmol。因此，為使所構(gòu)建文庫總量不低于2fmol，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)待測dna的起始含量最優(yōu)為10-260ng。含量過低，將導(dǎo)致所得測序文庫濃度不高，不能獲得有效的測序數(shù)據(jù)；含量過高，則將導(dǎo)致待測dna不能被充分地隨機片段化(即，將有部分待測dna未被片段化而仍然保持長片段的形式，這部分長片段dna不能被有效地測序)，也會影響最終文庫的濃度和測序的準(zhǔn)確性(參見實施例2)。在一個實施方案中，雙鏈dna片段化酶為非特異性切口核酸酶和t7內(nèi)切酶突變體的混合酶。具體地，所述非特異性切口核酸酶是源自弧菌，例如嗜鹽弧菌(vibriovulnificus)(vvn)的核酸酶，所述核酸酶可以是野生型或其突變體。所述t7內(nèi)切酶突變體是指在美國公開號2007-0042379中描述的，例如在兩個催化結(jié)構(gòu)域之間的橋接區(qū)具有突變的t7內(nèi)切酶。在一個實施方案中，包含非特異性切口核酸酶和t7內(nèi)切酶突變體的雙鏈dna片段化酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如中國專利cn102301009a所述。在一個實施方案中，非特異性切口核酸酶和t7內(nèi)切酶突變體的單位比例小于1:200，例如小于1:100或小于1:10，其范圍可以為1:2-1:200。最優(yōu)選地，非特異性切口核酸酶和t7內(nèi)切酶突變體的單位比例為1:200。其中，1個單位t7內(nèi)切酶突變體定義為在37℃下1個小時將90％的2μg線性切口的2.44kb的dsdna轉(zhuǎn)化成2個片段(1.37kb和1.07kb)所需要的酶的量。1個單位vvn核酸酶和其突變體定義為在37℃下30min釋放1a260單位的酸性可溶寡核苷酸所需要的酶的量。在一個實施方案中，根據(jù)dna是否落在大于60％gc(高gc含量)、40％-60％gc(標(biāo)準(zhǔn)gc含量)、或者小于40％gc(低gc含量)的范圍內(nèi)可確定dna片段化反應(yīng)的最佳的溫育時間。例如，溫育時間范圍可以典型地在5min至120min，例如，15min至60min范圍內(nèi)。在一個實施方案中，dna片段化反應(yīng)的溫度為35-40℃，最優(yōu)選37℃。在一個實施方案中，待測dna的隨機片段化是在緩沖液i存在下進行，其中緩沖液i主要包括20mm三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)、15mm氯化鎂(mgcl2)、50mm氯化鈉(nacl)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(bsa)、0.15％曲拉通(triton)。緩沖液i的存在能為隨機片段化反應(yīng)提供合適的反應(yīng)環(huán)境，同時維持dna片段化酶的穩(wěn)定性，并提高它的酶活力。在一個實施方案中，在步驟(1)和(2)之間還包括將所述雙鏈dna片段化酶滅活的步驟。滅活所述雙鏈dna片段化酶是指在60-70℃，例如65℃下溫浴10-13min，優(yōu)選在緩沖液ii存在下進行。所述緩沖液ii主要包括50mm氯化鈉(nacl)、10mm三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)、10mm氯化鎂(mgcl2)、1mm二硫蘇糖醇(dtt)。緩沖液ii的存在能為酶的滅活反應(yīng)提供合適的離子濃度，同時也為接下來的末端補平和3’端懸a的反應(yīng)提供合適的反應(yīng)環(huán)境。在一個實施方案中，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適用于末端補平的酶對dna進行末端補平。這種酶的實例包括但不限于t4dna聚合酶、klenow酶等。在一個實施方案中，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適用于3’端懸a的酶對dna進行3’端懸a。這種酶的實例包括但不限于taq酶、klenowex-(newenglandbiolabs)(是一種改進的klenow酶，其3’-5’外切活性缺失)等。在本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法中，末端補平和3’端懸a同時進行，這簡化了操作步驟、節(jié)約成本，同時也降低了樣本間的污染。在一個實施方案中，末端補平和3’端懸a所用的溫育時間和溫度可以根據(jù)具體需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)技術(shù)確定。