本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
中的病毒檢測(cè)方法，具體涉及一種sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的通用引物、探針及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：菜豆金色花葉病毒屬(begomovirus)病毒屬于雙生病毒科(geminiviridae)，是一類重要的植物病毒。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，侵染甘薯的begomovirus病毒明顯與其它植物的病毒處于不同的分支，具有較大差異，因此被稱為“sweepoviruses”。目前，侵染甘薯的sweepoviruses總共包括11個(gè)種，分別為：sweetpotatoleafcurlchinavirus(splccnv)、sweetpotatoleafcurlvirus(splcv)、sweetpotatoleafcurlgeorgiavirus(splcgv)、sweetpotatoleafcurlcanaryvirus(splccv)、sweetpotatoleafcurlsaopaulovirus(splcspv)、sweetpotatoleafcurlsouthcarolinavirus(splcscv)、sweetpotatoleafcurlugandavirus(splcuv)和sweetpotatomosaicvirus(spmv)、sweetpotatoleafcurlhenanvirus(splchnv)、sweetpotatoleafcurlsichuanvirus1(splcsiv1)、sweetpotatoleafcurlsichuanvirus2(splcsiv2)。研究表明，我國甘薯上的sweepoviruses至少有7個(gè)種，分別為：splccnv、splcv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2。sweepoviruses是侵染甘薯的一類重要病毒，一般可引起11-86％的產(chǎn)量損失，對(duì)甘薯生產(chǎn)危害很大。目前對(duì)sweepoviruses尚無特別有效的化學(xué)防治方法，對(duì)這類病毒的早期檢測(cè)和預(yù)警以及種植脫毒甘薯是防治sweepoviruses最有效的方法。在對(duì)病毒監(jiān)測(cè)預(yù)警和培育脫毒甘薯的過程中，都需要對(duì)sweepoviruses病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，只有盡早發(fā)現(xiàn)病毒或種植經(jīng)過嚴(yán)格檢測(cè)不含sweepoviruses病毒的種薯種苗才能有效控制病害的發(fā)生，否則會(huì)引起產(chǎn)量損失和病毒的流行和擴(kuò)散蔓延。目前對(duì)sweepoviruses的檢測(cè)主要采用普通pcr方法，但普通的pcr方法不能對(duì)病毒進(jìn)行定量分析，而且靈敏度較低，容易引起漏檢。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-timefluorescentquantitativepcr)技術(shù)是一種新型核酸定性、定量技術(shù)，既有普通pcr靈敏快速的特點(diǎn)，又可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，已應(yīng)用于多種植物病毒的檢測(cè)。但是目前尚無sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的通用引物、探針及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。該方法能夠簡便、快速、靈敏的對(duì)sweepoviruses病毒進(jìn)行定量檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的通用引物及探針，所述的引物包括上游引物spv-f和下游引物spv-r，其中spv-f的序列為5’-ccctacactgggaatgctgt-3’，spv-r的序列為5’-tgtgggacatccatcttgaa-3’；所述的探針為spv-probe，spv-probe的序列為5’-fam-atacctaaggggtgtgtgggtccctgt-bhq-3’。一種利用所述的通用引物及探針的sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法，具體為，提取待測(cè)樣品的總dna，以總dna為模板，利用通用引物及探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，判定樣品是否感染sweepoviruses病毒。所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系為20μl，包括：premixextaq(probeqpcr)10μl、roxreferencedyeii0.4μl、10μmol/lspv-f0.4μl、10μmol/lspv-r0.4μl、10μmol/lspv-probe0.6μl、模板2μl，余量為ddh2o。所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性20s；95℃變性5s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)后，得到的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝3.261x+40.967，擴(kuò)增效率為102.603％，相關(guān)系數(shù)為0.999。一種所述的通用引物及探針在檢測(cè)sweepoviruses病毒中的應(yīng)用。一種所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法在檢測(cè)sweepoviruses病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明根據(jù)我國已報(bào)道的7種甘薯sweepoviruses病毒的核苷酸序列，通過序列比對(duì)，在其相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物和一條探針，并通過一系列條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)sweepoviruses病毒的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)的靈敏度高，最低可檢測(cè)到2×100copies/μl，比常規(guī)pcr方法高出100倍。