本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一類可用于次氯酸檢測的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

次氯酸(hocl)是一種具有較強氧化性的活性氧,在生物體內(nèi)由氯離子和過氧化氫在髓過氧化物酶(mpo)的作用下生成。次氯酸是嗜中性粒細胞生產(chǎn)的最強的氧化殺菌物質(zhì)，可以參與多種類型有害菌的清除過程。但是過量的次氯酸則會對機體產(chǎn)生危害，能夠引起氧化應(yīng)激,導(dǎo)致許多疾病如動脈粥樣硬化和心血管疾病等。因此，監(jiān)測生命系統(tǒng)尤其是活體中次氯酸濃度的變化以及分布具有十分重要的意義。

用于選擇性檢測次氯酸的方法有很多，其中熒光探針因其具有選擇性和靈敏度高、響應(yīng)時間快以及檢測所需的儀器相對簡單等優(yōu)勢已經(jīng)引起了人們越來越多的關(guān)注。其中與次氯酸在響應(yīng)前后具有明顯顏色變化的熒光探針在活體檢測過程中能夠更直觀的反應(yīng)次氯酸濃度的變化及分布，因而具有更大的應(yīng)用空間。然而當前還沒有在活體層次與次氯酸響應(yīng)后可以觀察到明顯顏色變化的次氯酸熒光探針被報道出來，因此開發(fā)這類探針具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一類新的可用于次氯酸檢測的熒光探針，以及提供該類熒光探針的制備方法和其在溶液以及活體成像中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及一類可用于次氯酸檢測的熒光探針，該類熒光探針具有式ι所示的結(jié)構(gòu)：

其中：(1)z為o或s；

(2)r1、r4、r5、r6、r7和r10可以各自獨立地選自氫原子、鹵素或烷基；

(3)r2、r3、r8和r9可以各自獨立地選自氫原子、未取代的烷基、苯基取代的烷基、烷氧基或羥烷氧基，所述的苯基包括未取代的或被1個或者多個鹵素、烷氧基、飽和氨基、烷基取代；或-nr2r3和-nr8r9基團可以相互獨立的表示飽和或者不飽和的雜環(huán)，其中所述的雜環(huán)可以包含一個或者多個選自n、o、s的另外的雜原子，所述的雜環(huán)為未取代的或被鹵素和烷基的基團取代；

(5)r11可以選自氫原子、烷基(未被完全取代)、氨基或者被烷基取代的氨基；

(6)本發(fā)明中所述的鹵素選自氟、氯、溴和碘原子。所述的烷基是指飽和的烷烴，包括直鏈或具有支鏈的，例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、異丙基和叔丁基。

本發(fā)明涉及具有式ι結(jié)構(gòu)化合物的制備方法，如下：

上述路線的具體步驟如下：

(1)中間體b的制備

將化合物a和堿溶解后，滴加還原劑，得到中間體b，不需分離，可直接進入下一步反應(yīng)。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優(yōu)選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。所述的還原劑選自連二亞硫酸鈉、維生素c、硫酸亞鐵銨，優(yōu)選連二亞硫酸鈉。溶劑優(yōu)選二氯甲烷和水的混合體系，反應(yīng)溫度20-80℃，優(yōu)選40℃。

(2)化合物i的制備

a、當r11選取氫原子時

將堿、4-二甲氨基吡啶(dmap)和維爾斯邁爾-哈克甲?；噭?vilsmeyer-haackreagent)溶于溶劑中，滴加化合物b，反應(yīng)得到化合物i。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優(yōu)選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。溶劑優(yōu)選二氯甲烷，反應(yīng)溫度-10-20℃，優(yōu)選0℃。

b、當r11選取烷基(未被完全取代)時

將堿、dmap和烷基或者未被完全取代的烷基對應(yīng)的酰氯溶于溶劑中，滴加化合物b，反應(yīng)得到化合物i。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優(yōu)選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。溶劑優(yōu)選二氯甲烷，反應(yīng)溫度-10-20℃，優(yōu)選0℃。

