本發(fā)明屬于分子標記領域，具體涉及一種華北駝絨藜特異性微衛(wèi)星分子標記及其應用。
背景技術：
華北駝絨藜(ceratoidesarborescens)隸屬藜科駝絨藜屬，為中國特有植物，其營養(yǎng)豐富、適口性良好，又兼具有抗旱、抗寒、耐貧瘠等特性，是干旱、半干旱地區(qū)優(yōu)良飼草，也是水土保持、防風固沙、國土整治的重要牧草。因此，華北駝絨藜在改良草地、防止草原“三化”及荒漠草原的提質增效應用中具有重要的意義。對華北駝絨藜的基礎科學研究是對其進行資源管理、種群重建和資源利用等有重要指導意義，但目前對其研究的方向多集中于生理生化等方面，尚缺乏對其進行遺傳多樣性和種群遺傳結構等種質資源遺傳背景調查，種質資源遺傳背景調查結果又進一步指導保護方案的制定和輔助育種等。而了解華北駝絨藜的種質資源遺傳背景，首要工作是針對其開發(fā)高效的特異性的分子標記。
微衛(wèi)星(microsatellite)也稱為ssr(simplesequencerepeats)，是由1～6個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，廣泛分布于真核生物基因組中。由于其有數(shù)量多、特異的pcr擴增、穩(wěn)定性好、在基因組內分布均勻、多態(tài)性信息豐富、易于檢測等特性等諸多優(yōu)點成為近年來應用廣泛的分子標記之一。
技術實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種華北駝絨藜特異性微衛(wèi)星位點，包括t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39核苷酸序列的一種或幾種，所述核苷酸序列如seqidno1～seqidno22所示序列。
本發(fā)明還提供了用于鑒定上述華北駝絨藜微衛(wèi)星位點的特異性引物對，所述特異性引物對的核苷酸序列分別為：
t1引物對序列如seqidno.23和seqidno.24所示；
t6引物對序列如seqidno.25和seqidno.26所示；
t11引物對序列如seqidno.27和seqidno.28所示；
t13引物對序列如seqidno.29和seqidno.30所示；
t15引物對序列如seqidno.31和seqidno.32所示；
t16引物對序列如seqidno.33和seqidno.34所示；
t17引物對序列如seqidno.35和seqidno.36所示；
t20引物對序列如seqidno.37和seqidno.38所示；
t22引物對序列如seqidno.39和seqidno.40所示；
t23引物對序列如seqidno.41和seqidno.42所示；
t25引物對序列如seqidno.43和seqidno.44所示；
t26引物對序列如seqidno.45和seqidno.46所示；
t28引物對序列如seqidno.47和seqidno.48所示；
t29引物對序列如seqidno.49和seqidno.50所示；
t30引物對序列如seqidno.51和seqidno.52所示；
t31引物對序列如seqidno.53和seqidno.54所示；
t34引物對序列如seqidno.55和seqidno.56所示；
t35引物對序列如seqidno.57和seqidno.58所示；
t36引物對序列如seqidno.59和seqidno.60所示；
t37引物對序列如seqidno.61和seqidno.62所示；
t38引物對序列如seqidno.63和seqidno.64所示；
t39引物對序列如seqidno.65和seqidno.66所示。
本發(fā)明的另一目的在于提供用于鑒定華北駝絨藜微衛(wèi)星位點的試劑盒，包括dna聚合酶、dntps、反應緩沖液、引物對與dna模板，其中所述引物對為以下引物對的一種或幾種：
t1引物對序列如seqidno.23和seqidno.24所示；
t6引物對序列如seqidno.25和seqidno.26所示；
t11引物對序列如seqidno.27和seqidno.28所示；
t13引物對序列如seqidno.29和seqidno.30所示；
t15引物對序列如seqidno.31和seqidno.32所示；
t16引物對序列如seqidno.33和seqidno.34所示；
t17引物對序列如seqidno.35和seqidno.36所示；
t20引物對序列如seqidno.37和seqidno.38所示；
t22引物對序列如seqidno.39和seqidno.40所示；
t23引物對序列如seqidno.41和seqidno.42所示；
t25引物對序列如seqidno.43和seqidno.44所示；
t26引物對序列如seqidno.45和seqidno.46所示；
t28引物對序列如seqidno.47和seqidno.48所示；
t29引物對序列如seqidno.49和seqidno.50所示；
t30引物對序列如seqidno.51和seqidno.52所示；
t31引物對序列如seqidno.53和seqidno.54所示；
t34引物對序列如seqidno.55和seqidno.56所示；
t35引物對序列如seqidno.57和seqidno.58所示；
t36引物對序列如seqidno.59和seqidno.60所示；
t37引物對序列如seqidno.61和seqidno.62所示；
t38引物對序列如seqidno.63和seqidno.64所示；
t39引物對序列如seqidno.65和seqidno.66所示。
優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定華北駝絨藜微衛(wèi)星位點的試劑盒，包括2×easytaqpcrsupermix、引物對、dna模板以及超純水；更優(yōu)選地，本發(fā)明用于鑒定華北駝絨藜微衛(wèi)星位點的試劑盒中，包括50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm引物對各0.5ul，使用超純水補齊至15ul；更優(yōu)選地，所述試劑盒的pcr條件為95℃預變性5min；95℃變性30sec，適宜退火溫度下退火30sec，72℃延伸30sec，反應32個循環(huán)；72℃延伸10min；其中，所述適宜的退火溫度為50℃～61℃；最優(yōu)選地，所述適宜的退火溫度為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