且該方法的特異性好，能夠特異性檢測(cè)出sweepoviruses，而對(duì)spvg、spcsv等甘薯病毒則無法檢出。同時(shí)，該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。2、本發(fā)明建立了實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝3.261x+40.967，斜率為-3.261，擴(kuò)增效率為102.603％，相關(guān)系數(shù)為0.999；該方法只能檢測(cè)到目的病毒，能定量檢測(cè)單個(gè)拷貝數(shù)的病毒，可作為sweepoviruses病毒互作機(jī)制研究的高效工具，具有較高的實(shí)用價(jià)值。3、本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法可用于田間甘薯樣品和脫毒甘薯種苗的檢測(cè)，為加強(qiáng)sweepoviruses的早期監(jiān)測(cè)預(yù)警和流行學(xué)研究以及脫毒甘薯質(zhì)量檢測(cè)提供了技術(shù)手段，對(duì)sweepoviruses的防控具有重要意義。附圖說明圖1為sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr上下游引物濃度篩選結(jié)果。其中，1-4分別為上下游引物終濃度0.2μmol/l、0.1μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l，5為空白對(duì)照。圖2為sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr探針濃度篩選結(jié)果。其中，1-5分別為探針終濃度0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l，6為空白對(duì)照。圖3為sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr退火溫度的篩選結(jié)果。其中，a-d中的1分別為退火溫度49℃、53℃、58℃、61℃，2為空白對(duì)照。圖4為sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線。其中，1-10分別為模板濃度2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl、2×100copies/μl，11為空白對(duì)照。圖5為sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為sweepoviruses常規(guī)pcr靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。其中，m為dl2000，1-10分別為模板濃度2×109copies/μl、2×108copies/μl、2×107copies/μl、2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl、2×101copies/μl、2×100copies/μl，11為空白對(duì)照。圖7為sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr特異性檢測(cè)結(jié)果。其中，1和8為splcgv重組質(zhì)粒；2和7為splcv重組質(zhì)粒；3為spvg重組質(zhì)粒；4為spcsv重組質(zhì)粒；5為空白對(duì)照，6為splccnv重組質(zhì)粒；9為splccv重組質(zhì)粒；10為splchnv重組質(zhì)粒；11為splcsiv1重組質(zhì)粒；12為splcsiv2重組質(zhì)粒；13為空白對(duì)照。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，或按照制造廠商所建議的條件與實(shí)施步驟。實(shí)施例1、sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的建立1材料與方法1.1材料重組質(zhì)粒：含有splcgv(登錄號(hào)為：kj013563)、spcsv(登錄號(hào)為：kc888961)、spvg(登錄號(hào)為：eu218531)、splccnv(登錄號(hào)為：kj013576)、splcv(登錄號(hào)為：kj013555)、splccv(登錄號(hào)為：kx033435)、splchnv(登錄號(hào)為：kj476507)、splcsiv1(登錄號(hào)為：kj476511)、splcsiv2(登錄號(hào)為：kj013574)全長基因組的重組質(zhì)粒由河南省農(nóng)科院植保所生物技術(shù)研究室構(gòu)建并保存。上述重組質(zhì)粒中，含有spcsv和spvg重組質(zhì)粒是含有該病毒的外殼蛋白(cp)基因，其它病毒的重組質(zhì)粒均為含有該病毒的全長基因組序列，所有重組質(zhì)粒的克隆載體均為pmd19-t。1.2主要儀器實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀為abi公司的7500型，紫外分光光度計(jì)為美國ge公司所生產(chǎn)的產(chǎn)品。1.3sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的建立1.3.1引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)我國已報(bào)道的7種甘薯sweepoviruses病毒的核苷酸序列，通過序列比對(duì)，在其相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物spv-f/spv-r和一條探針spv-probe，具體序列見表1。表1、引物和探針設(shè)計(jì)其中，f為上游引物，r為下游引物。1.3.2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備選取含有splcgv全長基因組的重組質(zhì)粒dna為模板，利用引物spv-f和spv-r進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增，以此驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物正確性。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約為155bp左右，與預(yù)期大小相符，所設(shè)計(jì)引物可以應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr。