本發(fā)明涉及一種sgrna導(dǎo)向序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近十年來(lái)出現(xiàn)了一種新的研究手段，可以幫助科研人員對(duì)各種細(xì)胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進(jìn)行人工操作。這種新技術(shù)就是我們常說(shuō)的“基因組編輯技術(shù)”，zfn和talen都可以對(duì)dna進(jìn)行各種遺傳修飾，這兩種核酸酶的作用機(jī)制都是先對(duì)dna雙鏈分子進(jìn)行切割，形成dna雙鏈斷裂切口，然后激活細(xì)胞內(nèi)的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制，或者同源重組修復(fù)機(jī)制，利用細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制對(duì)dna進(jìn)行遺傳學(xué)修飾。而最新出現(xiàn)的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)一經(jīng)出現(xiàn)，便得到極大的發(fā)展及應(yīng)用。crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)是基于ii類crispr/cas系統(tǒng)改造而來(lái)的。cas9蛋白是唯一所需要的，用來(lái)介導(dǎo)外源dna沉默的cas蛋白。2013年1月，麻省理工學(xué)院以及哈佛醫(yī)學(xué)院同時(shí)再science上首次發(fā)表了使用crispr/cas系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因編輯。在麻省理工學(xué)院的研究中，使用釀膿鏈球菌的ii類crispr/cas系統(tǒng)，針對(duì)人的emx1位點(diǎn)設(shè)計(jì)的crrna能夠高效的在人的293ft細(xì)胞基因組的emx1位點(diǎn)上產(chǎn)生突變。針對(duì)該基因的不同pam序列設(shè)計(jì)crrna以及crrna與tracrrna嵌合在一起的chirna，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，crrna均能產(chǎn)生有效的突變，但可能由于rna的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并不是所有的chirna都能進(jìn)行高效的位點(diǎn)突變，此外，利用該系統(tǒng)對(duì)基因組進(jìn)行切割后，不僅能夠通過(guò)非同源性末端接合(nhej)的方式進(jìn)行修復(fù)，獲得在切割位點(diǎn)附近的堿基缺失或是插入，還可以通過(guò)同源重組修復(fù)(hdr)的方式，實(shí)現(xiàn)特異基因片段的重組，此外，通過(guò)針對(duì)同一基因的兩個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)crrna，可以成功的進(jìn)行一段片段的基因敲除。使用ruvc結(jié)構(gòu)域突變的cas9蛋白也能夠通過(guò)同源重組的修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)，但無(wú)法獲得非同源性末端接合的突變。哈佛醫(yī)學(xué)院也獲得了類似的結(jié)果，且crispr/cas9系統(tǒng)的基因編輯效率與先前出現(xiàn)的talen效率類似，并能夠同時(shí)針對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯。mc4r是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的與人類顯性遺傳疾病性肥胖相關(guān)的靶位點(diǎn)，yeo等首次在兩例早發(fā)性肥胖患者中發(fā)現(xiàn)了mc4r基因移碼突變后，mc4r在人類能量和體重調(diào)節(jié)中的重要性逐漸地被揭示。人mc4r突變研究表明，其顯性遺傳多由于單體不足所導(dǎo)致，在極少數(shù)個(gè)體中也可出現(xiàn)隱性遺傳的錯(cuò)義突變。mc4r基因突變屬常染色體顯性遺傳，因此該基因具有表型的突變?cè)谌巳褐械陌l(fā)生率較高，迄今有近80例mc4r基因突變導(dǎo)致肥胖的病例報(bào)道，據(jù)估計(jì)bmi大于40的極度肥胖人群中有1％-4％是由于mc4r基因突變所致。在人類由mc4r基因突變引起的肥胖癥其表現(xiàn)型多種多樣，除了多食、肥胖外，并不伴發(fā)其他的內(nèi)分泌代謝異常，甲狀腺、腎上腺和生殖功能正常，不同于其他類型的單基因突變性肥胖。另外，mc4r基因多態(tài)性也可能與體脂分布及脂代謝相關(guān)，體型缺陷mc4r導(dǎo)致的肥胖為青少年發(fā)病型，且女性的嚴(yán)重程度高于男性，其中大多數(shù)患者體脂分布有女性化傾向。在豬中對(duì)mc4r基因d298n突變位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析，大白豬(引入品種)和北京黑豬(培育品種)含d298n位點(diǎn)等位突變所以瘦肉率高，肌內(nèi)脂肪含量低。mc4r基因d298n突變位點(diǎn)很可能與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。