本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)精深加工領(lǐng)域，具體涉及一種具有改善記憶功效的多肽及其分離制備方法和用途。

背景技術(shù)：

研究表明，阿茲海默癥(alzheimer’sdiseases,ad)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其會(huì)導(dǎo)致人們?cè)谀挲g增長(zhǎng)的過(guò)程中，逐漸喪失認(rèn)知功能。到目前為止，科研工作者們發(fā)現(xiàn)人類(lèi)退行性疾病的病理非常復(fù)雜。在眾多病例中，研究對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用已成為人們預(yù)防、改善或治療神經(jīng)退行性疾病的突破點(diǎn)。

氧化應(yīng)激加劇或人體機(jī)能老化均會(huì)損傷人體大腦中神經(jīng)細(xì)胞，從而降低細(xì)胞活力。因此，為神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)成分，或添加功能活性成分，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化、抗炎癥能力，增強(qiáng)細(xì)胞存活率，對(duì)于提高、改善認(rèn)知能力具有很重要的意義。

另外，部分食物來(lái)源活性成分已成為預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病及抑郁等病癥的潛在目標(biāo)。尤其是對(duì)于老年癡呆癥，日常飲食治療更能避免藥物干預(yù)治療的不利因素。此外，食物蛋白來(lái)源的肽類(lèi)物質(zhì)，因具有來(lái)源穩(wěn)定、價(jià)格低廉、制備工藝簡(jiǎn)單、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有改善記憶功效的多肽，其氨基酸序列為tyr-ser-gly-val-cys。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述多肽的分離制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述多肽的用途。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種多肽，其氨基酸序列為tyr-ser-gly-val-cys；

所述的多肽分子量為527.20da。

上述多肽的分離制備方法，包括如下步驟：

(1)將鳳尾魚(yú)去頭去內(nèi)臟，絞成肉糜，加水混合，加入占肉糜質(zhì)量0.5～1.2％的混合酶，在45～60℃下酶解6～10h后，滅酶，冷卻至室溫后，離心，過(guò)濾收集濾液，為鳳尾魚(yú)酶解液；

步驟(1)所述的加水混合，水與肉糜的質(zhì)量比為(1～3):1；

步驟(1)所述的混合酶，由木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成；其中，木瓜蛋白酶占肉糜質(zhì)量的0.2～0.5％，堿性蛋白酶占肉糜質(zhì)量的0.3～0.7％；所述的堿性蛋白酶優(yōu)選alcalase2.4l；

步驟(1)所述的滅酶是將反應(yīng)物在95℃下加熱15min；

步驟(1)所述的離心優(yōu)選在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min；

(2)將鳳尾魚(yú)酶解液添加至sephadexg-25凝膠柱，用去離子水以0.5～1.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，收集各洗脫峰并測(cè)定其對(duì)受損pc12細(xì)胞存活率的影響，選取使得受損pc12細(xì)胞存活率最高的洗脫峰所對(duì)應(yīng)的組分進(jìn)行下一步分離；

(3)采用反相高效液相色譜對(duì)步驟(2)選取的目標(biāo)組分進(jìn)一步純化，收集各洗脫峰并測(cè)定其對(duì)受損pc12細(xì)胞存活率的影響，使得受損pc12細(xì)胞存活率最高的洗脫組分即為本發(fā)明的多肽tyr-ser-gly-val-cys；

步驟(3)所述的反相高效液相色譜優(yōu)選以下參數(shù)：waterse2695hplc，2998pda檢測(cè)器，色譜柱為xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm，5μm,waters,usa)，流動(dòng)相為a相和b相；a相是質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的三氟乙酸超純水溶液，b相為甲醇；

洗脫程序?yàn)椋?-1min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為(95:5)-(90:10)；1-35min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為(95:5)-(60:40)或(90:10)-(70:30)；35-36min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為60:40；36-40min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為(60:40)-(95:5)或(60:40)-(90:10)，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。

步驟(2)和(3)中所述的受損pc12細(xì)胞存活率的測(cè)定方法如下：

pc12細(xì)胞(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株)培養(yǎng)采用prim1640培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中添加5％胎牛血清和5％的馬血清及雙抗，在37℃和5％co2環(huán)境下培養(yǎng)；將傳代后的細(xì)胞鋪于96孔板，細(xì)胞密度為1.0×10⁵每孔，培養(yǎng)24h后，加入2ml洗脫液培養(yǎng)24h后加入30mm谷氨酸進(jìn)行損傷，損傷時(shí)間為24h；在損傷時(shí)間結(jié)束后，加入0.5mg/mlmtt，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，加入150μldmso，在550nm下測(cè)定吸光值；細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：

細(xì)胞存活率(％)＝(asample-ablank)/(acontrol-ablank)×100％

其中，asample、ablank、acontrol分別代表550nm波長(zhǎng)檢測(cè)下，樣品、pbs空白以及正常對(duì)照組的吸光值。

上述測(cè)定方法又稱(chēng)mtt法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

本發(fā)明的多肽可用于制備具有改善記憶功效的藥品、保健品或食品。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明多肽所用的原料為鳳尾魚(yú)，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，目前鳳尾魚(yú)多用作制作魚(yú)罐頭，現(xiàn)在將其作為原料，開(kāi)發(fā)成改善記憶肽，可顯著提高鳳尾魚(yú)的附加值。

