本發(fā)明涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，屬于細胞工程技術領域。
背景技術：
間質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，mscs)來源于中胚層，也稱多能間充質(zhì)基質(zhì)細胞(multipotentmesenchymalstromalcells)，為多能干細胞的一種，它最早發(fā)現(xiàn)于骨髓中，具有向三種胚層細胞分化的多向分化潛能，具有低免疫原性、不刺激產(chǎn)生同種異體免疫反應、不被細胞毒性t細胞和nk細胞殺傷，以及免疫調(diào)節(jié)作用。mscs在相應的誘導條件下能分化為骨、脂肪、軟骨、肌肉和肝細胞等不同類型細胞。臍帶間充質(zhì)干細胞是一類存在于人臍帶中，具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞群。它取材方便，來源廣泛，其使用屬“廢物利用”，不受倫理、道德限制，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源，特別能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來新的希望。已經(jīng)證明其能被誘導分化為成骨細胞、胰島分泌細胞和類肝細胞等,并在免疫抑制治療方面具有積極的臨床應用前景，然而其臨床應用必須以在體外獲得高數(shù)量和高純度的臍帶間充質(zhì)干細胞為基礎。
細胞培養(yǎng)基是決定細胞體外生長代謝最重要、最直接的環(huán)境因素。目前大多數(shù)合成細胞培養(yǎng)基均需要補充動物血清才能支持細胞的體外生長、增殖，而動物血清的使用帶來了動物性病原微生物污染培養(yǎng)物的可能，因此推動了動物細胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展。同時，我國對血制品管理嚴格，成人ab血清不易獲得且價格昂貴。動物血清如胎牛血清，對人類而言，存在異種蛋白抗原和攜帶在人類致病的未知病毒等危險，從而限制了臍帶mscs在臨床的應用。
現(xiàn)有技術中，尚未見到有關于人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的報道。
技術實現(xiàn)要素：
針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，其不含動物源成分，可以完全實現(xiàn)無血清培養(yǎng)干細胞。采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，可在體外獲得高數(shù)量、高純度并且安全優(yōu)質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細胞，同時可提高細胞存活率，維持干細胞的特性。本發(fā)明可解決細胞數(shù)量不夠的問題，且每批次的細胞數(shù)量、存活率及免疫表型更加穩(wěn)定。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
一種人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，是由以下濃度的組分組成的，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸100～300；
cuso4·5h2o0.0005～0.005；
l-天門冬酰胺25～75；
l-天門冬氨酸10～30；
l-谷氨酸10～30；
ni(no3)2·6h2o0.00002～0.0002；
l-谷氨酰胺0～500；
znso4·7h2o0.06～0.6；
甘氨酸5～15；
cocl2·6h2o0.001～0.008；
l-組氨酸10～30；
nasio3·9h2o0.001～0.01；
l-異亮氨酸25～75；
na3vo4·12h2o0.0005～0.005；
l-賴氨酸鹽酸20～60；
sncl2·2h2o0.00001～0.0001；
l-蛋氨酸10～30；
na2seo30.002～0.01；
l-苯丙氨酸10～30；
feso4·7h2o0.2～1.6；
l-脯氨酸10～30；
葡萄糖1000～4000；
l-絲氨酸15～45；
維生素c0.176～0.704；
l-蘇氨酸10～30；
對羥基苯甲酸0.5～1.5；
l-色氨酸5～15；
丙酮酸鈉55～550；
l-纈氨酸10～30；
亞油酸0.01～0.05；
l-亮氨酸25～75；
