本發(fā)明屬于生物技術(shù)構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法。

背景技術(shù)：

人類的pcsk9基因在染色體1p32.3定位，全長為29kb，含有12個(gè)外顯子，cdna全長有3617個(gè)堿基，它的編碼含有692個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，并且其編碼的蛋白質(zhì)被稱為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1(narc-1)，它是一個(gè)獨(dú)特的前蛋白轉(zhuǎn)化酶，而且是屬于絲氨酸蛋白酶k亞類，它能切割非堿性氨基酸，其底物特異性是不同于其它前蛋白轉(zhuǎn)化酶的，它的特定已知底物為前體pcsk9。人類的pcsk9氨基酸序列可以分為前結(jié)構(gòu)域(31～152)、催化結(jié)構(gòu)域(153～451)、信號(hào)肽(1～30)、富含半胱氨酸和組氨酸的c末端區(qū)域(452～692)。pcsk9的前體蛋白可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成一種可溶性酶原，即pcsk9酶原(apo-pcsk9)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中apo-pcsk9(151～152)的殘基處能夠發(fā)生自動(dòng)催化分裂，并且能釋放前肽形成成熟的蛋白酶分泌入血。pcsk9主要是在肝臟和小腸中表達(dá)，但是pcsk9只在肝臟表達(dá)才可分泌入血。

血清低密度脂蛋白(lowdensitylipoproteincholesterol，ldl)水平是衡量血脂水平的主要指標(biāo)，動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要危險(xiǎn)因素是ldl升高，它可以誘發(fā)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。pcsk9是除ldlr、載脂蛋白b-100(apolipoproteinb-100，apob-100)和niemann-pickc1like1(npc1l1))外，又1個(gè)與adh相關(guān)基因，它可以在不影響ldlrmrna水平的情況下，可以在蛋白質(zhì)水平降解ldlr，從而影響ldl的代謝。流行病學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在pcsk9基因的不同部位堿基突變能夠?qū)е?種大不相同的生物學(xué)效應(yīng)。分別是功能獲得型突變和功能確實(shí)型突變，功能獲得型突變能夠增強(qiáng)降解肝細(xì)胞ldlr的能力，從而能使ldl在血液中的清除減少，最終能夠?qū)е赂吣懝檀佳Y的發(fā)生，并且增加冠心病的易感性。功能缺失型突變能夠使pcsk9的正常功能損壞，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞ldlr的增多，并且血液中攝取ldl的降解增加，進(jìn)一步引起低膽固醇血癥，由于在肝脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中pcsk9起重要作用，所以pcsk9目前已經(jīng)成為研發(fā)降脂藥物的熱門靶點(diǎn)。

目前主要采用在體外建立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞系和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)pcsk9，但是沒有出現(xiàn)系統(tǒng)的純化方法的報(bào)道，沒有進(jìn)行純化方法的優(yōu)化，所獲得的pcsk9純度不高，活性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，首次采用三步層析對(duì)重組pcsk9進(jìn)行純化，獲得的重組蛋白純度更高，更加利于研究其功能和性質(zhì)，減少pcsk9抑制劑篩選過程中的干擾。

本發(fā)明還提供了一種重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，包括以下步驟：

s1，真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his的構(gòu)建

根據(jù)人pcsk9基因的cdna序列合成pcsk9基因，然后將pcsk9基因整合入真核表達(dá)載體pcmv-c-his，得到真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his；

s2，cho-k1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)cho-k1細(xì)胞匯合度達(dá)到80％時(shí)，用真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his轉(zhuǎn)染cho-k1細(xì)胞；

s3，細(xì)胞培養(yǎng)、表達(dá)

cho-k1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后傳代培養(yǎng)，在cho-k1細(xì)胞表達(dá)出重組人pcsk9蛋白，得到cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液；

s4，重組人pcsk9蛋白的純化

s41，親和層析

s411，取nisepharoseexcel樹脂，裝配成親和層析柱，用bufferⅰ平衡nisepharoseexcel樹脂；

s412，取cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液，流經(jīng)平衡好的nisepharoseexcel樹脂；