(2)本發(fā)明采用生物酶解技術(shù)及色譜分離技術(shù)制備出一種具有明顯改善記憶作用的蛋白肽，制備方法簡(jiǎn)單可行，制得的產(chǎn)品純度高。

(3)本發(fā)明提供的改善記憶肽的生物活性?xún)?yōu)良，具有良好的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，可以作為功能性成分，用于保健品中。

(4)本發(fā)明提供的改善記憶肽為五肽產(chǎn)品，其肽分子量小，可被人體直接吸收。

(5)本發(fā)明得到的五肽產(chǎn)品，通過(guò)化學(xué)合成并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果。

附圖說(shuō)明

圖1為鳳尾魚(yú)酶解產(chǎn)物的sephadexg-25凝膠色譜分離洗脫曲線。

圖2為鳳尾魚(yú)酶解產(chǎn)物sephadexg-25凝膠色譜洗脫組分對(duì)受損pc12細(xì)胞的存活率影響。

圖3為凝膠色譜目標(biāo)收集組分的反相高效液相色譜分離洗脫曲線。

圖4反相高效液相色譜分離洗脫組分對(duì)受損pc12細(xì)胞的存活率影響。

圖5為改善記憶肽的氨基酸序列質(zhì)譜分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例

一種改善記憶的多肽，由以下步驟制得：

(1)將鳳尾魚(yú)去頭去內(nèi)臟，過(guò)絞肉機(jī)絞成肉糜，加入肉糜質(zhì)量2倍的水，加入鳳尾魚(yú)肉糜質(zhì)量0.25％的木瓜蛋白酶0.25％的alcalase2.4l，在55℃下保溫水解7h，酶解結(jié)束后在95℃溫度下加熱15min進(jìn)行滅酶，冷卻至室溫后，在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，過(guò)濾收集濾液，獲得鳳尾魚(yú)酶解液；

(2)采用sephadexg-25凝膠柱對(duì)鳳尾魚(yú)酶解液進(jìn)行分離純化，用去離子水以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，洗脫曲線如圖1，共收集到6個(gè)洗脫峰，通過(guò)測(cè)定各洗脫峰對(duì)受損pc12細(xì)胞存活率的影響(圖2)，發(fā)現(xiàn)組分fr.4活性最高，選取fr.4組分進(jìn)入反相高效液相色譜(waterse2695hplc，2998pda檢測(cè)器)進(jìn)一步純化，色譜柱為xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm,5μm,waters,usa)，流動(dòng)相為a相(0.1％的三氟乙酸超純水溶液)和b相(乙腈)，洗脫程序?yàn)椋?-1min內(nèi)a:b為90:10(體積比，下同),1-35min內(nèi)a:b為90:10-70:30，35-36min內(nèi)a:b為70:30，36-40min內(nèi)a:b為70:30-90:10，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，洗脫曲線見(jiàn)圖3，共收集到10個(gè)峰，通過(guò)測(cè)定各洗脫峰對(duì)受損pc12細(xì)胞存活率的影響(圖4)，發(fā)現(xiàn)組分f5活性最高，收集組分f5，得到改善記憶肽。

(3)最后采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)組分f5進(jìn)行序列分析(圖5)，測(cè)得改善記憶肽的氨基酸序列為tyr-ser-gly-val-cys。

本發(fā)明多肽的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)如下所示：

pc12細(xì)胞(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株)培養(yǎng)采用prim1640培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中添加5％胎牛血清和5％的馬血清及雙抗，在37℃和5％co2環(huán)境下培養(yǎng)；將傳代后的細(xì)胞鋪于96孔板，細(xì)胞密度為1.0×10⁵每孔，培養(yǎng)24h后，加入2ml洗脫液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入30mm谷氨酸進(jìn)行損傷，損傷時(shí)間為24h；在損傷時(shí)間結(jié)束后，加入0.5mg/mlmtt，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，加入150μldmso，在550nm下測(cè)定吸光值；細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：

細(xì)胞存活率(％)＝(asample-ablank)/(acontrol-ablank)×100％

其中，asample，ablank，acontrol分別代表550nm波長(zhǎng)檢測(cè)下，樣品，pbs空白以及正常對(duì)照組的吸光值。

本發(fā)明制備的改善記憶肽及腦活素(cerebrolysin)對(duì)受損的pc12細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)表1。

表1改善記憶肽及腦活素對(duì)受損pc12細(xì)胞的影響

注：改善記憶肽及腦活素濃度均為1mg/ml。

已有文獻(xiàn)表明，由于人體機(jī)能老化導(dǎo)致的記憶下降多與神經(jīng)細(xì)胞的損傷及凋亡相關(guān)。由表1可知本發(fā)明的改善記憶肽具有優(yōu)秀的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，具有潛在改善大腦中神經(jīng)遞質(zhì)紊亂狀態(tài)并降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的作用，表明發(fā)明提供的改善記憶肽具有很強(qiáng)的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能，可用于藥品、保健品和食品等行業(yè)中。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。