本發(fā)明屬于于家禽腸道微生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：動物消化道存在著數(shù)目龐大、相對穩(wěn)定的微生物群落。菌群的多樣性能夠保證腸道微生物區(qū)系平衡。微生物群落能夠維持胃腸道環(huán)境相對穩(wěn)定，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。家禽的大腸很短，食糜會很快進入盲腸，所以盲腸是微生物生存和活動的重要場所。家禽腸道微生物分布，種類和數(shù)量的檢測方法目前采用兩種方法，一種是平板計數(shù)法，該法誤差大，易污染，檢測結(jié)果為活菌數(shù)，檢測效果不好，并且耗時耗勞力。另一種是實時熒光定量pcr法，該方法靈敏度高，污染小，但依賴于標(biāo)準(zhǔn)品，檢測菌種選擇少，特異性不強。絕對定量pcr(absolutequantificationpcr，aq-pcr)技術(shù)是利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測定未知樣品的ct值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始濃度，實現(xiàn)了對測定樣本基因的分子拷貝數(shù)的絕對定量。目前廣泛應(yīng)用的相對熒光定量pcr技術(shù)只是測定樣本中的靶序列相對于參照樣本量的變化，而不能測出初始模板起始拷貝數(shù)的絕對量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備是絕對熒光定量pcr實驗的關(guān)鍵步驟，目前家禽腸道微生物絕對定量pcr法多選擇已知菌株為標(biāo)準(zhǔn)品，提取基因組制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品時，標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品同時進行pcr循環(huán)，根據(jù)未知樣品的ct值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線來求得未知樣品cdna的起始拷貝數(shù)。該方法會受到標(biāo)準(zhǔn)品的限制，檢測菌種選擇少，特異性不強，并且標(biāo)準(zhǔn)品菌株是利用平板計數(shù)法確定活菌數(shù)，存在較大誤差。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明針對家禽腸道微生物檢測方法目前存在誤差大，耗時，檢測效果不好，檢測菌種限制，特異性不強的問題，提供了一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法，包括以下步驟：步驟1、dna提取：采用糞便基因組提取試劑盒，將肉雞盲腸內(nèi)容物總dna提取于1.5mlep管中，測其核酸濃度，滅菌超純水稀釋到20ng/μl，與原液一起保存于-20℃冰箱，待用；步驟2、合成肉雞腸道微生物pcr引物；步驟3、構(gòu)建肉雞腸道微生物質(zhì)粒；步驟4、制作標(biāo)準(zhǔn)品；步驟5、進行樣品檢測。進一步地，所述步驟3中構(gòu)建肉雞腸道微生物質(zhì)粒具體為：1)以肉雞腸道內(nèi)容物總dna為模板，用步驟1中的引物進行pcr擴增，按照pcr反應(yīng)體系擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠dna小量回收試劑盒回收純化目的片段，測od值，-20℃保存；2)用試劑盒將1)中純化的目的片段連結(jié)在載體上并轉(zhuǎn)化，按照說明書制備10μl連接混合液，16℃，30min；1μl混合液加入10μldh5α冰上30min，做一個重復(fù)組；42℃熱激90s，冰上3min；500μl的lb培養(yǎng)基，37℃，復(fù)蘇45-60min，220rpm/min；4000rpm/min離心，2min，棄400μl，重懸，la平板上涂板，37℃過夜培養(yǎng)，不超過16h；3)挑取單菌落白斑，于10ul液體la培養(yǎng)基中，取1ul進行菌落pcr，剩下的加500ul的液體la培養(yǎng)基；pcr結(jié)果陽性的菌液測序；4)測序結(jié)果在blast上比對，陽性結(jié)果菌液發(fā)酵后試劑盒提取質(zhì)粒；5)質(zhì)粒測序，ncbi上blast比對結(jié)果，挑選與目的菌株匹配的質(zhì)粒，檢測dna濃度，保存于-20℃冰箱，備用。進一步地，所述步驟4中制備標(biāo)準(zhǔn)品具體為：將質(zhì)粒按十倍稀釋法，用滅菌超純水稀釋成10-1-10-9的濃度梯度，取9個無菌的1.5mlep管，根據(jù)濃度由大到小依次編號1-9，并各加入90μl滅菌的超純水，取肉雞腸道微生物標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒原液10μl于試管中，快速輕柔吹打20-30次，重復(fù)該步驟至9號ep管，得到包括原液的10個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。進一步地，所述步驟5中樣品檢測具體為：選取3-7號標(biāo)準(zhǔn)品與樣品稀釋液一起進行熒光定量pcr反應(yīng)；試驗所用設(shè)備為bio-rad96孔熒光定量pcr儀。進一步地，pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系為上游引物和下游引物各0.8μl；rnase-freeddh2o7.4μl；sybrgreensupermix10μl；dna模板1μl。進一步地，所述熒光定量pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件：預(yù)變性階段，1次循環(huán)，溫度95℃，預(yù)變性30s，不采集熒光信號；pcr反應(yīng)階段，40次循環(huán)，溫度95℃，變性5s，退火溫度50-60℃，時間30s，溫度72℃，延伸20s，采集熒光信號；溶解曲線，72℃到95℃，每2s上升0.5℃。進一步地，所述肉雞腸道微生物為總菌、乳桿菌或大腸桿菌中的一種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)本發(fā)明提供的肉雞腸道微生物檢測的方法采用的是熒光定量pcr方法，具有特異性高，重復(fù)性好，靈敏度高等特點；2)本發(fā)明通過利用腸道菌群的特異性保守基因片段插入載體構(gòu)建質(zhì)粒的方法，提高了菌種檢測的準(zhǔn)確性，解決了標(biāo)準(zhǔn)菌株做標(biāo)準(zhǔn)曲線的局限性；3)本發(fā)明通過對肉雞腸道微生物的絕對定量，可以確定某種菌的絕對拷貝數(shù)，對腸道菌群多樣性和豐度的分析提供了參考依據(jù)。