β-巰基乙醇0.8～4.0；
二水l-酪氨酸二鈉144～432；
乙醇胺1～5；
l-胱氨酸二鹽酸25～75；
地塞米松0.001～0.005；
人轉(zhuǎn)鐵蛋白5～50；
人血清白蛋白1000～5000；
纖粘連蛋白0.5～5；
重組人成纖維細胞生長因子0.1～10；
重組人轉(zhuǎn)化因子β0.1～10；
重組人表皮生長因子0.1～10；
胰島素：8～20；
純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白液：1～30；
膽固醇：20～60；
過氧化氫酶：20～50；
亞硒酸鈉：17.3～35.0；
1％(質(zhì)量百分數(shù))二巰基乙醇溶液：0.35～1.0ml/l；
余量為水。
所述重組人成纖維細胞生長因子、重組人轉(zhuǎn)化因子、重組人表皮生長因子均可市場購買得到，本發(fā)明所用為進口產(chǎn)品，均購自peprotech，商品名稱為：egf(重組人表皮生長因子)，商品號為af-100-15-50；商品名稱為tgf-b(重組人轉(zhuǎn)化因子)，貨號：100-21-100；商品名為(fgf)成纖維細胞生長因子，商品貨號：100-18b-50。
本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基的制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
本發(fā)明的人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，不含任何血清組分，且成分明確，克服了異種蛋白污染和致病微生物的危險,解決了mscs臨床應用的生物安全性問題。
采用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，可在體外獲得高數(shù)量、高純度并且安全優(yōu)質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細胞，同時可提高細胞存活率，維持干細胞的特性。本發(fā)明可解決細胞數(shù)量不夠的問題，且每批次的細胞數(shù)量、存活率及免疫表型更加穩(wěn)定，符合相關指標要求。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。
實施例1制備人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基
各原料的濃度如下，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸200；
cuso4·5h2o0.002；
l-天門冬酰胺50；
l-天門冬氨酸20；
l-谷氨酸20；
ni(no3)2·6h2o0.0001；
l-谷氨酰胺300；
znso4·7h2o0.3；
甘氨酸10；
cocl2·6h2o0.005；
l-組氨酸20；
nasio3·9h2o0.005；
l-異亮氨酸50；
na3vo4·12h2o0.002；
l-賴氨酸鹽酸40；
sncl2·2h2o0.00005；
l-蛋氨酸20；
na2seo30.005；
l-苯丙氨酸20；
feso4·7h2o1.0；
l-脯氨酸20；
葡萄糖3000；
l-絲氨酸30；
維生素c0.500；
l-蘇氨酸20；
對羥基苯甲酸1.0；
l-色氨酸10；
丙酮酸鈉300；
l-纈氨酸20；
亞油酸0.03；
l-亮氨酸50；
β-巰基乙醇2.0；
二水l-酪氨酸二鈉300；
乙醇胺3；
l-胱氨酸二鹽酸50；
地塞米松0.003；
人轉(zhuǎn)鐵蛋白30；
人血清白蛋白2500；
纖粘連蛋白3；
重組人成纖維細胞生長因子5；
重組人轉(zhuǎn)化因子β5；
重組人表皮生長因子5；
胰島素：10；
純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：20；
膽固醇：40；
過氧化氫酶：30；
亞硒酸鈉：25.0；
1％二巰基乙醇溶液：0.8ml/l；
余量為水。
制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
實施例2制備人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基
各原料的濃度如下，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸100；
cuso4·5h2o0.0005；
l-天門冬酰胺75；
l-天門冬氨酸30；
l-谷氨酸10；
ni(no3)2·6h2o0.00002；
