本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測致病菌的方法，具體為一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多主棒孢是引起黃瓜棒孢葉斑病的病原菌。多主棒孢寄主范圍廣泛，傳播方式多樣。近幾年經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由多主棒孢引起的黃瓜、番茄等蔬菜的葉斑病在中國山東、河北、遼寧、內(nèi)蒙古等11個(gè)省市區(qū)大面積發(fā)生，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。20世紀(jì)末，黃瓜棒孢葉斑病在遼寧省瓦房店市爆發(fā)，嚴(yán)重危害黃瓜的生產(chǎn)。目前，該病已成為保護(hù)地黃瓜的重要葉部病害之一。黃瓜棒孢葉斑病病斑初期為小黃斑，逐漸擴(kuò)大至近圓形，淺棕色，邊緣較薄呈棕色，條件適宜時(shí)病斑迅速擴(kuò)展，邊緣呈現(xiàn)水浸狀，嚴(yán)重時(shí)多個(gè)病斑連成片，并可蔓延至葉柄、莖蔓，造成果實(shí)流膠，干燥時(shí)造成穿孔。黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生初期癥狀極易與黃瓜細(xì)菌性角斑病和霜霉病混淆，后期不易與炭疽病區(qū)分，現(xiàn)階段缺乏對黃瓜棒孢葉斑病菌的快速檢測技術(shù)，給田間及時(shí)防控造成困難。多主棒孢檢測方法包括pcr檢測、免疫檢測以及彩色圖像檢測等，并已成功應(yīng)用于其遺傳多樣性等方面的研究。現(xiàn)有的免疫檢測方法一般以多主棒孢寄主選擇性毒素蛋白為抗原制備單克隆抗體，操作較為復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本較高?；谟?jì)算機(jī)彩色圖像的檢測方法由于拍攝狀態(tài)和光照等環(huán)境因素、發(fā)病程度及病斑的典型性不同，均可能對檢測準(zhǔn)確率產(chǎn)生影響。多主棒孢的pcr檢測方法報(bào)道較少，現(xiàn)有方法所選用的對照菌株僅3～4株，引物特異性需進(jìn)一步驗(yàn)證，檢測技術(shù)尚不完善。同時(shí)，已有的黃瓜棒孢葉斑病菌pcr檢測方法未能直接將黃瓜棒孢葉斑病菌與黃瓜霜霉病菌、炭疽病菌、細(xì)菌性角斑病菌加以區(qū)分。因此建立準(zhǔn)確、快速、靈敏、實(shí)用的黃瓜棒孢葉斑病菌檢測方法非常必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，建立準(zhǔn)確、快速、靈敏、實(shí)用的黃瓜棒孢葉斑病菌檢測方法，本發(fā)明提供了一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾。表1分子標(biāo)記序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fnh2-gcgtgcaaggccggtttcgc1p1-rggcgagtccttctggcccat2p2-fnh2-cgaaggtgaacatcataga3p2-rgagatttccaaaagggcat4p3-fnh2-cgtgcaagcagattacggt5p3-rgcagccctcatggattt6所述的分子標(biāo)記在制備檢測黃瓜棒褒葉斑病菌試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的步驟包括：(1)取樣：提取黃瓜葉片樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記能夠準(zhǔn)確、快速、靈敏、實(shí)用的檢測黃瓜棒孢葉斑病菌；(2)本發(fā)明所述分子標(biāo)記對病原菌的檢測具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)應(yīng)用于發(fā)病植株中黃瓜棒孢葉斑病菌的快速檢測。附圖說明圖1是實(shí)施例1～3檢測結(jié)果圖；其中，m為分子量為1200bp的maker；1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾。所述的分子標(biāo)記在制備檢測黃瓜棒褒葉斑病菌試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的步驟包括：(1)取樣：提取黃瓜葉片樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例2一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾。所述的分子標(biāo)記在制備檢測黃瓜棒褒葉斑病菌試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的步驟包括：(1)取樣：提取黃瓜葉片樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋400倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋80倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例3一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾。所述的分子標(biāo)記在制備檢測黃瓜棒褒葉斑病菌試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的步驟包括：(1)取樣：提取黃瓜葉片樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州蔻美新材料有限公司<120>一種用于檢測黃瓜棒褒葉斑病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcgtgcaaggccggtttcgc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ggcgagtccttctggcccat20<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cgaaggtgaacatcataga19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4gagatttccaaaagggcat19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5cgtgcaagcagattacggt19<210>6<211>17<212>dna<213>人工序列<400>6gcagccctcatggattt17當(dāng)前第1頁12