本發(fā)明屬于靶基因片斷的快速檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種羅氏沼蝦螺原體可視化快速檢測試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

羅氏沼蝦螺原體(macrobrachiumrosenbergiispiroplasma，mrspi)是一種可引起羅氏沼蝦幼體和成蝦致死性疾病的病原微生物。其通過鰓、腸道和表皮進(jìn)入羅氏沼蝦體內(nèi)，在血細(xì)胞中寄生和增殖，進(jìn)而感染結(jié)締組織，引起羅氏沼蝦幼體活力和抗病力降低，引起羅氏沼蝦成蝦肌肉損傷和鰓水腫，進(jìn)而引起羅氏沼蝦幼體和成蝦死亡。羅氏沼蝦螺原體是我國新近發(fā)現(xiàn)并在羅氏沼蝦苗種中流行的新病原，該病原廣泛存在于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中，已在多種蝦類中被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，羅氏沼蝦螺原體在羅氏沼蝦育苗和養(yǎng)殖期間具有很高的感染風(fēng)險(xiǎn)。

專利一種檢測水生動(dòng)物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒(申請?zhí)枺?00710025337.8，申請日：2007-07-24，公開號：cn101105494a，公開日：2008-01-16)是一種利用免疫學(xué)原理進(jìn)行設(shè)計(jì)的檢測試劑盒，存在檢測步驟封鎖且靈敏度低的缺陷；專利蝦蟹螺原體病原的原位雜交檢測探針及試劑盒(申請?zhí)枺?01210443870.7，申請日：2012.11.08，公開號：cn103805680a，公開日：2014.05.21)是一種利用核酸雜交原理進(jìn)行設(shè)計(jì)的檢測試劑盒，存在對操作人員要求高、步驟繁瑣、檢測失敗率高等缺點(diǎn)。

因此，研制一種操作簡便、臨床實(shí)用、檢測靈敏度和特異性高的羅氏沼蝦螺原體檢測試劑盒，具有重要應(yīng)用經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種羅氏沼蝦螺原體可視化快速檢測試劑盒及方法，本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)，敏感性高；本發(fā)明羅氏沼蝦螺原體快速檢測方法利用所述試劑盒檢測，該方法方便、靈敏、準(zhǔn)確、快速。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用于檢測羅氏沼蝦螺原體擴(kuò)增用核酸引物組，該引物組包含引物mrspi-p1、引物mrspi-b1、引物mrspi-p2、引物mrspi-b2、引物mrspi-p3和引物mrspi-b3；

所述的引物mrspi-p1的核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述的引物mrspi-b1的核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述的引物mrspi-p2的核苷酸序列如seqidno：3所示；

所述的引物mrspi-b2的核苷酸序列如seqidno：4所示；

所述的引物mrspi-p3的核苷酸序列如seqidno：5所示；

所述的引物mrspi-b3的核苷酸序列如seqidno：6所示。

本發(fā)明還公開了一種羅氏沼蝦螺原體可視化快速檢測試劑盒，包括螺原體dna提取試劑和反應(yīng)試劑，所述的反應(yīng)試劑中含有上述的用于檢測羅氏沼蝦螺原體擴(kuò)增用核酸引物組。

進(jìn)一步地，所述螺原體dna提取試劑的成分為60mmtris、800mmnacl、20mmedta、1％體積百分比np-40的ph8.0的裂解液。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)試劑包括以下組分：

a)預(yù)反應(yīng)液：20mmph為8.8的tris-hc1、8mm硫酸鎂、15mm氯化鉀、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.5m甜菜堿、0.2μm引物mrspi-p1、0.2μm引物mrspi-b1、1.6μm引物mrspi-p2、1.6μm引物mrspi-b2、0.8μm引物mrspi-p3和0.8μm引物mrspi-b3；

所述的引物mrspi-p1的核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述的引物mrspi-b1的核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述的引物mrspi-p2的核苷酸序列如seqidno：3所示；

所述的引物mrspi-b2的核苷酸序列如seqidno：4所示；

所述的引物mrspi-p3的核苷酸序列如seqidno：5所示；

所述的引物mrspi-b3的核苷酸序列如seqidno：6所示；

b)反應(yīng)酶：每微升含8個(gè)活性單位的bst2.0dna聚合酶；

c)反應(yīng)封閉液：由礦物油或液體石蠟油組成；

d)反應(yīng)顯色液：含有10％sybrgreeni的熒光染料。

本發(fā)明還公開了一種利用上述的羅氏沼蝦螺原體的快速檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法，包括以下步驟：

1)dna抽提：取羅氏沼蝦幼體或苗或腸道或肝胰臟組織30-80mg于2ml離心管中，采用上述的螺原體dna提取試劑進(jìn)行dna提??；

2)對羅氏沼蝦螺原體基因進(jìn)行擴(kuò)增；

3)對步驟2)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顯色檢測。

進(jìn)一步地，步驟1)中的dna抽提具體為：取羅氏沼蝦幼體或苗或腸道或肝胰臟組織30-80mg于1.5ml離心管中，并向離心管加入上述的螺原體dna提取試劑200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均勻后，95℃以上加熱10分鐘左右，10000rpm離心10分鐘后，上清即為待檢dna模板，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步地，步驟2)中對羅氏沼蝦螺原體基因進(jìn)行擴(kuò)增具體為：

