本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物
技術領域：
，具體涉及小分子rnamirna-146a-5p在評估心肌收縮功能的藥物的制備中的用途、在診斷與心肌收縮功能相關的疾病的藥物的制備中的用途以及用于所述用途的試劑盒。
背景技術：
：心力衰竭，簡稱心衰，是指由于心臟的收縮功能和(或)舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，此種障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺淤血、腔靜脈淤血。心力衰竭并不是一個獨立的疾病，而是心臟疾病發(fā)展的終末階段。數(shù)據(jù)顯示，超過50歲以后心臟功能開始呈現(xiàn)下降趨勢，主要表現(xiàn)為左室射血分數(shù)正常的舒張功能下降，其后隨著年齡的逐漸增大，在同時合并其他器質性心臟疾病，最終發(fā)展為心力衰竭，其一年死亡率為21-30％。根據(jù)2015年中國心血管病報告，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農村為44.6％，城市為42.51％。心血管病的疾病負擔日漸加重，已成為重大的公共衛(wèi)生問題。深圳市2015年衛(wèi)生年鑒顯示，心血管疾病作為除腫瘤以外的第二大死因，其中冠心病、心肌梗塞和高血壓心臟病分別排前三位，而這三種疾病的終末期表現(xiàn)均為心力衰竭。只有大約50％的心衰患者被臨床確診，當年齡大于70歲，其心衰死亡率高達90％，心臟衰竭已經成為一種老年病。根據(jù)《深圳市部分醫(yī)療機構2016年前三季度門診住院次均醫(yī)藥費用情況表》顯示三甲醫(yī)院住院次均費用為14862元(以深圳市人民醫(yī)院為例)，其中，心衰由于其反復發(fā)作且每次住院治療天數(shù)相較于其他疾病更長，所以給患者及其家屬造成的經濟負擔和社會壓力更大。雖然，目前診斷心衰的公認的客觀指標為b型利鈉肽和n末端b型利鈉肽原的濃度增高。但是，目前bnp對于各種心血管疾病的診斷仍沒有明確的界值，如對于舒張性心功不全、右心衰竭、老齡患者合并腎功能不全等，還需要個體化評價。對于慢性心衰的左室重塑、血管活性肽與bnp的關系和影響也還有待研究。除此之外，臨床上還會通過臨床指征、心電圖等方法進行診斷和評估，然而據(jù)研究，當舒張功能開始降低的同時伴有收縮功能的減弱，但往往被代償肥大的心肌細胞所掩蓋，造成左心室射血分數(shù)(lvef)值正常，會導致臨床診斷率低，確診時間晚。目前對于衰老心功能的研究主要集中在舒張功能方面，對于早期同時降低的收縮功能的研究幾乎沒有。所以，尋找能反映心肌收縮力的生物標記物，有著及其重要的臨床價值。外泌體(exosome)，是活細胞經過"內吞-融合-外排"等一系列調控過程而形成的膜性囊泡，來源于晚期核內體(也稱為多囊泡體)，直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌體內含蛋白質、脂質以及mirna等成分，可以攜帶蛋白，運送rna，在細胞間物質和信息轉導中起重要作用。研究表明，來源不同細胞的外泌體含有源細胞最關鍵的功能分子。不同細胞來源的外泌體所含的蛋白質及mirna不同，其生物學功能也有差異，血液中的外泌體是一種密度很低的固相成分，被認為攜帶有豐富的生物標志物信息。并且，在人體體液如血清、尿液、組織液等中被外泌體的膜所包裹的rna不會被核酸酶講解，而且不受蛋白，igg等高分豐度蛋白的影響。由于來源于細胞，外泌體所含的物質表征著細胞中的部分物質，也就給檢測細胞內的某些蛋白質與核酸的變化帶來了可能性。目前，可以運用組學手段，通過一定實驗和數(shù)據(jù)分析方法研究樣品中的蛋白質、dna及rna，對比正常個體的樣品數(shù)據(jù)，找到疾病特異性的的分子標志物，為疾病的早期診斷、病因分析、治療靶點、預后情況等提供重要基礎和依據(jù)。近年來，已經有許多疾病，包括某些腫瘤，可以通過對患者血清中的外泌體的檢測，實現(xiàn)早期診斷，同時為療效判斷和預后提供重要依據(jù)。在臨床診斷實踐中，檢測核酸標記物具有靈敏度高、特異性好、可精確定量的特點，很適合作為早期診斷的標志物。microrna(mirna)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小rna，幾個mirnas也可以調節(jié)同一個基因?？梢酝ㄟ^幾個mirnas的組合來精細調控某個基因的表達。因此，具保守估計，約60％～70％的人類蛋白編碼基因受mirna的調控，單個mirna分子能夠與數(shù)百個功能各異的靶mrna相結合而發(fā)揮調節(jié)作用，參與了哺乳動物幾乎所有的病理和生理活動，如個體發(fā)育、組織分化、細胞凋亡以及能量代謝等，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的聯(lián)系。根據(jù)mitchell等人2008年的研究，mirna能以一種非常穩(wěn)定的形式存在于人體血漿中，以保護其免受內源性rnase的降解。同時，chen等通過高通量測序技術對血清中mirna進行了分析，在男、女性健康人血清中分別發(fā)現(xiàn)了100和90種血清mirna，且在惡劣條件(如高溫、極低或極高的ph環(huán)境、多次凍融)下仍能保持穩(wěn)定，而此時大多數(shù)rna都已降解。