l-谷氨酰胺500；
znso4·7h2o0.6；
甘氨酸5；
cocl2·6h2o0.001；
l-組氨酸30；
nasio3·9h2o0.01；
l-異亮氨酸25；
na3vo4·12h2o0.0005；
l-賴氨酸鹽酸60；
sncl2·2h2o0.0001；
l-蛋氨酸10；
na2seo30.002；
l-苯丙氨酸30；
feso4·7h2o1.6；
l-脯氨酸10；
葡萄糖1000；
l-絲氨酸45；
維生素c0.704；
l-蘇氨酸10；
對羥基苯甲酸0.5；
l-色氨酸15；
丙酮酸鈉550；
l-纈氨酸10；
亞油酸0.01；
l-亮氨酸75；
β-巰基乙醇4.0；
二水l-酪氨酸二鈉144；
乙醇胺1；
l-胱氨酸二鹽酸75；
地塞米松0.005；
人轉(zhuǎn)鐵蛋白5；
人血清白蛋白1000；
纖粘連蛋白5；
重組人成纖維細胞生長因子10；
重組人轉(zhuǎn)化因子β0.1；
重組人表皮生長因子0.1；
胰島素：20；
純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：30；
膽固醇：20；
過氧化氫酶：20；
亞硒酸鈉：35.0；
1％二巰基乙醇溶液：1.0ml/l；
余量為水。
制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
實施例3制備人臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基
各原料濃度如下，各濃度單位若無特別說明，均為mg/l：
l-精氨酸300；
cuso4·5h2o0.005；
l-天門冬酰胺25；
l-天門冬氨酸10；
l-谷氨酸30；
ni(no3)2·6h2o0.0002；
l-谷氨酰胺0；
znso4·7h2o0.06；
甘氨酸15；
cocl2·6h2o0.008；
l-組氨酸10；
nasio3·9h2o0.001；
l-異亮氨酸75；
na3vo4·12h2o0.005；
l-賴氨酸鹽酸20；
sncl2·2h2o0.00001；
l-蛋氨酸30；
na2seo30.01；
l-苯丙氨酸10；
feso4·7h2o0.2；
l-脯氨酸30；
葡萄糖4000；
l-絲氨酸15；
維生素c0.176；
l-蘇氨酸30；
對羥基苯甲酸1.5；
l-色氨酸5；
丙酮酸鈉55；
l-纈氨酸30；
亞油酸0.05；
l-亮氨酸25；
β-巰基乙醇0.8；
二水l-酪氨酸二鈉432；
乙醇胺5；
l-胱氨酸二鹽酸25；
地塞米松0.001；
人轉(zhuǎn)鐵蛋白50；
人血清白蛋白5000；
纖粘連蛋白0.5；
重組人成纖維細胞生長因子0.1；
重組人轉(zhuǎn)化因子β10；
重組人表皮生長因子10；
胰島素：8；
純化人轉(zhuǎn)鐵蛋白：1；
膽固醇：60；
過氧化氫酶：50；
亞硒酸鈉：17.3；
1％二巰基乙醇溶液：0.35ml/l；
余量為水。
制備方法為：取上述除水外的組分，根據(jù)其各自溶解特性分類溶解，然后混合，加入水使各組分終濃度如上所述，調(diào)節(jié)ph值至7.1～7.4，即得，工業(yè)濾芯過濾，同時氮氣保護進行分裝(避免不穩(wěn)定性成分被氧化)。
實驗
將實施例2制備的培養(yǎng)基置于t25細胞培養(yǎng)瓶中，將臍帶間充質(zhì)干細胞以1.0×104cells/cm2接種，在溫度37℃下培養(yǎng)，統(tǒng)計原代細胞的爬出時間，每代的生長時間。
同時，以lonza無血清培養(yǎng)基(市場購買得到)為對照培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞。
結論：
原代細胞爬出時間：通常的細胞培養(yǎng)基進行臍帶植塊法爬細胞，8～10天可見細胞爬出，而本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，爬出細胞時間縮短至7天,提高了細胞分離效率。
細胞每代生長時間，經(jīng)過連續(xù)10代監(jiān)測，平均每代生長時間在2～3天，比lonza無血清培養(yǎng)基提高了一天，節(jié)約了培養(yǎng)時間，提高了工作效率。
連續(xù)傳代次數(shù)：傳統(tǒng)的msc無血清培養(yǎng)基傳代至6代以后，細胞生長變緩慢，本發(fā)明的培養(yǎng)基可連續(xù)傳代至10代，細胞仍保持其分化潛能，而lonza培養(yǎng)基傳代至第8代，細胞生長明顯變緩，導致后期無法傳代。
上述雖然結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。