優(yōu)選的，所述華北駝絨藜的鑒定包括以下步驟：以前述試劑盒對待測樣品的基因組dna進行pcr擴增，將擴增產物與微衛(wèi)星序列進行對比：若含有上述技術方案所述的至少一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品為華北駝絨藜；若不含有上述技術方案所述的任意一種微衛(wèi)星分子標記，則判定所述待測樣品不是華北駝絨藜。
本發(fā)明的再一方面為提供上述華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法，包括以下步驟：
1)收集華北駝絨藜樣品并提取dna；
2)對步驟1)獲得的dna，構建rna-seqcdna文庫，并對所述rna-seqcdna文庫進行高通量測序；
3)檢測微衛(wèi)星位點并設計微衛(wèi)星位點的引物對；
4)篩選并檢測微衛(wèi)星位點及其特異性引物對。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟1)中提取dna步驟為ctab法；
優(yōu)選地，在本發(fā)明的華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟2)中rna-seqcdna文庫的高通量測序使用luminahiseq3000測序平臺進行高通量測序；
優(yōu)選地，在本發(fā)明的華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟3)中采用batchprimer3在線分析工具對所述步驟2)組裝完成的序列檢測微衛(wèi)星位點序列并在微衛(wèi)星位點的側翼序列上進行引物設計；更優(yōu)選地，所述微衛(wèi)星位點檢測的條件為重復單元為2個堿基時，重復次數(shù)需大于等于6；重復單元為3個堿基時，重復次數(shù)需大于等于5；重復單元為4、5和6個堿基時，重復次數(shù)需大于等于4；更優(yōu)選地，所述微衛(wèi)星位點的特異性引物設計的原則為擴增目的片段為100～200bp，引物gc含量為40～60％，上下游引物退火溫度(tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟4)中篩選所述微衛(wèi)星特異性引物的方法為：使用華北駝絨藜dna對步驟3)獲得的特異性引物對進行pcr擴增并檢測，篩選能夠穩(wěn)定擴增出目標條帶并具有多態(tài)性的引物對；
優(yōu)選地，在本發(fā)明的華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物對的篩選方法中，所述步驟4)中檢測所述微衛(wèi)星特異性引物方法為：使用tamara350熒光分子量標準在abi3730dna測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠對篩選出來的引物對進行基因分型；基因分型的結果使用genmarker軟件進行讀取，并輸入excel文件；使用excelmircosatellitetoolkit程序統(tǒng)計各微衛(wèi)星位點的期望雜合度(expectedheterozygosity,he)、觀測雜合度(observedheterozygosity，ho)和多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以檢測所述微衛(wèi)星位點的多態(tài)性狀況，篩選出上述三個多態(tài)性數(shù)值均大于0.5作為微衛(wèi)星位點的特異引物對。
因此，本發(fā)明提供了華北駝絨藜的微衛(wèi)星位點及其特異性引物在藜科駝絨藜屬植株的基因標記、定位與qtl分析、品種鑒定、種群及進化研究、分子標記輔助育種中的應用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明首次公開了華北駝絨藜的22條特異性微衛(wèi)星序列及22對特異性微衛(wèi)星引物。這些位點在對華北駝絨藜的遺傳多樣性分析、保護遺傳學研究、種質資源調查和輔助育種中起到重要作用，也為研究植物抗旱機制的研究提供基礎材料。
具體實施方式
下面將結合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
1、dna抽提
樣品采集后使用硅膠保存，共使用到32份華北駝絨藜樣品，采集自內蒙古阿拉善左旗。樣品采用ctab法進行dna抽提。
2、建庫、高通量測序及組裝
使用illuminatruseqstrandedtotalrnasampleprepkit(晶能生物技術(上海)有限公司)構建華北駝絨藜的標準rna-seqcdna文庫；采用illuminahiseq3000測序平臺的雙端測序模式對構建的rna-seqcdna文庫進行高通量測序。對經過質量控制分析后的高質量序列進行樣本組裝。序列經組裝后共得到92629個原始序列(unigene)。
3、微衛(wèi)星序列檢測和引物設計
采用batchprimer3在線分析工具對所述步驟2組裝完成的序列檢測微衛(wèi)星位點序列并在微衛(wèi)星位點的側翼序列上進行引物設計；所述微衛(wèi)星位點檢測的條件為重復單元為2個堿基時，重復次數(shù)需大于等于6；重復單元為3個堿基時，重復次數(shù)需大于等于5；重復單元為4、5和6個堿基時，重復次數(shù)需大于等于4；所述微衛(wèi)星位點的引物設計的原則為擴增目的片段為100～200bp，引物gc含量為40～60％，上下游引物退火溫度(tm)在50～60℃之間且差異小于5℃。
在此條件下，共檢測到7534個微衛(wèi)星序列，設計到5978對引物對。
4、微衛(wèi)星引物的初步篩選
