本發(fā)明涉及一種低聚龍膽糖的制備方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

低聚龍膽糖是葡萄糖以β-1，6糖苷鍵結(jié)合而形成的新型功能性低聚糖，包括龍膽二糖，少量的三糖和四糖。低聚龍膽糖不被人體的酶所降解，低熱量，適合肥胖癥、高血脂、高血壓、糖尿病等人群食用；其還具有高保濕性和吸濕性，有利于保持食品中的水分，可防止淀粉類食品的老化；同時(shí)低聚龍膽糖ph和熱穩(wěn)定性高，適用于高溫和特殊ph條件下使用的食品；其水活性低，可以有效的防止食品被微生物污染；還具有柔和的提神苦味，可以添加在食品中增加口味的豐富性。目前，低聚龍膽糖被廣泛的運(yùn)用于巧克力、冰淇凌、咖啡、調(diào)味品、烘烤食品和飲料中。

制取低聚龍膽糖方法較多，早期的研究從龍膽屬植物的根、莖中提取，也可以利用還原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后從其副產(chǎn)物中提純獲得；但由于原料、市場(chǎng)價(jià)格等的限制，使其難以工業(yè)化生產(chǎn)。目前利用酶轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)低聚龍膽糖的研究集中在以高濃度的葡萄糖為原料，利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性合成低聚龍膽糖。但得到的低聚龍膽糖產(chǎn)量都不高，基本上都是在50g/l，轉(zhuǎn)化率在8％左右。

β-葡萄糖苷酶又叫β-d-葡萄糖苷水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶。廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，其中微生物來源更為廣泛，在原核微生物中有約氏黃桿菌，真核微生物中有清酒酵母、黑曲霉等，但是這些菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶用于生產(chǎn)低聚龍膽糖時(shí)產(chǎn)量較低。因此，本發(fā)明的目的不僅在于提高低聚龍膽糖的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率，還要構(gòu)建一種適用于低聚龍膽糖生產(chǎn)的基因工程菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

β-葡萄糖苷酶能水解非還原性β-d-糖苷鍵，游離β-d-糖苷鍵和配基。同時(shí)β-葡萄糖苷酶也具有轉(zhuǎn)糖苷活性，可以將水解活性釋放出的配基或葡萄糖體，以β-1，6糖苷鍵形式轉(zhuǎn)移到其他糖底物上。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種低聚龍膽糖的制備方法，所述方法是以葡萄糖和纖維二糖為底物，以β-葡萄糖苷酶為催化劑合成低聚龍膽糖。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法的反應(yīng)條件為以終濃度為5-30g/100ml的葡萄糖和終濃度為10-60g/100ml的纖維二糖為底物，β-葡萄糖苷酶加酶量為100-500u/g纖維二糖，在ph4-6、溫度50-70℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)周期為24-48h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述葡萄糖和纖維二糖的摩爾比為1:1。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法的反應(yīng)條件為以終濃度為20g/100ml的葡萄糖和終濃度為40g/100ml的纖維二糖為底物，β-葡萄糖苷酶加酶量為400u/g纖維二糖，在ph5、溫度60℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)周期為31h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將氨基酸序列如seqidno.1所示β-葡萄糖苷酶基因連接到表達(dá)載體ppic9k上，導(dǎo)入畢赤酵母km71中獲得的基因工程菌，經(jīng)發(fā)酵后得到的β-葡萄糖苷酶作為催化劑。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種β-葡萄糖苷酶的畢赤酵母基因工程菌，所述畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵得到的β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于上述低聚龍膽糖的制備方法中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述畢赤酵母基因工程菌是將氨基酸序列如seqidno.1所示β-葡萄糖苷酶基因連接到表達(dá)載體ppic9k上，導(dǎo)入畢赤酵母km71中獲得。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種構(gòu)建上述畢赤酵母基因工程菌的方法，所述方法是將核苷酸序列為seqidno.1的β-葡萄糖苷酶基因連接到表達(dá)載體ppic9k上，然后再電化到畢赤酵母km71中，得到基因工程菌畢赤酵母km71/ppic9k-bgl1。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述畢赤酵母基因工程菌生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法包括：(1)分批發(fā)酵階段：將種子液以8％-10％接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫度28-32℃、初始轉(zhuǎn)速180-200rpm、初始通氣量7l/min、溶氧28-32％、ph4.5-5.5；(2)補(bǔ)料發(fā)酵階段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，控制溫度28-30℃、溶氧28-32％、ph4.5-5.5；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到od600為80-120時(shí)，用甲醇流加儀流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，甲醇濃度控制在0.5-1％，控制溫度28-32℃、溶氧28-32％、ph4.5-5.5，誘導(dǎo)96-144h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)階段是當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到od600為100時(shí)，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶；誘導(dǎo)培養(yǎng)階段控制溫度為28℃。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述基因工程菌在低聚龍膽糖制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供所述低聚龍膽糖的制備方法在食品方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明將來源于綠色木霉的β-葡萄糖苷酶異源表達(dá)到畢赤酵母中，以ppic9k為表達(dá)載體，以畢赤酵母km71為表達(dá)宿主，得到一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶基因工程菌畢赤酵母km71/ppic9k-bgl1。本發(fā)明菌株生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的最適ph為5、最適溫度為60℃，酶活能達(dá)到1020u/ml。利用本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶以5-30％葡萄糖和10-60％纖維二糖為底物，β-葡萄糖苷酶加酶量為100-500u/g纖維二糖，在ph4-6、溫度50-70℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，反應(yīng)24-48h，低聚龍膽糖產(chǎn)量最高能達(dá)到116g/l，轉(zhuǎn)化率為19.4％。