c、當r11選取氨基或者取代的氨基衍生物時

向含有化合物b的反應(yīng)體系中加入三光氣，制備中間體c，中間體c可以不經(jīng)純化，直接用于下步反應(yīng)。

將堿、dmap和氨水或者取代的氨基衍生物溶于溶劑中，滴加化合物c，反應(yīng)得到化合物i。所述的堿選自各種有機堿和無機堿，優(yōu)選碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銫。溶劑優(yōu)選二氯甲烷，反應(yīng)溫度-10-20℃，優(yōu)選0℃。本發(fā)明涉及具有式ι結(jié)構(gòu)化合物與次氯酸具有如下所示的響應(yīng)機理

具有式ι結(jié)構(gòu)的化合物本身沒有熒光，與次氯酸響應(yīng)后會先生成中間體b，然后再進一步被次氯酸氧化生成具有強熒光發(fā)射的化合物a。

本發(fā)明涉及具有式ι結(jié)構(gòu)的熒光探針在溶液以及動物活體層次的應(yīng)用。

檢測溶液的制備與檢測步驟如下：

(1)將式ι化合物溶解于有機溶劑(如甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺)中，然后稀釋到緩沖溶劑中用于溶液中次氯酸的檢測；

(2)將式ι化合物溶解于有機溶劑(如甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺)中，然后注射到動物的活體模型中用于動物層次次氯酸的檢測。

本發(fā)明的效果表現(xiàn)在：

(1)本發(fā)明首次提出次氯酸誘導(dǎo)的脫甲?；磻?yīng)，并應(yīng)用到次氯酸的檢測中。

(2)式ι化合物對次氯酸具有優(yōu)異的選擇性，對其它常見的活性氧/活性氮不響應(yīng)。

(3)式ι化合物對次氯酸響應(yīng)后可以通過肉眼識別，不需要復(fù)雜的儀器。

(4)式ι化合物可以在活體層次對次氯酸進行識別，并能觀察到明顯的顏色變化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明熒光探針分子與次氯酸的響應(yīng)機理示意圖。

圖2為本發(fā)明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1的¹hnmr譜圖。

圖3為本發(fā)明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1的¹³cnmr譜圖。

圖4為本發(fā)明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1與次氯酸響應(yīng)前后的熒光譜圖。fdocl-1的濃度為10μm，次氯酸的的濃度為25μm激發(fā)波長為620nm。

圖5為本發(fā)明涉及的實施例1所述的熒光探針fdocl-1的選擇性熒光譜圖。fdocl-1的濃度為10μm，ros/rns和次氯酸采用圖中所示的不同濃度。比較的ros/rns從a到h分別為：h2o2,o2^-,t-buooh,^·oh,no^·,onoo^-,roo^·,t-buoo^·。比較的為686nm處的熒光強度，激發(fā)波長為620nm。

圖6為本發(fā)明涉及的熒光探針fdocl-1在小鼠活體中的成像圖。

圖7為本發(fā)明涉及的實施例2所述的熒光探針fdocl-2與次氯酸響應(yīng)的時間依賴圖。fdocl-2的濃度為10μm，次氯酸的的濃度為25μm激發(fā)波長為620nm。

圖8為本發(fā)明涉及的實施例3所述的熒光探針fdocl-3與次氯酸響應(yīng)后的熒光譜圖。fdocl-3的濃度為10μm，次氯酸的的濃度為25μm激發(fā)波長為620nm。

圖9為本發(fā)明涉及的實施例4所述的熒光探針fdocl-4的熒光譜圖?？梢杂^測到激發(fā)波長為620nm時，體系中在686nm處的熒光強度隨著時間的推移沒有發(fā)生顯著的增強，表明r11為該類化合物時不能與次氯酸響應(yīng)。圖中a到e分別代表10μmfdocl-4(a)；10μmfdocl-4+100μmnaocl然后分別響應(yīng)30分鐘(b),60分鐘(c),120分鐘(d)；以及10μmfdocl-1+10μmnaocl響應(yīng)30秒(e)。