本發(fā)明可以用于其他動物腸道微生物水平的檢測。當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1是本發(fā)明實施例1中的肉雞腸道乳桿菌絕對定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2是本發(fā)明實施例1中的乳桿菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實時定量pcr溶解曲線；圖3是本發(fā)明實施例1中的擴增曲線；圖4是本發(fā)明實施例2中的肉雞腸道總菌數(shù)絕對定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5是本發(fā)明實施例2中的總菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實時定量pcr溶解曲線；圖6是本發(fā)明實施例2中的擴增曲線；圖7是本發(fā)明實施例3中的肉雞腸道腸球菌絕對定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖8是本發(fā)明實施例3中的腸球菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實時定量pcr溶解曲線；圖9是本發(fā)明實施例3中的擴增曲線。具體實施方式以下將配合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。實施例1肉雞腸道乳桿菌的定量檢測方法該方法包括以下步驟：步驟1、dna提?。翰捎眉S便基因組提取試劑盒，將肉雞盲腸內(nèi)容物總dna提取于1.5mlep管中，測其核酸濃度，滅菌超純水稀釋到20ng/μl，與原液一起保存于-20℃冰箱，待用；步驟2、引物合成：合成肉雞腸道乳桿菌pcr引物，其上游引物為cgatgagtgctaggtgttgga，核苷酸序列如seqidno.1所示；下游引物為caagatgtcaagacctggtaag，序列如seqidno.2所示；步驟3、構(gòu)建質(zhì)粒：1)以肉雞腸道內(nèi)容物總dna為模板，用步驟2中的引物進行pcr擴增，按照表1的pcr反應(yīng)體系擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠dna小量回收試劑盒(magen,d2111-02)回收純化目的片段，測od值，-20℃保存。2)用試劑盒pmdtm19-tvectorcloningkit(takara，6013)將1)中純化的目的片段連結(jié)在載體上并轉(zhuǎn)化，按照說明書制備10μl連接混合液，16℃，30min；1μl混合液加入10μldh5α冰上30min，可做一個重復(fù)組；42℃熱激90s，冰上3min；500μl的lb培養(yǎng)基，37℃，復(fù)蘇45-60min，220rpm/min；4000rpm/min離心，2min，棄400μl，重懸，la平板上涂板，37℃過夜培養(yǎng)，不超過16h。3)挑取單菌落白斑，于10ul液體la培養(yǎng)基中，取1ul進行菌落pcr，剩下的加500ul的液體la培養(yǎng)基。pcr結(jié)果陽性的菌液測序。4)測序結(jié)果在blast上比對，陽性結(jié)果菌液發(fā)酵后試劑盒提取質(zhì)粒(20ml體積菌液回收一管)。5)質(zhì)粒測序，ncbi上blast比對結(jié)果，挑選與目的菌株匹配的質(zhì)粒，檢測dna濃度，保存于-20℃冰箱，備用，肉雞腸道乳桿菌質(zhì)粒如基因序列seqidno.3所示。步驟4、標(biāo)準(zhǔn)品的制作：將質(zhì)粒按十倍稀釋法，用滅菌超純水稀釋成10-1-10-9的濃度梯度，取9個無菌的1.5mlep管，根據(jù)濃度由大到小依次編號1-9，并各加入90μl滅菌的超純水，取乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒原液10μl于試管中，快速輕柔吹打20-30次，重復(fù)該步驟至9號ep管，得到包括原液的10個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品；步驟5、樣品檢測：選取3-7號標(biāo)準(zhǔn)品與樣品稀釋液一起按照表1的反應(yīng)體系以及表2的反應(yīng)條件進行熒光定量pcr反應(yīng)。試驗所用設(shè)備為bio-rad96孔熒光定量pcr儀。表1pcr反應(yīng)體系試劑體積上游引物0.8μl下游引物0.8μlrnase-freeddh2o7.4μlsybrgreensupermix10μldna模板1μltotal20μl表2pcr反應(yīng)條件本實施例1成功建立肉雞腸道乳桿菌絕對定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。本實施例1通過對肉雞腸道乳桿菌的絕對定量，可以確定該菌的絕對拷貝數(shù)，對其微生物水平分析提供參考依據(jù)。以初始模板量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，ct值為縱坐標(biāo)，繪制出乳桿菌的熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，初始模板濃度與ct值之間呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為1.000，斜率為-3.553，擴增效率為91.2％。通過乳桿菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實時定量pcr溶解曲線(見圖2)的檢測，可見為單峰，因此本發(fā)明擴增產(chǎn)物特異性好。擴增曲線(見圖3)顯示，檢測樣品ct值在標(biāo)準(zhǔn)品ct值范圍內(nèi)，得出的拷貝數(shù)準(zhǔn)確性高。