同時(shí)本發(fā)明是首次提出以纖維二糖和葡萄糖為底物，利用β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷活性來合成低聚龍膽糖。而且轉(zhuǎn)苷得到的低聚龍膽糖產(chǎn)量也遠(yuǎn)高于目前以高濃度的葡萄糖為原料，利用β-葡萄糖苷酶的逆水解活性合成低聚龍膽糖的方法。

附圖說明

圖1是重疊pcr去除內(nèi)含子示意圖；

圖2是重組菌發(fā)酵上清(上罐)sds-page電泳圖；

圖3是β-葡萄糖苷酶最適溫度；

圖4是β-葡萄糖苷酶最適ph值；

圖5是β-葡萄糖苷酶加酶量對(duì)低聚龍膽糖產(chǎn)量的影響。

具體實(shí)施方式

培養(yǎng)基：

(1)md培養(yǎng)基：ynb13.4g/l，生物素4×10^-4g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂20g/l。

(2)ypd培養(yǎng)基：蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l，固體培養(yǎng)基添加20g/l瓊脂，用于篩選g418抗性時(shí)在ypd固體培養(yǎng)基加入所需濃度的g418即ypd-g418平板。

(3)bmgy培養(yǎng)基：ynb13.4g/l，甘油10g/l，生物素4×10^-4g/l，0.1mol/l磷酸鉀緩沖溶液(ph6.0)。

(4)bmmy培養(yǎng)基：ynb13.4g/l，甲醇1％，生物素4×10^-4g/l，0.1mol/l磷酸鉀緩沖溶液(ph6.0)

(5)種子培養(yǎng)基為：蛋白胨20g/l，酵母粉5g/l，甘油30g/l，ynb13.4g/l。

(6)發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油30g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，caso4·2h2o0.939g/l，koh4.13g/l，k2so418.2g/l，85％h3po426.7ml，微量元素4.32ml/l。

(7)補(bǔ)料培養(yǎng)基為：50％甘油，微量元素5ml/l。

(8)微量元素為：zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，cuso4·5h2o6g/l，mnso4·h2o3g/l，cocl20.5g/l，ki0.08g/l，na2moo3.2h2o0.2g/l，h2so45ml/l，生物素0.2g/l。

β-葡萄糖苷酶酶活力分析：

(1)酶活單位定義

每毫升酶液每分鐘水解pnpg產(chǎn)生1μmol的對(duì)硝基苯酚的酶活力為一個(gè)酶活單位。

(2)酶活力測(cè)定步驟

反應(yīng)體系為1.0ml，ph4.5的醋酸緩沖液960μl，加入適度稀釋的粗酶液20μl，再加入20μl100mmol/l的pnpg，在60℃恒溫水浴中預(yù)熱5～10min，用秒表精確計(jì)時(shí)，10min后立即加入200μl的1mol/l的na2co3溶液終止反應(yīng)，室溫放置5min，于400nm處測(cè)光吸收值。以加熱失活的酶液按照同樣的方法處理作空白。

實(shí)施例1：畢赤酵母km71/ppic9k-bgl1基因工程菌的構(gòu)建

根據(jù)genbank中的已知序列(accessionno.u09580)設(shè)計(jì)引物p1、p2(劃線部分為酶切位點(diǎn)，分別是snabi和noti)，以綠色木霉基因組為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到dna片段bgl1。然后以p1(seqidno.2)，p2(seqidno.3)，p3(seqidno.4)，p4(seqidno.5)為引物，通過重疊pcr去除內(nèi)含子，得到含有目的dna片段bgl1(圖1)，然后將β-葡萄糖苷酶基因bgl1與酵母表達(dá)載體ppic9k相連，將重組質(zhì)粒ppic9k-bgl1電轉(zhuǎn)整合到畢赤酵母km71中。然后涂布到md平板上，在md平板長(zhǎng)出單克隆，再經(jīng)ypd-g418平板篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，g418濃度篩選梯度依次為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml。挑取單菌落，經(jīng)ypd液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24h后甘油保菌。

pcr擴(kuò)增β-葡萄糖苷酶目的基因bgl1所用引物：

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實(shí)施例2：發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶

1、(1)分批發(fā)酵階段：將種子液以8％-10％接種量接種于發(fā)酵罐中，控制溫度28-32℃、初始轉(zhuǎn)速180-200rpm、初始通氣量7l/min、溶氧28-32％、ph4.5-5.5；(2)補(bǔ)料發(fā)酵階段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，控制溫度28-30℃、溶氧28-32％、ph4.5-5.5；(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)階段：當(dāng)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到od600為80-120時(shí)，用甲醇流加儀流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，甲醇濃度控制在0.5-1.5％，控制溫度28-32℃、溶氧28-32％、ph4.5-5.5，誘導(dǎo)96-144h。將發(fā)酵液離心取上清液，得到粗酶液，測(cè)得重組β-葡萄糖苷酶酶活為1020u/ml，相比于目前報(bào)導(dǎo)的綠色木霉β-葡萄糖苷酶發(fā)酵得到的最高水平60u/ml提高了22.4倍。重組β-葡萄糖苷酶蛋白sds-page電泳圖見圖2。

實(shí)施例3：β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

將得到的β-葡萄糖苷酶酶液用上述所述的酶活測(cè)定方法進(jìn)行酶學(xué)定性，以pnpg為底物，在不同的溫度下測(cè)酶活，結(jié)果表明β-葡萄糖苷酶的最適溫度為60℃(圖3)。然后在最適溫度條件下設(shè)置不同ph梯度測(cè)β-葡萄糖苷酶的酶活，得出該酶的最適ph為5(圖4)。

實(shí)施例4：β-葡萄糖苷酶在低聚龍膽糖制備中的應(yīng)用

以葡萄糖和纖維二糖為底物，在ph5、60℃反應(yīng)條件，β-葡萄糖苷酶添加量為400u/g纖維二糖，設(shè)置葡萄糖和纖維二糖的摩爾比為4:1、2:1、1:1和1:2，轉(zhuǎn)化31h，探究以葡萄糖和纖維二糖為底物利用轉(zhuǎn)苷活性合成低聚龍膽糖時(shí)底物葡萄糖和纖維二糖的摩爾配比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，當(dāng)葡萄糖與纖維二糖摩爾比為1:1時(shí)，低聚龍膽糖的產(chǎn)量最高，隨著纖維二糖所占的比例的增大低聚龍膽糖的產(chǎn)量也會(huì)有一定幅度的增加，但幅度很小，而且纖維二糖價(jià)格高于葡萄糖，綜合成本和產(chǎn)量考慮選擇葡萄糖與纖維二糖摩爾比為1:1最為合適。此時(shí)低聚龍膽糖的產(chǎn)量能達(dá)到25g/l，轉(zhuǎn)化率為16.7％。實(shí)施例4、5、6中葡萄糖濃度與纖維二糖濃度均是質(zhì)量比體積濃度，5％葡萄糖即為終濃度為5g/100ml的葡萄糖。

表1葡萄糖與纖維二糖摩爾比對(duì)低聚龍膽糖產(chǎn)量的影響

實(shí)施例5：β-葡萄糖苷酶在低聚龍膽糖制備中的應(yīng)用

以葡萄糖和纖維二糖為底物，在ph5，60℃反應(yīng)條件，在葡萄糖濃度為5％、纖維二糖濃度為10％的溶液中添加不同添加量的β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化31h，研究加酶量對(duì)低聚龍膽糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖5所示，確定β-葡萄糖苷酶的最適加酶量為400u/g纖維二糖。

實(shí)施例6：β-葡萄糖苷酶在低聚龍膽糖制備中的應(yīng)用

在實(shí)施例4和實(shí)施例5優(yōu)化的最優(yōu)條件下探究不同濃度的葡萄糖和纖維二糖溶液對(duì)酶反應(yīng)的影響，最終低聚龍膽糖累積含量如表2所示，低聚龍膽糖累積含量在一定范圍內(nèi)隨底物濃度的升高而增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到20％葡萄糖、40％纖維二糖時(shí)，增加葡萄糖和纖維二糖已經(jīng)不能顯著增加低聚龍膽糖的產(chǎn)量了，轉(zhuǎn)化率有所降低。所以從節(jié)約成本和低聚龍膽糖產(chǎn)量的角度來考慮，選擇底物濃度為20％葡萄糖、40％纖維二糖時(shí)最合適，此時(shí)低聚龍膽糖的產(chǎn)量能達(dá)到116g/l，轉(zhuǎn)化率為19.4％。

表2底物濃度對(duì)低聚龍膽糖產(chǎn)量的影響

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種低聚龍膽糖的制備方法

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>713

<212>prt

<213>trichodermaviride

<400>1

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