以上研究表明mc4r可以作為與豬脂肪沉積性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列及其應(yīng)用，該sgrna導(dǎo)向序列可以用于敲除豬mc4r基因，為制備轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列為mc4r-sgrna1，其核苷酸序列為：5’-tgtgcagtccgtaggtgctg-3’，如seqidno：1所示，位于基因mc4r外顯子。上述特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列在敲除豬mc4r基因中的應(yīng)用，具體方法如下：一、在豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列的5’端加上cacc得到正向寡核苷酸；同時(shí)根據(jù)導(dǎo)向序列獲得得其對(duì)應(yīng)的dna互補(bǔ)鏈，并且再起5’端加上aaac得到反向寡核苷酸；分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸變性，退火，形成雙鏈；二、將步驟一制得的雙鏈dna與crispr/cas9載體連接，得到重組敲除表達(dá)載體；三、將步驟二制得的重組敲除表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到成功敲除igfbp3基因的細(xì)胞。進(jìn)一步的，步驟二中所述的crispr/cas9載體為px330載體。進(jìn)一步的，步驟三中所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。進(jìn)一步的，步驟三中所述篩選所用藥物為嘌呤霉素。進(jìn)一步的，步驟三中所述的細(xì)胞為豬成纖維細(xì)胞。上述特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列在特異識(shí)別和靶向修飾豬mc4r基因中的應(yīng)用。上述特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列在構(gòu)建豬mc4r基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列，能產(chǎn)生基因插入突變、基因序列置換、基因序列缺失等多種類型mc4r基因突變體，可以在構(gòu)建豬mc4r基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明根據(jù)sgrna導(dǎo)向序列設(shè)計(jì)合成兩條單鏈核苷酸序列，退火形成雙鏈，然后與cas9載體連接，利用cas9載體將sgrna及crispr系統(tǒng)引入目標(biāo)細(xì)胞中，cas9蛋白會(huì)在sgrna的引導(dǎo)下找到與其匹配的基因組dna序列，進(jìn)行剪切，實(shí)現(xiàn)豬基因mc4r的敲除。(1)本發(fā)明利用質(zhì)粒載體px330將sgrna以及crispr系統(tǒng)引入細(xì)胞中，cas9蛋白會(huì)在sgrna的引導(dǎo)下找到與其匹配的dna序列，進(jìn)行剪切。質(zhì)粒載體安全性高，不會(huì)引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)。(2)本發(fā)明的載體中含有嘌呤霉素抗性基因，利用嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，未轉(zhuǎn)入px330載體的細(xì)胞將在篩選過(guò)程中被淘汰。(3)本發(fā)明提供的特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列，可通過(guò)crispr/cas9系統(tǒng)敲除或編輯mc4r基因，進(jìn)而消除mc4r的表達(dá)，為制備mc4r轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1是特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列及其位置示意圖。圖2是pcr擴(kuò)增豬mc4r基因外顯子片段電泳圖。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。以下實(shí)施例中所使用的細(xì)胞為原代培養(yǎng)豬成纖維細(xì)胞，px330，pegfp-c1載體購(gòu)自addgene，內(nèi)切酶bbsi，bsmbi購(gòu)自neb，g418和細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自sigma。實(shí)施例1：(1)sgrna設(shè)計(jì)根據(jù)豬mc4r基因的基因組序列(geneid：nm214173)，設(shè)計(jì)1個(gè)靶向豬mc4r基因的sgrna。20nt的寡核苷酸sgrna導(dǎo)向序列為：mc4r-sgrna1:5’-tgtgcagtccgtaggtgctg-3’，位于基因mc4r外顯子編碼區(qū)中；在其5’端加上cacc得到正向寡核苷酸序列；根據(jù)導(dǎo)向序列獲得其對(duì)應(yīng)的dna互補(bǔ)鏈，并且在其5’端加上aaac得到反向寡核苷酸。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的正向和反向sgrna寡核苷酸序列：95℃變性5min，72℃退火10min；退火后可以形成帶有粘性末端的雙鏈dna，具體寡核苷酸序列見(jiàn)表1。