本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：心力衰竭是一個重大的公共衛(wèi)生難題，研究顯示：中國35歲以上人群中患病率高達2％，患者約1000萬人，并且每年新增患者50萬例，嚴重威脅我國人民的生命健康安全，隨著人口老齡化，我國的心力衰竭患者數(shù)量還將進一步上升。重組人腦利鈉肽(rhbnp，商品名：新活素)，能夠有效治療心力衰竭等病癥，快速緩解患者呼吸困難、利尿排鈉、拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌、抗心臟重塑，對心臟起到全面保護作用，已被《中國心力衰竭診斷和治療指南(2014年版)》載入并推薦使用?，F(xiàn)階段，重組人腦利鈉肽主要是通過基因重組技術(shù)制備得到，它利用rhbnp基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，然后，分離純化，制劑，最終得到重組人腦利鈉肽產(chǎn)品；其中，發(fā)酵工藝是決定重組人腦利鈉肽產(chǎn)量的關(guān)鍵步驟之一，它直接影響到融合蛋白表達量的高低，如果蛋白表達量過低，將會導(dǎo)致單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本大幅度增加，從而被認為不具有商業(yè)開發(fā)價值，進而也就無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此，為了能夠?qū)崿F(xiàn)重組人腦利鈉肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，降低單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，首要任務(wù)就是開發(fā)一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發(fā)酵工藝。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發(fā)酵工藝。本發(fā)明提供的一種提高重組人腦利鈉肽融合蛋白表達量的發(fā)酵工藝，它包括以下步驟：在發(fā)酵罐中，加入bhd培養(yǎng)基18l～20l和甘油65ml～80ml，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽基因工程菌300ml～500ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量為30％～50％，調(diào)節(jié)ph值為6.8～7.2，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為10～15時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5mmol/l～1.0mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加150ml/h～300ml/h的補料液a，3h～6h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌，即可；其中，所述bhd培養(yǎng)基的配方為：每升bhd培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氫鉀2g～5g、磷酸氫二鉀10g～15g、硫酸鎂0.4g～1g、氯化鈉0.4g～1g、維生素10mg～15mg和微量金屬元素20mg～30mg，溶劑為水；所述補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨150g～200g、酵母粉60g～100g和甘油160ml～220ml，溶劑為水。進一步的，加入bhd培養(yǎng)基18.5l和甘油74ml；或者，加入bhd培養(yǎng)基20l和甘油68ml。進一步的，接種重組人腦利鈉肽基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量為30％～50％，調(diào)節(jié)ph值為7.0。進一步的，當od600為12時，加入異丙基硫代半乳糖苷至其終濃度為0.5mmol/l～1.0mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加200ml/h的補料液a，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)。進一步的，所述bhd培養(yǎng)基的配方為：每升bhd培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨5g、酵母粉10g、磷酸二氫鉀2.31g、磷酸氫二鉀12.54g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.6g、維生素13.68mg和微量金屬元素25.8mg，溶劑為水。進一步的，所述維生素選自泛酸、葉酸、吡哆醇中的一種或兩種以上；所述微量金屬元素選自六水三氯化鐵、四水氯化鋅、六水氯化鈣、五水硫酸銅中的一種或兩種以上。進一步的，所述維生素是由以下重量份數(shù)的組分組成：泛酸10份～12份、葉酸0.05份～0.1份、吡哆醇2.5份～3份；優(yōu)選的，所述維生素是由以下重量份數(shù)的組分組成：泛酸10.8份、葉酸0.08份、吡哆醇2.8份。進一步的，所述微量金屬元素是由以下重量份數(shù)的組分組成：六水三氯化鐵12份～15份、四水氯化鋅2份～5份、六水氯化鈣2份～5份、五水硫酸銅2份～5份；優(yōu)選的，所述微量金屬元素是由以下重量份數(shù)的組分組成：六水三氯化鐵14份、四水氯化鋅4份、六水氯化鈣4份、五水硫酸銅3.8份。進一步的，所述補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨172g、酵母粉86g和甘油200ml，溶劑為水。本發(fā)明還提供了一種用于重組人腦利鈉肽基因工程菌發(fā)酵的bhd培養(yǎng)基，其配方為：每升bhd培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氫鉀2g～5g、磷酸氫二鉀10g～15g、硫酸鎂0.4g～1g、氯化鈉0.4g～1g、維生素10mg～15mg和微量金屬元素20mg～30mg，溶劑為水。本發(fā)明發(fā)酵工藝，采用特定的工藝步驟和工藝條件，以及特定配方的培養(yǎng)基，顯著地提高了rhbnp融合蛋白的表達水平，其表達量高達34.5％～38.3％，具有十分良好的商業(yè)開發(fā)價值；而且，本發(fā)明發(fā)酵工藝穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，便于操作和控制，單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本低，已成功應(yīng)用于重組人腦利鈉肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，累計實現(xiàn)數(shù)百萬支注射用重組人腦利鈉肽產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，取得了商業(yè)上的極大成功。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1為三批重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)后全菌蛋白的sds-page電泳圖譜，其中：m-marker，0-誘導(dǎo)前，1-第一批，2-第二批，3-第三批。具體實施方式本發(fā)明具體實施方式中使用的原料、設(shè)備等均為已知產(chǎn)品，可以通過購買市售產(chǎn)品等方式獲得，例如：重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌：由西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司或成都諾迪康生物制藥有限公司提供，可以通過購買獲得；胰蛋白胨(tryptone)、酵母粉(yeastextract)：為oxoid市售產(chǎn)品。實施例1在發(fā)酵罐中，加入bhd培養(yǎng)基18.5l和甘油74ml，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為50％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為7.0，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600(是指在600nm波長處的吸光值)為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為0.5mmol/l(mmol/l是指毫摩爾/升)誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加200ml/h的補料液a，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，bhd培養(yǎng)基的配方為：每升bhd培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氫鉀(kh2po4)2.31g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)12.54g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)0.6g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達情況，結(jié)果見圖1和表1。