引物驗(yàn)證正確后，將含有splcgv全長基因組序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌tg1，以提取符合要求的陽性重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。利用分光光度計(jì)對(duì)提取的含有splcgv全長基因組的重組質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，所提取的重組質(zhì)粒濃度為607ng/l，a260/a280比值為1.83，a260/a230比值為2.30，說明提取的質(zhì)粒dna純度符合實(shí)時(shí)熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)品要求。根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)，換算成拷貝數(shù)為2×1011copies/μl。同時(shí)吸取10μl加入90μlddh2o對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋。按照這個(gè)方法依次進(jìn)行10倍稀釋，得到系列10倍濃度差的重組質(zhì)粒dna(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11)，選取2×109-2×100copies/μl10個(gè)梯度差的重組質(zhì)粒作為實(shí)時(shí)熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)品和普通pcr的模板。1.3.3反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化1.3.3.1引物和探針濃度的優(yōu)化選取含有splcgv全長基因組的重組質(zhì)粒dna(10-5)為模板，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，篩選引物濃度和探針濃度。篩選時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)選擇premixextaqtm試劑盒(購自takara公司)中實(shí)時(shí)熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)體系，反應(yīng)體系如下：采用單因素實(shí)驗(yàn)來篩選引物和探針的最佳濃度，其中引物終濃度在0.1-0.4μmol/l的范圍以0.1μmol/l遞增設(shè)置4個(gè)濃度梯度，探針在0.1-0.5μmol/l以0.1μmol/l遞增設(shè)置5個(gè)濃度梯度。結(jié)果表明，當(dāng)上下游引物終濃度為0.2μmol/l(圖1、表2)，探針終濃度為0.3μmol/l(圖2、表3)時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量pcr能夠檢測(cè)到最小ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值，此時(shí)即為最佳濃度。表2、sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr上下游引物濃度篩選結(jié)果上下游引物終濃度方法ct值0.1μmol/l絕對(duì)定量法16.81380.2μmol/l絕對(duì)定量法12.48330.3μmol/l絕對(duì)定量法19.270710.4μmol/l絕對(duì)定量法22.40567表3、sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr探針濃度篩選結(jié)果探針終濃度方法ct值0.1μmol/l絕對(duì)定量法23.169610.2μmol/l絕對(duì)定量法22.985640.3μmol/l絕對(duì)定量法22.867790.4μmol/l絕對(duì)定量法23.047020.5μmol/l絕對(duì)定量法23.01476經(jīng)過優(yōu)化后的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：1.3.3.2退火溫度的優(yōu)化獲得最佳反應(yīng)體系后，對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，從49-61℃設(shè)置4個(gè)梯度處理，分別為49℃、53℃、58℃、61℃。采用三步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，即：階段1：(1個(gè)循環(huán))95℃預(yù)變性20s階段2：(40個(gè)循環(huán))95℃變性5s49-61℃設(shè)置4個(gè)梯度退火30s72℃延伸30s結(jié)果表明(圖3、表4)，在58℃時(shí)能夠檢測(cè)到最小ct值，此時(shí)為最佳退火溫度。表4、退火溫度的篩選結(jié)果退火溫度方法ct值49℃絕對(duì)定量法23.1696153℃絕對(duì)定量法22.9856458℃絕對(duì)定量法22.8677961℃絕對(duì)定量法23.04702經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性20s；95℃變性5s，58℃退火30s，72℃延伸30s并收集熒光，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別以稀釋的10倍濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，分別根據(jù)abi7500繪制的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析。結(jié)果表明，稀釋10倍濃度梯度的模板均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線。且模板濃度越高，ct值越小，模板濃度越低，ct值越大(圖4)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀自帶軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示：所建立的sweepoviruses標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝3.261x+40.967，斜率為-3.261，擴(kuò)增效率為102.603％，相關(guān)系數(shù)為0.999(圖5)。