2.1)根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需反應(yīng)管數(shù)n，n＝樣品數(shù)+2，其中l(wèi)管為陽性對照，l管為陰性對照；

2.2)吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為n×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入nμl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清之混合液；

2.3)向設(shè)定的n個(gè)反應(yīng)管中分別加入23ul步驟2.2)得到的混合液，得到n個(gè)pcr反應(yīng)管，向上述n個(gè)pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、待檢dna模板和陽性對照各2ul；

2.4)在上述步驟2.3)得到的反應(yīng)管中再分別加入30ul反應(yīng)封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；

2.5)在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

進(jìn)一步地，所述的陽性對照為含有羅氏沼蝦螺原體基因的質(zhì)粒，所述的陰性對照為無核酸去離子水。

進(jìn)一步地，步驟3)中顯色檢測具體為：取出經(jīng)步驟2.2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lul反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，綠色判斷為陽性，淺黃色為陰性，觀察結(jié)束后將反應(yīng)管裝入密封袋，丟棄至特定區(qū)域。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明根據(jù)篩選的螺原體細(xì)胞分裂蛋白基因作為靶基因，進(jìn)行特異檢測用引物組設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了針對六個(gè)結(jié)合區(qū)的4條引物，只有六個(gè)結(jié)合區(qū)都能完全結(jié)合，整個(gè)反應(yīng)才能順利進(jìn)行，這增強(qiáng)了反應(yīng)的高度特異性；此外還設(shè)計(jì)了兩條環(huán)引物，可以將擴(kuò)增反應(yīng)速度增加至少一倍以上，同時(shí)也增加了反應(yīng)的靈敏度，僅需12個(gè)基因拷貝30分鐘就可以觀察到反應(yīng)體系的顏色變化；

2)本發(fā)明的快速診斷試劑盒在恒溫條件下反應(yīng)，并通過肉眼可見的顏色變化來判斷結(jié)果，這使得試劑盒的使用軟硬件條件簡單，可以避免其它生化試劑對人體的危害；

3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒還可通過肉眼觀察復(fù)印產(chǎn)生的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀來判斷結(jié)果，避免了反應(yīng)產(chǎn)物開蓋對環(huán)境的污染；

4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的可以通過肉眼判斷結(jié)果的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，不但使得羅氏沼蝦螺原體定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度高，而且該試劑盒是檢測羅氏沼蝦螺原體的第一個(gè)可視化檢測試劑盒，填補(bǔ)了羅氏沼蝦螺原體無快速檢測方法的缺口，具有很高的科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明引物特異性測試圖；其中，1：羅氏沼蝦螺原體；2：羅氏沼蝦雙順反子病毒；3：羅氏沼蝦野田村病毒；4：羅氏沼蝦紐締病毒；5：對蝦白斑綜合征病毒；6：產(chǎn)氣腸桿菌；7：嗜水氣單胞菌；8：健康羅氏沼蝦dna陰性對照；9：羅氏沼蝦螺原體基因陽性質(zhì)粒對照；

圖2是本發(fā)明靈敏性檢測圖；其中，1.1.2×10⁵copies；2.1.2×10⁴copies；3.1.2×10³copies；4.1.2×10²copies；5.1.2×10copies；6.1.2copies；7.健康羅氏沼蝦dna陰性對照。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明的思路為：本發(fā)明采用鏈置換酶和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過檢測羅氏沼蝦螺原體特定基因，來檢測羅氏沼蝦螺原體，這是目前國內(nèi)外首次建立的快速羅氏沼蝦螺原體檢測試劑盒。該方法的建立為羅氏沼蝦螺原體病的監(jiān)測和預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

實(shí)施例1羅氏沼蝦螺原體可視化快速檢測試劑盒

羅氏沼蝦螺原體可視化快速檢測試劑盒包括螺原體dna提取試劑和反應(yīng)試劑，該試劑盒僅需常規(guī)離心機(jī)和水浴鍋就可以完成核酸提取和檢測，并且整個(gè)檢測過程僅需2小時(shí)以內(nèi)，檢測產(chǎn)物封閉觀察，不會污染環(huán)境，此外，檢測結(jié)果可以通過肉眼觀察顏色變化，就可以判斷結(jié)果，實(shí)用強(qiáng)。

其中，螺原體dna提取試劑為成分為60mmtris、800mmnacl、20mmedta、1％體積百分比np-40的ph8.0的裂解液。

反應(yīng)試劑包括以下組分：

a)預(yù)反應(yīng)液：20mmph為8.8的tris-hc1、8mm硫酸鎂、15mm氯化鉀、10mm硫酸按、0.12％tween-20、1.4mmdntp、0.5m甜菜堿、0.2μm引物mrspi-p1、0.2μm引物mrspi-b1、1.6μm引物mrspi-p2、1.6μm引物mrspi-b2、0.8μm引物mrspi-p3和0.8μm引物mrspi-b3；