s413，用bufferⅰ繼續(xù)平衡nisepharoseexcel樹脂；

s414，用bufferⅱ洗脫nisepharoseexcel樹脂，收集親和層析洗脫液；

s415，用截留分子量30kd超濾管將親和層析洗脫液濃縮，得到濃縮液；

s42，尺寸排阻層析

s421，取superdex200prepgrade樹脂，裝配成尺寸排阻層析柱，用bufferⅲ平衡superdex200prepgrade樹脂；

s422，用所述濃縮液流經(jīng)superdex200prepgrade樹脂，收集流出液；

s423，用截留分子量30kd超濾管對(duì)15ml流出液進(jìn)行溶液過濾，直至溶液的電導(dǎo)率值小于5ms/cm，棄去濾出液，收集截留液；

s43，陰離子交換層析

s431，取qsepharosefastflow樹脂，裝配成陰離子交換層析柱，bufferⅳ平衡qsepharosefastflow樹脂；

s432，將所述截留液流經(jīng)qsepharosefastflow樹脂；

s433，用bufferⅳ繼續(xù)平衡qsepharosefastflow樹脂；

s434，用bufferⅴ清洗qsepharosefastflow樹脂；

s435，用bufferⅵ洗脫qsepharosefastflow樹脂，收集陰離子交換層析洗脫液；

s436，用截留分子量30kd超濾管對(duì)陰離子交換層析洗脫液進(jìn)行濃縮脫鹽，得到純化的重組人pcsk9蛋白；

其中，bufferⅰ、bufferⅱ均由nah2po4、咪唑、nacl、雙蒸水配制而成，ph均為7.4；bufferⅲ、bufferⅳ、bufferⅴ、bufferⅵ均由nah2po4、nacl、雙蒸水配制而成，ph均為7.4。

優(yōu)選的，上述重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，s411中，用bufferⅰ平衡nisepharoseexcel樹脂的流速為2ml/min；

s412中，取cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液，以2ml/min的流速流經(jīng)平衡好的nisepharoseexcel樹脂；

s413中，用bufferⅰ繼續(xù)平衡nisepharoseexcel樹脂的流速為2ml/min。

優(yōu)選的，上述重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，s421中，取120ml的superdex200prepgrade樹脂，裝配成尺寸排阻層析柱，柱高60cm，柱直徑是16mm，用bufferⅲ平衡superdex200prepgrade樹脂的流速為1ml/min；

s422中，用所述濃縮液流經(jīng)層析柱的流速為1ml/min。

優(yōu)選的，上述重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，s431，取5ml的qsepharosefastflow樹脂，裝配成陰離子交換層析柱，柱高7cm，柱直徑10mm，bufferⅳ平衡qsepharosefastflow樹脂，流速為1ml/min；

s432，將所述截留液以1ml/min的流速流經(jīng)衡qsepharosefastflow樹脂；

s433，用bufferⅳ繼續(xù)平衡qsepharosefastflow樹脂，流速是2ml/min；

s434，用bufferⅴ清洗qsepharosefastflow樹脂，流速為1ml/min。

優(yōu)選的，上述重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，每升bufferⅰ中含有50mmolnah2po4、20mmol咪唑、300mmolnacl，溶劑為雙蒸水，2mnaoh調(diào)ph至7.4；

每升bufferⅱ中含有50mmolnah2po4、500mmol咪唑、300mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mhcl調(diào)ph至7.4；

每升bufferⅲ中含有50mmolnah2po4，150mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4；

每升bufferⅳ中含有50mmolnah2po4，50mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4；

每升bufferⅴ中含有50mmolnah2po4，100mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4；

每升bufferⅵ中含有50mmolnah2po4，500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，具有以下有益效果：

1、可以在兩個(gè)月內(nèi)獲高純度有生物學(xué)活性的重組人pcsk9蛋白，該蛋白的表達(dá)量和純度完全可以支撐pcsk9蛋白抑制劑的前期篩選工作。cho-k1是表達(dá)重組蛋白的常用細(xì)胞系，選用該細(xì)胞系是因?yàn)閏ho-k1便于后續(xù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的放大，cho-k1可以經(jīng)過馴化培養(yǎng)成懸浮細(xì)胞，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。另外本方法首次采用三步層析對(duì)重組pcsk9蛋白進(jìn)行純化，獲得的重組蛋白純度更高，更加利于研究其功能和性質(zhì)，減少pcsk9蛋白抑制劑篩選過程中的干擾。

2、本發(fā)明的方法簡化純化操作程序，固定各純化步驟的詳細(xì)參數(shù)，易于普通技術(shù)人員的操作。

附圖說明

圖1是真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his的雙酶切電泳圖譜；

其中，m泳道為dna分子量marker；1號(hào)泳道為hindⅲ/ecorⅰ對(duì)質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物；2號(hào)泳道為bamhⅰ/ecorⅰ酶切產(chǎn)物；

圖2是三個(gè)陽性克隆細(xì)胞的westernblot分析圖譜；

其中，m泳道為蛋白質(zhì)分子量marker；1號(hào)泳道為1號(hào)克隆細(xì)胞株培養(yǎng)液；2號(hào)泳道為2號(hào)克隆細(xì)胞株培養(yǎng)液；3號(hào)泳道是3號(hào)克隆細(xì)胞株培養(yǎng)液；

圖3是重組人pcsk9蛋白純化電泳鑒定圖；

其中，m泳道是蛋白質(zhì)分子量marker；1號(hào)泳道是nisepharoseexcel純化產(chǎn)物；2號(hào)泳道是superdex200prepgrade純化產(chǎn)物；3號(hào)泳道是qsepharosefastflow純化產(chǎn)物；