實施例2肉雞腸道總菌數(shù)的定量檢測方法該方法所用到的pcr引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物為cggcaacgacgcaaccc，核苷酸序列如seqidno.4所示；下游引物為ccattgtagcacgtgtgtagcc，核苷酸序列如seqidno.5所示；熒光定量pcr反應(yīng)的退火溫度為60℃；制備得到的肉雞腸道總菌質(zhì)粒序列如seqidno.6所示，其余步驟同實施例1。本實施例2成功建立肉雞腸道總菌絕對定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。本實施例2通過對肉雞腸道總菌的絕對定量，可以確定總菌的絕對拷貝數(shù)，對其微生物水平分析提供參考依據(jù)。以初始模板量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，ct值為縱坐標(biāo)，繪制出總菌的熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，初始模板濃度與ct值之間呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996，斜率為-3.456，擴增效率為94.7％。通過總菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實時定量pcr溶解曲線(見圖5)的檢測，可見為單峰，因此本發(fā)明擴增產(chǎn)物特異性好。擴增曲線(見圖6)顯示，檢測樣品ct值在標(biāo)準(zhǔn)品ct值范圍內(nèi)，得出的拷貝數(shù)準(zhǔn)確性高。實施例3肉雞腸道大腸桿菌數(shù)的定量檢測方法該方法所用到的pcr引物包括上游引物和下游引物，其中，上游引物為gttaatacctttgctcattga，核苷酸序列如seqidno.7所示；下游引物為accagggtatctaatcctgtt，核苷酸序列如seqidno.8所示；熒光定量pcr反應(yīng)的退火溫度為50℃；制備得到的肉雞腸道大腸桿菌質(zhì)粒序列如seqidno.9所示，其余步驟同實施例1。本實施例3成功建立肉雞腸道大腸桿菌絕對定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖7。本實施例3通過對肉雞腸道大腸桿菌的絕對定量，可以確定大腸桿菌的絕對拷貝數(shù)，對其微生物水平分析提供參考依據(jù)。以初始模板量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，ct值為縱坐標(biāo)，繪制出大腸桿菌的熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線，初始模板濃度與ct值之間呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，斜率為-3.907，擴增效率為80.3％。通過大腸桿菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品實時定量pcr溶解曲線(見圖8)的檢測，可見為單峰，因此本發(fā)明擴增產(chǎn)物特異性好。擴增曲線(見圖9)顯示，檢測樣品ct值在標(biāo)準(zhǔn)品ct值范圍內(nèi)，得出的拷貝數(shù)準(zhǔn)確性高。本發(fā)明可用于其他動物腸道微生物的檢測。上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。sequencelisting<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所<120>一種肉雞腸道微生物的定量檢測方法<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1cgatgagtgctaggtgttgga21<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2caagatgtcaagacctggtaag22<210>3<211>1091<212>dna<213>肉雞腸道乳桿菌質(zhì)粒<400>3aaagttccatggcctcattcggtggtaagttcttagcatcgggcggatgtaggagcaaac60cattaggacatggtcacgacgacggtcacgctattcagcccaaatggcccacctgagttc120tgctatcaatggcctattccgcgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgg180gtcgaacctcgcttgctggatgtggcttgactctatggatgtcgcactcgatactctttc240gcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttg300tcctctcgcgtgctccctcgaaggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcc360caaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcgga420tacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacg480agtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctattggcataatggcggaaact540cactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctcct600tcgccttctcgcgggttatgcgtttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattac660gtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattaca720ctcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaa780cacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtcgatactggtactaatgcg840gttcgaacgtacggacgtccagctgctaagttctacagttctggaccattccaagaagcg900caacgaagcttaatttggtgtatgaggtgacgaacacgcccgggggcagttaaggaaact960caaagttggaacgccagcatgaggggtccacctaatgaataacacaattgacgccgtgac