表1、發(fā)酵培養(yǎng)后rhbnp融合蛋白表達量批次rhbnp融合蛋白表達量第一批38.3％第二批37.5％第三批37.8％實施例2在發(fā)酵罐中，加入bhd培養(yǎng)基20l和甘油68ml，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為30％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為7.0，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.0mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加200ml/h的補料液a，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，bhd培養(yǎng)基的配方為：每升bhd培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氫鉀(kh2po4)2.31g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)12.54g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)0.6g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結(jié)果為34.5％。實施例3在發(fā)酵罐中，加入bhd培養(yǎng)基18.5l和甘油74ml，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為50％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為7.0，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為0.8mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加200ml/h的補料液a，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，bhd培養(yǎng)基的配方為：每升bhd培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氫鉀(kh2po4)2.31g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)12.54g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)0.6g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結(jié)果為35.8％。對比例1在發(fā)酵罐中，加入lb1培養(yǎng)基18.5l和甘油74ml，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為70％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為6.8，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.5mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加200ml/h的補料液a，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，lb1培養(yǎng)基的配方為：每升lb1培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)10g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結(jié)果為25.6％。對比例2在發(fā)酵罐中，加入lb1培養(yǎng)基18.5l和葡萄糖92g，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為25％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為6.9，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.2mmol/l誘導(dǎo)，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，lb1培養(yǎng)基的配方為：每升lb1培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)10g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金屬元素(六水三氯化鐵14mg、四水氯化鋅4mg、六水氯化鈣4mg、五水硫酸銅3.8mg)，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結(jié)果為19.2％。對比例3在發(fā)酵罐中，加入lb2培養(yǎng)基20l和葡萄糖85g，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為15％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為7.2，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為0.1mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加100ml/h的補料液b，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，lb2培養(yǎng)基的配方為：每升lb2培養(yǎng)基中，含有胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸鎂(mgso4)0.5g、氯化鈉(nacl)10g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)，溶劑為水；補料液b的配方為：每升補料液b中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和葡萄糖250g，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結(jié)果為22.5％。對比例4在發(fā)酵罐中，加入m9ca培養(yǎng)基18.5l和甘油70ml，以及氨芐青霉素至其終濃度為100mg/l，接種重組人腦利鈉肽(rhbnp)基因工程菌400ml，調(diào)節(jié)通氣量使發(fā)酵液中的溶氧量(即d.o.值)為10％，加鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為6.9，培養(yǎng)溫度為37℃；當od600為12時，加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至其終濃度為1.5mmol/l誘導(dǎo)，并向發(fā)酵罐內(nèi)流加180ml/h的補料液a，4h后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細菌；其中，m9ca培養(yǎng)基的配方為：每升m9ca培養(yǎng)基中，含有m9鹽溶液(5×，ph＝7.4)200ml、酪蛋白氨基酸(casaminoacid)2g、葡萄糖5g、維生素(泛酸10.8mg、葉酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)，溶劑為水；補料液a的配方為：每升補料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶劑為水；利用凝膠成像系統(tǒng)，測定重組人腦利鈉肽(rhbnp)融合蛋白表達量，結(jié)果為14.7％。上述結(jié)果表明，本發(fā)明發(fā)酵工藝，采用特定的工藝步驟和工藝條件，以及特定配方的培養(yǎng)基，顯著地提高了rhbnp融合蛋白的表達水平，其表達量高達34.5％～38.3％，具有十分良好的商業(yè)開發(fā)價值；而且，本發(fā)明發(fā)酵工藝穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，便于操作和控制，單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本低，已成功應(yīng)用于重組人腦利鈉肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，累計實現(xiàn)數(shù)百萬支注射用重組人腦利鈉肽產(chǎn)品(商品名：新活素)的生產(chǎn)和銷售，取得了商業(yè)上的極大成功。當前第1頁12