此外，對正常人和不同疾病患者血清/血漿中mirna檢測結果發(fā)現(xiàn)，mirna廣泛存在于正常人和患者的血清/血漿中，并且隨著生理狀況、疾病種類和病程不同，mirna的表達譜將發(fā)生特異性變化。如，有大量研究表明，在急性心肌梗死動物模型和心肌梗死患者血漿中心肌特異性mirna-133會顯著升高；近年來國內有關研究表明，急性心肌梗死時心肌細胞的mirna-1表達水平明顯升高，并且冠脈病變程度越大，心肌缺血越嚴重，mirna-1表達水平越高，mirna-1和心肌梗死后心肌缺血程度存在顯著相關性。血液中的外泌體被認為攜帶有豐富的生物標記物信息，來源于不同細胞的外泌體含有能提示源細胞功能的關鍵分子，因此，體液中的外泌體在臨床診斷中的意義越來越被人們重視。這也提示我們，可以尋找人類心肌收縮力下降時表達量有明顯改變的mirna標記物，并以此作為生物標記物對心肌細胞的收縮功能進行評估。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供評估心肌收縮功能、診斷與心肌收縮功能相關的疾病的簡單快捷的方法以及相關藥物。在第一方面，本發(fā)明提供了小分子rnamirna-146a-5p在評估受試者心肌收縮功能的藥物的制備中的用途。在本發(fā)明的實施方案中，其中所述小分子rnamirna-146a-5p是血清中外泌體小體內的mirna-146a-5p。在本發(fā)明的實施方案中，其中所述藥物用于定量檢測所述小分子rnamirna-146a-5p的表達量。在本發(fā)明的實施方案中，所述藥物包括基于所述小分子rnamirna-146a-5p設計的引物。在本發(fā)明的實施方案中，所述引物為用于pcr定量或反轉錄的引物。在本發(fā)明的實施方案中，用于pcr定量的所述引物為seqidno：2和seqidno：3。在第二方面，本發(fā)明提供了小分子rnamirna-146a-5p在診斷受試者心臟衰竭的藥物的制備中的用途。在本發(fā)明的實施方案中，所述小分子rnamirna-146a-5p是血清中外泌體小體內的mirna-146a-5p。在本發(fā)明的實施方案中，所述藥物用于定量檢測所述小分子rnamirna-146a-5p的表達量。在本發(fā)明的實施方案中，所述藥物包括基于所述小分子rnamirna-146a-5p設計的引物。在本發(fā)明的實施方案中，所述引物為用于pcr定量或反轉錄的引物。在本發(fā)明的實施方案中，用于pcr定量的所述引物為seqidno：2和seqidno：3。在第三方面，本發(fā)明提供了用于評估心肌功能的試劑盒，其中所述試劑盒包含定量檢測mirna-146a-5p的表達量進行的試劑。在本發(fā)明的實施方案中，所述小分子rnamirna-146a-5p是血清中外泌體小體內的mirna-146a-5p。在本發(fā)明的實施方案中，所述試劑包括基于所述小分子rnamirna-146a-5p設計的引物。在本發(fā)明的實施方案中，所述引物為用于pcr定量或反轉錄的引物。在本發(fā)明的實施方案中，用于pcr定量的所述引物為seqidno：2和seqidno：3。有益效果：1.相對傳統(tǒng)的心臟功能檢查，如臨床指征、超聲影像和實驗室檢查，本發(fā)明具有取材方便、操作簡單、特異性強、快速準確的優(yōu)點，并且能在心臟代償期檢測到心肌收縮功能的下降。本發(fā)明通過對心肌收縮功能個性化的評估，有望實現(xiàn)心衰的早診斷早治療，提高心衰診斷率，從而改善心血管疾病或發(fā)生心衰患者的預后情況。2.本發(fā)明檢測血清/血漿中的穩(wěn)定的mirna，而傳統(tǒng)方法檢測的分子標記物是蛋白多肽。在定量檢測方面，mirna的定量精度和靈敏度非常高，使用rt-pcr技術可以達到分子身段檢測的能力；傳統(tǒng)方法檢測蛋白多肽的精準度和靈敏度都較差。3.傳統(tǒng)標記物可由多種細胞分泌，在不同生理病理狀態(tài)下，都有可能發(fā)生改變，需要進行其他的檢查；本發(fā)明特異性更強，能有效彌補傳統(tǒng)方法的不足。附圖說明通過以下參照附圖對本發(fā)明實施例的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)點將更為清楚，在附圖中：圖1顯示利用qpcr驗證心衰病人血液中外泌體來源的mirna-146a-5p的表達情況；圖2顯示外泌體來源和血液來源的mirna-146a-5p在心衰患者、心臟其他疾病和正常人的表達情況，其中a：血清來源的mirna-146a-5p；b：外泌體來源的mirna-146a-5p；圖3顯示利用roc曲線分析mirna-199a區(qū)分心功能正常組和心衰組時的敏感性和特異性。具體實施方式以下基于實施例對本發(fā)明進行描述，但是本發(fā)明并不僅僅限于這些實施例。實施例1實時熒光定pcr(qpcr)驗證mirna的差異表達所述mirna-146a-5p是血液外泌體來源的mirna-146a-5p，其序列為seqidno：1tgagaactgaattccatgggtt基于seqidno：1設計了以下用于qpcr(熒光定量)的引物：正向引物seqidno：2ccgatgtgtatcctcagctttg反向引物seqidno：3gacagagatatcccagctgaag。