圖4是流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面fitc的熒光值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，未注明的實(shí)驗(yàn)材料來源均為市售，由于不涉及發(fā)明點(diǎn)，故不對(duì)其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。

下述實(shí)施例中真核表達(dá)載體pcmv-c-his由黃河科技學(xué)院生物研究中心保存；感受態(tài)細(xì)胞dh5α購自天根生化科技有限公司；cho-k1細(xì)胞、hepg2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自qiagen；各個(gè)限制性內(nèi)切酶hindⅲ、xbaⅰ、bamhⅰ、ecorⅰ、ecorⅰ均購自neb；f12k、胎牛血清、fitc標(biāo)記的ldlr抗體、雙抗、g418等細(xì)胞培養(yǎng)用試劑均購自invitrogen；pcsk9抗體和二抗均購自abcam；nisepharoseexcel樹脂、qsepharosefastflow樹脂、superdex200prepgrade樹脂均購自ge。

本發(fā)明提供了一種重組人pcsk9蛋白在cho-k1細(xì)胞中的表達(dá)純化方法，具體包括以下步驟：

s1，真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his的構(gòu)建

根據(jù)人pcsk9基因的cdna序列合成pcsk9基因，然后將pcsk9基因整合入真核表達(dá)載體pcmv-c-his，得到真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his，具體為：

由genebank中查出人pcsk9基因的cdna序列(nm_174936.3)，送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成獲得pcsk9基因，合成的pcsk9基因和真核表達(dá)載體pcmv-c-his分別用限制性內(nèi)切酶hindⅲ和xbaⅰ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行分別回收純化?；厥斋@得的pcsk9基因和表達(dá)載體片段，將pcsk9基因和表達(dá)載體片段用t4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得陽性克隆，送invitrogen測序。挑選測序正確的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并命名為真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his。分別用hindⅲ/ecorⅰ和bamhⅰ/ecorⅰ對(duì)真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his進(jìn)行雙酶切，酶切圖譜見圖1；瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶與預(yù)期條帶一樣，說明真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his完整，可以進(jìn)行后續(xù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

s2，cho-k1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將濃度為10⁴個(gè)/ml的cho-k1細(xì)胞傳代培養(yǎng)到6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80％時(shí)，按照lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行真核表達(dá)載體pcmv-pcsk9-his轉(zhuǎn)染cho-k1細(xì)胞的操作。

s3，細(xì)胞培養(yǎng)

cho-k1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后傳代培養(yǎng)，在cho-k1細(xì)胞表達(dá)出重組人pcsk9蛋白，得到cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液：

在cho-k1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)胞以1：20密度傳代，待細(xì)胞貼壁以后，更換為含800μg/mlg418的f12k細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每隔三天進(jìn)行一次換液，連續(xù)培養(yǎng)14天，利用克隆環(huán)挑出單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至6孔板時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行westernblot檢測，挑選出陽性克隆進(jìn)行放大培養(yǎng)，在cho-k1細(xì)胞充分表達(dá)出重組人pcsk9蛋白，收集三天的cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液300ml用于后續(xù)純化。三個(gè)陽性克隆細(xì)胞的westernblot分析如圖2所示，均可見清晰的蛋白質(zhì)條帶。

s4，重組人pcsk9蛋白的純化

本方法首次采用三步層析對(duì)重組pcsk9進(jìn)行純化，步驟如下：

s41，親和層析

s411，取10ml的nisepharoseexcel樹脂，裝配成親和層析柱，柱高5cm，柱直徑16mm，用100mlbufferⅰ平衡nisepharoseexcel樹脂，流速為2ml/min；

s412，取300ml的cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液，以2ml/min的流速流經(jīng)平衡好的nisepharoseexcel樹脂；

s413，用100mlbufferⅰ繼續(xù)平衡nisepharoseexcel樹脂，流速為2ml/min；

s414，用150mlbufferⅱ洗脫nisepharoseexcel樹脂，流速為1ml/min，收集親和層析洗脫液；

s415，用截留分子量30kd超濾管將親和層析洗脫液濃縮至500μl(超濾管內(nèi)截留的液體)，得到濃縮液；

s42，尺寸排阻層析

s421，取120ml的superdex200prepgrade樹脂，裝配成尺寸排阻層析柱，柱高60cm，柱直徑是16mm，用600mlbufferⅲ平衡superdex200prepgrade樹脂，流速為1ml/min；