在一個實施方案中，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適用于連接測序接頭的酶。這種酶的實例包括但不限于t4dna連接酶、t7dna連接酶或它們的混合物。本發(fā)明中的測序接頭是與測序平臺匹配的雙鏈測序接頭，是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)技術(shù)可以選擇的。優(yōu)選地，該連接步驟是在緩沖液iii的存在下進行，所述緩沖液iii主要包括50mm氯化鈉(nacl)、10mm三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)、10mm氯化鎂(mgcl2)、0.1％牛血清白蛋白(bsa)。緩沖液iii的存在能夠為連接反應(yīng)提供合適的反應(yīng)環(huán)境，同時維持酶的穩(wěn)定性。在一個實施方案中，在上機測序前可以用商購的試劑盒或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何試劑對根據(jù)本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法所得的測序文庫進行純化。所述測序文庫適用于第二代高通量測序平臺，例如：illumina公司的hiseq/miseq/miniseq/myseq/novaseq測序平臺、thermofisher公司的pgm/proton測序平臺等。在第二個方面，本發(fā)明還提供一種用于構(gòu)建檢測染色體拷貝數(shù)變異的測序文庫的試劑盒，其包括：雙鏈dna片段化酶和緩沖液i、緩沖液ii、用于dna末端補平的酶和用于3’端懸a的酶、測序接頭、連接酶和緩沖液iii，其中緩沖液i、ii和iii的成分如上所述。在一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包括用作陰性對照的dna樣本。陰性對照是指不含染色體拷貝數(shù)變異的正常dna樣本。本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法基本上均通過酶反應(yīng)完成，利用酶易失活的特點以及不同步驟中酶反應(yīng)溫度不同的特點使得可以在單一反應(yīng)管中依次連續(xù)地完成dna隨機片段化、末端補平和3’懸a、以及連接接頭這三個步驟，步驟間無dna純化過程。由于本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法可以在單一反應(yīng)管中完成，因此也避免了dna樣本在轉(zhuǎn)移之中造成的樣本損失以及樣本污染。此外，由于所涉及的試劑種類較少，本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法和試劑盒操作流程較為簡單，具有較好的易操作性。并且，本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法不包含pcr步驟，從而避免了因pcr操作本身帶來的擴增偏好性，最終提高檢測的準(zhǔn)確性。最后，本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法和試劑盒可對低至10ng的樣本dna實現(xiàn)準(zhǔn)確的檢測，即，dna樣本的起始含量比較低。附圖說明圖1：本發(fā)明所述的文庫構(gòu)建方法的示意圖。圖2:采用本發(fā)明的方法構(gòu)建文庫后對待測dna樣本(a)和對照正常樣本(b)進行測序的結(jié)果。圖3：采用本發(fā)明的方法構(gòu)建文庫后對第二個待測dna樣本(a)和對照正常樣本(b)進行測序的結(jié)果。具體實施方式實施例1：根據(jù)本發(fā)明的方法構(gòu)建文庫并用于測序dna樣本根據(jù)本發(fā)明的用于檢測染色體拷貝數(shù)變異的測序文庫的構(gòu)建方法和試劑盒，對以帕陶氏綜合征(t13)為例的染色體非整倍體、以染色體22q11.2微缺失綜合征為例的染色體微缺失進行檢測。具體地，帕陶氏綜合征是第13組染色體中出現(xiàn)第3個染色體引起的，是常見的三體綜合征之一；染色體22q11.2微缺失綜合征是指22號染色體22q11.21-q11.23微小缺失所造成的臨床癥候群，是人類最常見的微缺失綜合征。根據(jù)以下方法檢測樣本dna：1.測定濃度：用qubit熒光計測定待測dna樣本的濃度，使dna樣本的起始含量優(yōu)選為10-260ng。2.構(gòu)建文庫：按照本發(fā)明所述的用于構(gòu)建檢測染色體拷貝數(shù)變異的測序文庫的方法進行文庫構(gòu)建，具體包括以下步驟：(1)取待測dna樣本和陰性對照(即正常dna樣本)在冰上按下表1分別配制反應(yīng)混合物。