表1sgrna導(dǎo)向序列的寡核苷酸序列核苷酸序列(5’至3’)sg1-fcacctgtgcagtccgtaggtgctgsg1-raaaccagcacctacggactgcaca(2)構(gòu)建表達(dá)sgrna的載體質(zhì)粒載體px330載體有bbsi酶切位點(diǎn)，用bbsi酶切，其中，酶切體系為10μl體系：bbsi1μl；10×nebuffer1μl；質(zhì)粒2μl；ddh2o6μl；酶切條件為：37℃酶切過(guò)夜；將酶切后載體px330與步驟(1)制得的退火雙鏈利用t4連接酶進(jìn)行連接，連接體系為10μl體系：px330載體2μl，退火雙鏈sgrna6μl，10nebt4dnaligasebuffer1μl，t4ligase1μl；連接條件為16℃連接過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌dh5α，具體轉(zhuǎn)化方法為：-80℃取出感受態(tài)細(xì)菌dh5α，在冰浴溶解；然后100μl感受態(tài)細(xì)菌中加入10μl的上述連接產(chǎn)物，混勻后冰浴30min；42℃水浴100s熱激活，冰浴2min；然后加入900μlsoc培養(yǎng)基，37℃搖床60min；涂amp+(100μg/ml)固體soc培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆，在soc液體培養(yǎng)基中37℃搖床過(guò)夜，之后用tiangen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，得到表達(dá)sgrna的px330-mc4r-sg1質(zhì)粒載體。實(shí)施例2：(1)豬成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與凍存將豬胎兒置于國(guó)產(chǎn)大皿中加生理鹽水清洗5-6遍，清洗完畢后，去掉胎兒四肢、尾巴、頭和內(nèi)臟。將處理完的胎兒放于進(jìn)口小皿中，用剪刀剪碎，剪至最大的組織塊為1mm3即可終止。加2ml0.25％的edta-trypsin于小皿中，并將小皿放于37度培養(yǎng)箱中消化25min后用4ml培養(yǎng)液dmem/f12(10％fbs)終止消化，并用巴斯德吸管吹打并吸出液體放于15ml離心管中，1000rpm，離心3min。離心完后，棄掉上清，加3ml培養(yǎng)液重懸，平均分在三個(gè)進(jìn)口大皿中，進(jìn)口大皿加8ml培養(yǎng)液dmem/f12(10％fbs)。第二天觀察細(xì)胞狀態(tài)，如細(xì)胞量達(dá)到90％則按照1:3的比例傳代。如細(xì)胞量較少，則進(jìn)行換液即可。一般豬胎兒成纖維細(xì)胞傳至1代長(zhǎng)滿后即可凍存，凍存提前配好凍存液放于度中，再進(jìn)行完常規(guī)的消化后用凍存液重懸，500ul分與凍存管中，并迅速將凍存管放在凍盒中，最后將凍存盒放于-80冰箱中過(guò)夜第二天，將凍存盒中的細(xì)胞導(dǎo)入進(jìn)口液氮罐中即可。(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性細(xì)胞篩選將重組質(zhì)粒px330-mc4r-sg1通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，得到重組細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的具體步驟參見(jiàn)脂質(zhì)體3000(invitrogen，貨號(hào)：11668019)操作說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞利用2μg/ml的嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選持續(xù)48h后進(jìn)行細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)，對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并冷凍保存。(3)基因敲除效果鑒定根據(jù)所設(shè)計(jì)的sgrna序列設(shè)計(jì)鑒定引物，用于對(duì)敲除后目的片段進(jìn)行鑒定，所設(shè)計(jì)的引物如表2所示：表2擴(kuò)增mc4r片段的引物序列序列(5’至3’)mc4r-fcttaaatcaggtcagaggggatctcmc4r-rggagaaagtctcttatgcttgc利用takara公司takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0，codeno.9765.對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行基因組抽提，利用鑒定引物進(jìn)行pcr鑒定。其pcr反應(yīng)體系為50μl體系：基因組dna1μl，2×pcrmix25μl，上下游引物各1μl，ddh2o22μl。pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共33個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸10min。獲得的dna片段命名為mc4r-cds。pcr反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，利用gelextractionkit(takara)進(jìn)行膠回收，對(duì)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果如圖2所示。測(cè)序結(jié)果表明細(xì)胞基因組在基因編輯處發(fā)生了突變，對(duì)照組與野生型基因組進(jìn)行了對(duì)比沒(méi)有發(fā)生變化。本發(fā)明成功建立了敲除mc4r基因的豬成纖維細(xì)胞。當(dāng)前第1頁(yè)12