s422，用500μl所述濃縮液流經(jīng)superdex200prepgrade樹脂，流速為1ml/min，70min后，收集流出液15ml；

s423，用截留分子量30kd超濾管對(duì)15ml流出液進(jìn)行溶液過濾，直至溶液的電導(dǎo)率值小于5ms/cm，棄去濾出液，收集截留液；

s43，陰離子交換層析

s431，取5ml的qsepharosefastflow樹脂裝配成陰離子交換層析柱，柱高7cm，柱直徑10mm，50mlbufferⅳ平衡qsepharosefastflow樹脂，流速為1ml/min；

s432，將所述截留液以1ml/min的流速流經(jīng)qsepharosefastflow樹脂；

s433，用50mlbufferⅳ繼續(xù)平衡qsepharosefastflow樹脂，流速是2ml/min；

s434，用50mlbufferⅴ清洗qsepharosefastflow樹脂，流速為1ml/min；

s435，用50mlbufferⅵ洗脫qsepharosefastflow樹脂，流速是1ml/min收集陰離子交換層析洗脫液；

s436，用截留分子量30kd超濾管對(duì)陰離子交換層析洗脫液進(jìn)行濃縮脫鹽，濃縮至500μl，得到純化的含有重組人pcsk9蛋白的濃縮液(超濾管內(nèi)截留的液體)；

含有重組人pcsk9蛋白的濃縮液干燥后，最終獲得95％純度(sds-page檢測)以上的重組人pcsk9蛋白，每升cho-k1細(xì)胞培養(yǎng)液可獲得為1.2mg的重組人pcsk9蛋白。

buffer溶液配制：

bufferⅰ：每升bufferⅰ中含有50mmolnah2po4、20mmol咪唑、300mmolnacl，溶劑為雙蒸水，2mnaoh調(diào)ph至7.4；

bufferⅱ：每升bufferⅱ中含有50mmolnah2po4、500mmol咪唑、300mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mhcl調(diào)ph至7.4；

bufferⅲ：每升bufferⅲ中含有50mmolnah2po4，150mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4；

bufferⅳ：每升bufferⅳ中含有50mmolnah2po4，50mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4；

bufferⅴ：每升bufferⅴ中含有50mmolnah2po4，100mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4；

bufferⅵ：每升bufferⅵ中含有50mmolnah2po4，500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，用2mnaoh調(diào)ph至7.4。

圖3是重組人pcsk9蛋白純化電泳鑒定圖，m:蛋白質(zhì)分子量marker；1是nisepharoseexcel純化產(chǎn)物；2是superdex200prepgrade純化產(chǎn)物；3是qsepharosefastflow純化產(chǎn)物。條帶越少，純度越高，經(jīng)三步純化后，在55-72kd之間可見一明顯條帶，基本無雜帶，純化效果良好。

s5，重組人pcsk9蛋白的活性分析

將hepg2細(xì)胞以10⁴個(gè)/ml的密度傳代到6孔板中，培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液中的胎牛血清更換為人無脂血清，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入純化的重組人pcsk9蛋白，使其濃度達(dá)到50μg/ml，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，培養(yǎng)條件：37℃，5％co2，飽和濕度收集細(xì)胞，0.1m、ph8.0pbs洗2次，加入fitc標(biāo)記的ldlr抗體，冰上孵育20min，pbs洗2次，300μlpbs懸浮細(xì)胞，過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面fitc的熒光值。

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(加入重組人pcsk9蛋白并使?jié)舛葹?0μg/ml、加入fitc標(biāo)記的ldlr抗體)對(duì)應(yīng)圖4中1號(hào)、空白組(以ddh2o替代重組人pcsk9蛋白和fitc標(biāo)記的ldlr抗體)對(duì)應(yīng)圖4中3號(hào)、fitc標(biāo)記組(以ddh2o替代重組人pcsk9蛋白，加入fitc標(biāo)記的ldlr抗體)對(duì)應(yīng)圖4中2號(hào)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的fitc熒光值極顯著減少(p<0.01)(見圖4)，說明pcsk9明顯降低了細(xì)胞表面ldlr的水平，從而證明我們純化的pcsk9具有生物學(xué)學(xué)活性。

本發(fā)明的表達(dá)純化方法與現(xiàn)有技術(shù)的重組人pcsk9蛋白的表達(dá)純化方法相比，可以在兩個(gè)月內(nèi)獲高純度有生物學(xué)活性的重組人pcsk9蛋白，該蛋白的表達(dá)量和純度完全可以支撐pcsk9蛋白抑制劑的前期篩選工作。cho-k1是表達(dá)重組蛋白的常用細(xì)胞系，選用該細(xì)胞系是因?yàn)閏ho-k1便于后續(xù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的放大，cho-k1可以經(jīng)過馴化培養(yǎng)成懸浮細(xì)胞，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。另外本方法首次采用三步層析對(duì)人重組pcsk9蛋白進(jìn)行純化，獲得的重組蛋白純度更高，更加利于研究其功能和性質(zhì)，減少pcsk9蛋白抑制劑篩選過程中的干擾。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。