表1：試劑加入量dna樣本10ng雙鏈dna片段化酶1μl緩沖液i1μleb緩沖液補至10μl混合均勻后，將反應(yīng)體系置于37℃溫育10min。(2)將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)至冰上，加入7μl的緩沖液ii，充分混勻后置于65℃下溫育10min，以滅活雙鏈dna片段化酶。(3)將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)至冰上，加入1.5μlt4dna聚合酶和1.5μltaq酶，用eb緩沖液將體積補至50μl。充分混勻后，在室溫下瞬間離心5s，輕彈去除氣泡。然后將上述反應(yīng)混合物放入普通pcr儀(或恒溫金屬浴)中開始下列溫育步驟：首先37℃，20min，然后72℃，20min，最后4℃，5min。(4)在pcr儀(或恒溫金屬浴)中完成溫育后，將反應(yīng)混合物取出并置于冰上。同時，根據(jù)下表2配制預(yù)混液：表2：試劑加入量緩沖液iii25μlt4dna連接酶1μl將預(yù)混液進行充分混勻后，在室溫下瞬間離心5s。然后將該預(yù)混液加入已經(jīng)完成溫育的反應(yīng)混合物，并加入2μl的測序接頭在反應(yīng)管壁上，然后立即在室溫下瞬間離心5s，快速混勻后，在室溫下瞬間離心5s，并輕彈去除氣泡，再次在室溫下瞬間離心5s。然后將上述反應(yīng)混合物放入pcr儀(或恒溫金屬浴)中開始如下溫育步驟：首先20℃，15min，然后65℃，10min，最后4℃，5min。溫育完成后，即可獲得測序文庫。3.文庫純化和上機測序：使用高通量測序文庫構(gòu)建dna純化試劑盒(磁珠法)(杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司生產(chǎn)，貨號r0022)純化所得測序文庫，純化所得測序文庫，使其總量應(yīng)不低于2fmol。使用nextseqcn500(國械注準(zhǔn)20153400460)測序儀，根據(jù)制造商的說明進行上機測序。4.分析測序結(jié)果：將測序結(jié)果與人類基因組參考序列進行比對，待測樣本和正常樣本的染色體拷貝數(shù)檢測結(jié)果分別如圖2和圖3所示。在圖2和圖3中，縱坐標(biāo)log2(ratio)中ratio是指檢測區(qū)域的拷貝數(shù)與2(二倍體)的比值，橫坐標(biāo)代表整條染色體區(qū)域。其中整條染色體被均勻地分成若干個區(qū)域(bin)，每個點代表一個bin的log2(ratio)值，然后根據(jù)所有點的分布得到趨勢線(灰色實線)。圖中的黑色實線表示染色體的著絲點位置，將染色體分為短臂和長臂。由于目前人類基因組參考序列中尚無可供數(shù)據(jù)分析用的13號染色體短臂和22號染色體短臂的參考序列，因此無法分析13號染色體短臂和22號染色體短臂的相關(guān)測序數(shù)據(jù)，導(dǎo)致在這些區(qū)域沒有相應(yīng)的log2(ratio)值。具體地，圖2示出了待測dna樣本(a)和正常樣本(b)的13號染色體區(qū)域的拷貝數(shù)檢測結(jié)果。從結(jié)果可以看出，待測dna樣本的13號染色體區(qū)域長臂的log2(ratio)值為0.585(＝log21.5)左右，說明至少13號染色體的長臂部分有三個拷貝，即待測dna樣本為帕陶氏綜合征(t13)；而正常樣本的13號染色體區(qū)域的log2(ratio)值均為0(＝log21)，說明13號染色體為二倍體。用snp-array芯片檢測該待測dna樣本，證實確實存在三個拷貝的13號染色體長臂。換言之，本發(fā)明的方法和試劑盒建庫測序的檢測結(jié)果與臨床檢測結(jié)果一致。此外，還使用本發(fā)明的方法和試劑盒對第二個待測dna樣本和正常樣本進行建庫并測序，結(jié)果如圖3所示。從檢測結(jié)果可以看出，待測dna樣本的22號染色體在第20m左右的區(qū)域其log2(ratio)值約為-1(＝log20.5)，說明該區(qū)域為單倍體。將染色體的橫坐標(biāo)與人類基因組參考序列進行比對，發(fā)現(xiàn)上述單倍體區(qū)域為22q11.21-q11.23區(qū)域，即待測dna樣本為染色體22q11.2微缺失綜合征；而正常樣本的22號整條染色體區(qū)域的log2(ratio)值均為0(＝log21)，說明不存在22號染色體22q11.2區(qū)域的缺失。用snp-array芯片檢測該待測dna樣本，證實確實在22號染色體22q11.2區(qū)域具有微小缺失。換言之，本發(fā)明的方法和試劑盒建庫測序的檢測結(jié)果與臨床檢測結(jié)果一致。