選擇心衰患者組、疾病對照組和正常對照組各50例樣本進行如下實驗：1.1rna提取1.1.1外泌體的分離與純化(1)全血3000*g離心15min，移去細胞和細胞碎片；(2)取上層液體移入離心管，加入適量exoquick試劑，4℃下反應30min；優(yōu)選250μl血清中加入63μlexoquick試劑；(3)1500*g離心混合液30min(exosome沉于管下)；(4)吸出上清，離心1500*g5min吸出所有上清(不能震動離心管)；(5)用250μlpbs溶解全部沉淀，-80℃保存。1.1.2總rna的提?、偌尤雝rizol，劇烈震蕩1min，室溫保存10min；②加氯仿0.2ml，劇烈震蕩1min，充分混勻，室溫下放置3min-5min；③4℃，12000rpm高速離心15min后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管中,注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管，加入等體積異丙醇，1-2ul糖原，充分顛倒混勻，于-20℃保存6小時以上(保持離心管豎直狀態(tài))；④4℃，12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液；⑤按1ml/mltrizol的比例加入75％depc冷乙醇洗滌沉淀(-20℃保存)，洗滌沉淀物，充分混合均勻，靜置10min，4℃，12000rpm高速離心10min，棄掉上清液，重復一遍操作；⑥室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入10uldepc水溶解沉淀；⑦用nanodrop2000紫外分光光度計測定rna純度及濃度，凍存于-80℃或直接進行下游實驗。1.2反轉錄37℃孵育1h。然后反應管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特異性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷rna和引物的二級結構。42℃孵育1h。將反轉錄好的樣品進行10倍稀釋后-20℃?zhèn)溆谩?.3qpcr反應采用25μl反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復三次以上以保證結果的可靠性。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量，結果如圖1所示，與心臟其他疾病患者相比，mirna-146a-5p在心衰患者血液中的含量低，同rna-sep結果一致。1.3.1qpcr體系和程序如下：1.3.2跑膠檢驗8％page膠的配制：試劑8％page雙蒸水15.46ml30％聚丙烯酰胺4ml50×tae400μl10％aps140μltemed7μl跑膠條件：160v，25-30min凝膠成像：電泳完成后，從電泳槽中取下膠板，輕輕撬開兩塊玻璃板，并小心將page膠剝離，放入凝膠成像儀中，用核酸染料稀釋液(1:1000)涂抹均勻，孵育5min，凝膠成像。拍照、結果分析1.4結果圖1.與正常組相比，mirna-146a-5p心衰患者組的外泌體中的含量低，同rna測序的結果一致(*p<0.05vs正常組)。圖2.與心臟其他疾病組相比，mirna-146a-5p心衰患者組的外泌體和血液中含量均降低，同rna測序的結果一致(*p<0.05vs正常組；#p<0.05vs疾病對照組)，但是，外泌體的降低幅度，遠遠高于血清中的降低程度，說明外泌體可以很好的指示心衰患者的疾病發(fā)生情況。實施例2：分析mirna對心力衰竭的診斷以上述外泌體來源的mirna-146a-5p為研究對象，將對照組和心衰患者組敏感性和特異性上做比較，以心衰病人為實驗組，心臟其他疾病作為對照組(各組臨床指標參見表1)。表1各組臨床指標統(tǒng)計表*p<0.05vs正常組首先利用exoquic試劑來提取血漿中的外泌體。選用50例心衰血漿樣本，50例心臟其他疾病患者血漿樣本進行外泌體提取，然后進行外泌體內mirna-146a-5pqpcr實驗，求得各標本ct值，利用roc曲線分析顯示，mirna-146a-5p在區(qū)分心衰組和非心衰組時，其auc值為0.897，最佳臨界點時的敏感性為81％、特異性為86％(見圖3)。實驗結果顯示外泌體中mirna作為潛在的診斷標志物的靈敏性和特異性都好于血漿組。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域技術人員而言，本發(fā)明可以有各種改動和變化。凡在本發(fā)明的精神和原理之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。序列表<110>深圳大學<120>小分子rnamirna-146a-5p在相關疾病風險診斷中的應用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>人類序列<400>1tgagaactgaattccatgggtt22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2ccgatgtgtatcctcagctttg22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3gacagagatatcccagctgaag22當前第1頁12