實(shí)施例2、sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的驗(yàn)證2.1靈敏度檢測(cè)將含有splcgv全長基因的重組質(zhì)粒dna進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋，以10倍連續(xù)濃度梯度(2×109-2×100copies/μl)的重組質(zhì)粒為模板，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)pcr與實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，分別根據(jù)abi7500繪制的擴(kuò)增曲線和經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析的普通pcr結(jié)果進(jìn)行靈敏度比較分析。普通pcr反應(yīng)體系為：反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3mim；94℃變性3mim，58℃退火50s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)72℃補(bǔ)平10min。結(jié)果表明，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr在模板濃度稀釋至2×100copies/μl時(shí)仍有熒光曲線(圖4)，表明本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)2×100copies/μl。但普通pcr只能檢測(cè)到2×102copies/μl(圖6)，表明本發(fā)明所建立sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr的靈敏度比普通pcr高出100倍。2.2特異性檢測(cè)利用含有splcgv全長基因的重組質(zhì)粒dna作為陽性對(duì)照，含有splccnv、splcv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2、spcsv和spvg基因組序列的重組質(zhì)粒作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法的特異性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，以重組質(zhì)粒spvg、spcsv為模板的實(shí)時(shí)熒光定量pcr未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，以splcv、splccnv、splcgv、splccv、splchnv、splcsiv1、splcsiv2為模板的實(shí)時(shí)熒光定量pcr出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。表明本發(fā)明建立的檢測(cè)方法可特異性檢測(cè)sweepoviruses，而對(duì)spvg、spcsv等甘薯病毒則無法檢出(圖7)。2.3重復(fù)性檢測(cè)從稀釋的10個(gè)濃度梯度中挑選5個(gè)連續(xù)梯度模板(2×108-2×104copies/μl)，分別做3個(gè)平行重復(fù)對(duì)照，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示(表5)，其ct值得變異系數(shù)為0.52-1.54％。對(duì)相同的模板，以相同的反應(yīng)條件分別在不同次的試驗(yàn)中進(jìn)行試驗(yàn)間重復(fù)，結(jié)果顯示(表6)，其ct值得變異系數(shù)為0.54-1.28％。說明本發(fā)明建立的sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法的具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。表5、實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測(cè)splcgv的試驗(yàn)內(nèi)重復(fù)結(jié)果表6、實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測(cè)splcgv的試驗(yàn)間重復(fù)結(jié)果2.4實(shí)時(shí)熒光定量pcr產(chǎn)物的序列測(cè)定為驗(yàn)證本發(fā)明所建立的sweepoviruses實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法所擴(kuò)增到的產(chǎn)物為目的片段，隨機(jī)將部分實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和序列測(cè)定。利用blast對(duì)所測(cè)序列與genbank中登錄的sweepoviruses病毒序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增的核苷酸序列與genbank中登陸的所有sweepoviruses病毒的核苷酸序列一致性均在91％以上，說明擴(kuò)增出的片段均為目的片段。2.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的應(yīng)用從田間采集15塊疑似感染雙生病毒的植株所結(jié)數(shù)塊，提取總dna作為模板，同時(shí)分別利用普通pcr和實(shí)時(shí)熒光定量pcr進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)薯塊帶毒情況。結(jié)果表明(表7)，15份樣品中sweepoviruses的檢出率為100％，與普通pcr結(jié)果一致。表7、2種檢測(cè)方法結(jié)果的比較以上所述僅為本發(fā)明最佳的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所<120>sweepoviruses病毒實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的通用引物、探針及其檢測(cè)方法<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ccctacactgggaatgctgt20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tgtgggacatccatcttgaa20<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3atacctaaggggtgtgtgggtccctgt27當(dāng)前第1頁12