以上實施例說明，本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法以及相應(yīng)的試劑盒可以用于通過高通量測序來準(zhǔn)確地檢測染色體拷貝數(shù)的變異。實施例2：dna起始含量對測序文庫濃度的影響根據(jù)實施例1所述的構(gòu)建文庫和純化文庫的方法，用起始含量不同的dna樣本制備測序文庫，并測定所得文庫的總量，結(jié)果如下表3所示。表3.dna的起始含量與最終所得文庫的總量。起始dna量(ng)文庫總量(fmol)＜50.142＜50.2＜50.21＜50.108＜50.129＜50.16951.05351.592102.776102.401502.97502.9881002.3181003.111502.4771502.7522002.3482001.7822202.4622201.7582402.0782401.9352602.1492602.2282801.4052801.5852901.9822901.8123001.043000.568從上表可以看出，當(dāng)dna起始含量為10-260ng時，所得文庫的最終總量基本上大于2fmol，滿足測序的需要。當(dāng)濃度過低或過高，所得文庫的濃度均低于2fmol，不是最優(yōu)適合用于測序。因此，在本發(fā)明中，用于制備文庫的起始dna含量優(yōu)選為10-260ng。以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、同等替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。參考文獻nagaokasi,hassoldtj,andhuntpa.humananeuploidy:mechanismsandnewinsightsintoanage-oldproblem.nat.rev.genet.2012,13:493e504norda,salipantesj,pritchardc.chapter11–copynumbervariantdetectionusingnext-generationsequencing.clinicalgenomics,2015,8:165-187yunisj.high-resolutionchromosomeanalysisinclinicalmedicine.prog.clin.pathol.,1978,7:267-288traskbj.humancytogenetics:46chromosomes,46yearsandcounting.nat.rev.genet.2002,3:769e778traskbj.fluoresenceinsituhybridization:applicationincytogeneticsandgenemapping.trendsgnent.1991,7:149-154.manningm,andhudginsl.array-basedtechnologyandrecommendationsforutilizationinmedicalgeneticspracticefordetectionofchromosomalabnormalities.genet.med.2010,12(11):742-745.bremana,pursleyan,hixsonp,biw,wardp,bacinoca,shawc,lupskijr,beaudeta,patela,cheungsw,vandenveyveri:prenatalchromosomalmicroarrayanalysisinadiagnosticlaboratory:experiencewith>1000casesandreviewoftheliterature.prenat.diagn.2012,32:351e361.xuanj,yuy,qingt,guol,shil.next-generationsequencingintheclinic:promisesandchallenges.cancerlett.2013,340(2):284-295.yoons,xuanz,makarovv,yek,sebatj.sensitiveandaccuratedetectionofcopynumbervariantsusingreaddepthofcoverage.genomeres.2009,19(9):1586-1592.mason-suaresh,landryl,leboms.detectingcopynumbervariationvianextgenerationtechnology.curr.genet.med.report.2016,4(3):1-12.v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