具體實施方式

實施例1

具有式ι結(jié)構(gòu)的化合物fdocl-1(r11為氫)的制備以及與次氯酸的響應(yīng)性能研究：

(1)vilsmeyer-haackreagent的制備

將二甲基甲酰胺(4.6g,62.52mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，室溫下滴加用10ml二氯甲烷稀釋的氯化亞砜(7.44g,62.52mmol)，滴畢后在60℃攪拌反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)完畢后直接蒸干溶劑，得到的維爾斯邁爾-哈克甲?；噭┲苯佑糜谙虏椒磻?yīng)。

(2)fdocl-1的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(5.0g，15.63mmol)用30ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(6.63g，62.52mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(8.16g,46.89mmol)。加畢后反應(yīng)20min，此時體系發(fā)生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，滴入混有維爾斯邁爾-哈克甲酰化試劑(實施例1中制備)、4-二甲氨基吡啶(1.91g，15.63mmol)、碳酸鈉(4.97g，46.89mmol)以及30ml二氯甲烷的混合體系中，滴加過程中體系在冰水浴下攪拌反應(yīng)，滴畢后轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌反應(yīng)，tlc指示反應(yīng)，通常4h左右體系不在有變化，反應(yīng)完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×4)萃取。合并有機相，用300ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到2.2g白色固體產(chǎn)物fdocl-1，收率45％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.52(s,1h),7.42(d,j＝8.4hz,1h),7.29(d,j＝8.8hz,1h),6.75(d,j＝2.8hz,1h),6.76-6.66(m,3h),2.90(s,12h).

¹³cnmr(100mhz,dmso)δ160.97,149.11,148.84,130.23,129.47,126.64,125.66,124.53,122.70,111.21,110.54,110.11,109.64,40.19.

(3)次氯酸熒光探針化合物的性能實驗

a、fdocl-1對次氯酸的檢測

如圖4所示，10μm的fdocl-1緩沖溶液(10mmpbs，ph＝7.2,1％乙醇)體系是沒有熒光的。但在加入25μm次氯酸后fdocl-1有強烈的熒光響應(yīng)，在686nm處的熒光強度增加了超過2800倍。

b、fdocl-1的選擇性

如圖5所示，即使體系中的次氯酸濃度只有1μm也能引起fdocl-1強烈的熒光響應(yīng)，而其它不同濃度的ros/rns例如h2o2,o2^-,t-buooh,·oh,no·,onoo-,roo·,t-buoo·則均不能造成fdocl-1熒光強度的變化，表明fdocl-1具備優(yōu)良的選擇性。

c、fdocl-1在小鼠活體中的應(yīng)用

如圖6所示，使用角叉菜膠在小鼠的右側(cè)腳踝處構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型，兩側(cè)同時注射100μl，1mm的fdocl-1后，可以觀測到炎癥部位直接變?yōu)樗{色，而正常的腳踝處沒有顏色變化。表明探針在識別前后發(fā)生明顯的顏色變化可以在活體中應(yīng)用。

實施例2

具有式ι結(jié)構(gòu)的化合物fdocl-2(r11為取代的氨基)的制備以及與次氯酸的響應(yīng)性能研究

(1)化合物的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(2.0g，6.25mmol)用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(2.65g，25.00mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(3.26g,18.75mmol)。加畢后反應(yīng)20min，此時體系發(fā)生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，然后向體系中滴加10ml二氯甲烷溶解的三光氣(0.93g，3.13mmol)滴畢后轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌反應(yīng)1h。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，滴入混有2ml二甲胺、4-二甲氨基吡啶(0.76g，6.25mmol)、碳酸鈉(1.99g，18.75mmol)以及20ml二氯甲烷的混合體系中，滴加過程中體系在冰水浴下攪拌反應(yīng)，滴畢后轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌反應(yīng)，tlc指示反應(yīng)直到反應(yīng)完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。合并有機相，用200ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到0.67g白色固體產(chǎn)物fdocl-2，收率30％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.42(d,j＝8.8hz,2h),6.68(d,j＝2.8hz,2h),6.63(dd,j＝8.8,2.8hz,2h),2.86(s,12h),2.64(s,6h).