1020ttccccagttaggaggttgtggatcgtgagtagcttagagatctcctaggggcccatggc1080tcgagcttaag1091<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4cggcaacgacgcaaccc17<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5ccattgtagcacgtgtgtagcc22<210>6<211>1094<212>dna<213>肉雞腸道總菌質(zhì)粒<400>6ccaagtgtctccggtctaggtttatgcaaaaaaatccatcggcatcatccggtggtaagt60tctgaagcatcgtggcggatgtatggagcgaaaccattaggacaatggtcaccgacgacg120gtcaccgctattcagcacagaatggcccaacctgagttctgctatcaatggcctattccg180cgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgggtcgaacctcgcttgctggat240gtggcttgactctatggatgtcgcactcgatactctttcgcggtgcgaagggcttccctc300tttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcga360aggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaact420cgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcggatacctttttgcggtcgttgcg480ccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaa540taggggactaagacacctattggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggc600gtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgc660gtttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagg720gctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccg780tggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctat840tgttaaagtgtgtcctttgtcgatactggtactaatgcggttcgaacgtacggacgtcca900gctgctaaggtaacatcgtgcacacatcgggttctgtattccccgtactactaaactgca960gtaggggtggaaggaggcacaataggtgccgtcagagaggtctcacgggttgatttacta1020ccgatgacttctattcccaacgcagcaacggcttagagatctcctaggggcccatggctc1080gagcttagtgatgg1094<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7gttaatacctttgctcattga21<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8accagggtatctaatcctgtt21<210>9<211>1094<212>dna<213>大腸桿菌質(zhì)粒<400>9ccccaagcagtggttggggtcgaacctcccttgctgaagggggctttaccctagggaggt60cgcactcgaaaccctttcgcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccaaaggcca120ttcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcgaaggtccccctttgcggaccat180agaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgag240cagtccccccgcctcggatacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccg300gaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctatt360ggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtc420gctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgcgtttggcggagaggggcgcgc480aaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcact540cgcgttgcgttaattacactcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaata600cgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtc660gatactggtactaatgcggttcgaacgtacggacgtccagctgctaacaattatggaaac720gagtaactgcaatgggcgtcttcttcgtggccgattgaggcacggtcgtcggcgccatta780tgcctcccacgttcgcaattagccttaatgacccgcatttcgcgtgcgtccgccaaacaa840ttcagtctacactttaggggcccgagttggacccttgacgtagactatgaccgttcgaac900tcagagcatctccccccatcttaaggtccacatcgccactttacgcatctctagacctcc960ttatggccaccgcttccgccgggggacctgcttctgactgcgagtccacgctttcgcgcc1020cctcgtttgtcctaatctatgggaccattagagatctcctaaggggcccatggctcgagc1080ttagtgaccggagc1094當(dāng)前第1頁12