在5978對設計成功的引物對中選擇50個引物對進行pcr擴增條件確定。選擇的原則是：優(yōu)選重復堿基單元為2或者3(這類微衛(wèi)星多態(tài)性較高)；優(yōu)選重復序列無堿基變異、無插入或者缺失的；優(yōu)選重復單元數(shù)目大的(但不超過50個)。
使用8個華北駝絨藜樣品的dna為模板，對這50個引物對進行梯度pcr擴增。梯度pcr反應體系如下：50-100ngdna模板,7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超純水補齊至15ul。梯度pcr反應循環(huán)設置如下：95℃預變性5min；95℃變性30sec，45～65℃范圍內12個梯度溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明所述12個梯度優(yōu)選為50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
梯度pcr得到的擴增產物使用2％的瓊脂糖-eb凝膠電泳檢測，選取符合以下條件的引物對作為初步篩選引物對：(1)擴增產物為單一條帶；(2)片段大小符合目的片段大??；(3)在8個個體中均擴增得到一致結果。記錄符合上述條件時的pcr退火溫度，記為該引物對的最適退火溫度。
在此條件下，共得到25個初篩引物對。
4、微衛(wèi)星位點的多態(tài)性檢測
對上述初篩引物對的上游引物5’端加上熒光標記(fam/hex/tamra)，并使用32個華北駝絨藜樣品的dna進行擴增。pcr反應體系為：50-100ngdna模板，7.5ul2×easytaqpcrsupermix(transgenbiotech)，10μm上下游引物各0.5ul，使用超純水補齊至15ul。循環(huán)設置為：95℃預變性5min；95℃變性30sec，最適退火溫度下退火30sec，72℃延伸15sec，反應35個循環(huán)；72℃延伸10min。
擴增產物使用tamara350熒光分子量標準在abi3730dna測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進行基因分型?；蚍治龅慕Y果使用genmarke軟件進行讀取，并輸入excel文件。使用excelmircosatellitetoolkit程序計算期望雜合度(expectedheterozygosity，he)、觀測雜合度(observedheterozygosity，ho)和多態(tài)性信息含量(polymorphicinformationcontent,pic)，以檢測所述微衛(wèi)星位點的多態(tài)性狀況，選擇上述三個多態(tài)性數(shù)值均大于0.5的位點。
最終獲得22個穩(wěn)定的高多態(tài)性微衛(wèi)星位點，所述微衛(wèi)星位點命名為t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39的核苷酸序列分別如seqidno1～seqidno22所示序列；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39引物對依次為：
t1引物對序列如seqidno.23和seqidno.24所示；
t6引物對序列如seqidno.25和seqidno.26所示；
t11引物對序列如seqidno.27和seqidno.28所示；
t13引物對序列如seqidno.29和seqidno.30所示；
t15引物對序列如seqidno.31和seqidno.32所示；
t16引物對序列如seqidno.33和seqidno.34所示；
t17引物對序列如seqidno.35和seqidno.36所示；
t20引物對序列如seqidno.37和seqidno.38所示；
t22引物對序列如seqidno.39和seqidno.40所示；
t23引物對序列如seqidno.41和seqidno.42所示；
t25引物對序列如seqidno.43和seqidno.44所示；
t26引物對序列如seqidno.45和seqidno.46所示；
t28引物對序列如seqidno.47和seqidno.48所示；
t29引物對序列如seqidno.49和seqidno.50所示；
t30引物對序列如seqidno.51和seqidno.52所示；
t31引物對序列如seqidno.53和seqidno.54所示；
t34引物對序列如seqidno.55和seqidno.56所示；
t35引物對序列如seqidno.57和seqidno.58所示；
t36引物對序列如seqidno.59和seqidno.60所示；
t37引物對序列如seqidno.61和seqidno.62所示；
t38引物對序列如seqidno.63和seqidno.64所示；
t39引物對序列如seqidno.65和seqidno.66所示。
所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39；所述t1、t6、t11、t13、t15、t16、t17、t20、t22、t23、t25、t26、t28、t29、t30、t31、t34、t35、t36、t37、t38和t39微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表1。
表1：微衛(wèi)星位點遺傳多樣性檢測結果
由表1數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的用于鑒定的微衛(wèi)星位點的分子標記多態(tài)性數(shù)據(jù)均大于0.5，均可以用于遺傳多樣性調查、種群遺傳結構分析、個體識別以及親緣關系鑒定等遺傳學分析。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
sequencelisting
<110>內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院
<120>一種華北駝絨藜特異性微衛(wèi)星分子標記及其應用
<130>阿斯達
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