(2)化合物與次氯酸的響應(yīng)行為測試

如圖7所示，向濃度為10μm的fdocl-2水溶液中加入25μm的naocl時可以觀測到體系中在686nm處的熒光強度隨著時間的推移發(fā)生顯著的增強。

實施例3

具有式ι結(jié)構(gòu)的化合物fdocl-3(r11為烷基)的制備以及與次氯酸的響應(yīng)性能研究

(1)目標化合物的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(2.0g，6.25mmol)用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(2.65g，25.00mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(3.26g,18.75mmol)。加畢后反應(yīng)20min，此時體系發(fā)生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，加入4-二甲氨基吡啶(0.76g，6.25mmol)、碳酸鈉(1.99g，18.75mmol)以及20ml二氯甲烷的混合體系中，冰水浴下攪拌下向體系滴加用10ml二氯甲烷溶解的乙酰氯(1.47g，18.75mmol)，滴畢后轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌反應(yīng)，tlc指示反應(yīng)直到反應(yīng)完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。合并有機相，用200ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到0.72g白色固體產(chǎn)物fdocl-3，收率35％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,cd3cn)δ7.29(d,j＝8.8hz,2h),6.77(d,j＝2.4hz,2h),6.68(dd,j＝9.2,2.8hz,2h),2.92(s,12h),2.05(s,3h).

(2)化合物與次氯酸的響應(yīng)性能測試

如圖8所示，向濃度為10μm的fdocl-3水溶液中加入25μm的naocl時可以觀測到體系中的熒光強度發(fā)生顯著的增強。

實施例4

具有式ι結(jié)構(gòu)的化合物fdocl-4(r11為烷氧基)的制備以及與次氯酸的響應(yīng)性能研究，對比例。

(1)化合物的制備

在三頸燒瓶中加入亞甲基藍(2.0g，6.25mmol)用15ml二氯甲烷和40ml水溶解。向體系中加入碳酸鈉(2.65g，25.00mmol)將體系置于40℃下攪拌，氮氣保護后向體系中滴加用20ml水溶解的連二亞硫酸鈉(3.26g,18.75mmol)。加畢后反應(yīng)20min，此時體系發(fā)生明顯的分層，下層為黃色溶液。將體系靜置，然后向體系中滴加10ml二氯甲烷溶解的三光氣(0.93g，3.13mmol)滴畢后轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌反應(yīng)1h。將體系靜置，分層后用注射器吸出下層清夜，滴入混有4-二甲氨基吡啶(0.76g，6.25mmol)、碳酸鈉(1.99g，18.75mmol)以及20ml甲醇的混合體系中，滴加過程中體系在冰水浴下攪拌反應(yīng)，滴畢后轉(zhuǎn)移至室溫下攪拌反應(yīng)，tlc指示反應(yīng)直到反應(yīng)完畢。

過濾，除去體系中的不溶物，將濾液傾入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。合并有機相，用200ml×3飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸除溶劑，剩余物用硅膠柱層析純化，得到0.86g白色固體產(chǎn)物fdocl-4，收率40％(以亞甲基藍為參比計算)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.30(d,j＝8.4hz,2h),6.68–6.65(m,4h),3.65(s,3h),2.89(s,12h).

(2)化合物與次氯酸的響應(yīng)行為測試

如圖9所示，向濃度為10μm的fdocl-4水溶液中加入100μm的naocl時可以觀測到體系中在686nm處的熒光強度隨著時間的推移沒有發(fā)生顯著的增強，表明r11為該類化合物時不能與次氯酸響應(yīng)。