其中，引物mrspi-p1的核苷酸序列如seqidno：1所示；

引物mrspi-b1的核苷酸序列如seqidno：2所示；

引物mrspi-p2的核苷酸序列如seqidno：3所示；

引物mrspi-b2的核苷酸序列如seqidno：4所示；

引物mrspi-p3的核苷酸序列如seqidno：5所示；

引物mrspi-b3的核苷酸序列如seqidno：6所示。

b)反應(yīng)酶：每微升含8個(gè)活性單位的bst2.0dna聚合酶；

c)反應(yīng)封閉液：由礦物油或液體石蠟油組成；

d)反應(yīng)顯色液：含有10％sybrgreeni的熒光染料。

實(shí)施例2利用實(shí)施例1所述的羅氏沼蝦螺原體快速檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法

(1)dna抽提：

取羅氏沼蝦幼體或苗或腸道或肝胰臟組織30-80mg于1.5ml離心管中，并向離心管加入上述螺原體dna提取試劑200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均勻后，95℃以上加熱10分鐘左右，10000rpm離心10分鐘后，上清即為待檢dna模板，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)羅氏沼蝦螺原體基因的快速擴(kuò)增：

根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需快速反應(yīng)管數(shù)n，n＝樣品數(shù)+2，其中l(wèi)管為陽性對照(含有羅氏沼蝦螺原體基因的質(zhì)粒)，l管為陰性對照(無核酸去離子水)；吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為n×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入nμl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的n個(gè)反應(yīng)管中分別加入23ul混合液，并向n個(gè)pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、待檢dna模板和陽性對照各2ul；然后在每個(gè)反應(yīng)管中再分別加入30ul封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

(3)顯色檢測：

取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lul顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，若顯示綠色，說明樣品中含有羅氏沼蝦螺原體核酸，顯示為淺黃色則無羅氏沼蝦螺原體核酸。

上述預(yù)反應(yīng)液含有：20mmph為8.8的tris-hc1、8mm硫酸鎂、15mm氯化鉀、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.5m甜菜堿、0.2μm引物mrspi-p1、0.2μm引物mrspi-b1、1.6μm引物mrspi-p2、1.6μm引物mrspi-b2、0.8μm引物mrspi-p3和0.8μm引物mrspi-b3，其中所述的引物mrspi-p1序列如seqidno：1所示；所述的引物mrspi-b1序列如seqidno：2所示；所述的引物mrspi-p2序列如seqidno：3所示；所述的引物mrspi-b2序列如seqidno：4所示；所述的引物mrspi-p3的核苷酸序列如seqidno：5所示；所述的引物mrspi-b3的核苷酸序列如seqidno：6所示。

實(shí)施例3羅氏沼蝦螺原體快速檢測試劑盒特異性檢測

(1)dna抽提：

取羅氏沼蝦螺原體陽性組織樣本30-80mg于1.5ml離心管中，并向各個(gè)離心管加入dna提取試劑裂解液200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均勻后，95℃以上加熱10分鐘左右，10000rpm離心10分鐘后，上清即為待檢dna模板，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)羅氏沼蝦螺原體基因的快速擴(kuò)增：

設(shè)置9個(gè)快速反應(yīng)管數(shù)；吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為9×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入9μl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的9個(gè)反應(yīng)管中分別加入23ul混合液，并向9個(gè)pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、羅氏沼蝦螺原體dna模板、羅氏沼蝦雙順反子病毒核酸、羅氏沼蝦野田村病毒核酸、羅氏沼蝦紐締病毒核酸、對蝦白斑綜合征病毒核酸、產(chǎn)氣腸桿菌核酸、嗜水氣單胞菌核酸和陽性對照各2ul；然后在每個(gè)反應(yīng)管中再分別加入30ul封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

(3)顯色檢測：

取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lul顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，若顯示綠色，說明樣品中含有羅氏沼蝦螺原體核酸，顯示為淺黃色則無羅氏沼蝦螺原體核酸，結(jié)果見圖1，僅羅氏沼蝦螺原體和羅氏沼蝦螺原體基因模板擴(kuò)增后顯色為陽性綠色，其它病毒或細(xì)菌顯色都為陰性淺黃色，表明對其它病毒無交叉擴(kuò)增性。

實(shí)施例4羅氏沼蝦螺原體快速檢測試劑盒靈敏度檢測

(1)dna模板設(shè)置：

取已被定量的羅氏沼蝦螺原體dna樣品進(jìn)行梯度稀釋，設(shè)置螺原體核酸拷貝數(shù)濃度分別為：1.2×10⁵copies/μl；1.2×10⁴copies/μl；1.2×10³copies/μl；1.2×10²copies/μl；1.2×10copies/μl；1.2copies/μl；-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)羅氏沼蝦螺原體基因的快速擴(kuò)增：

設(shè)置7個(gè)快速反應(yīng)管數(shù)，其中l(wèi)管為陰性對照(無核酸去離子水)；吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為7×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入7μl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的7個(gè)反應(yīng)管中分別加入23ul混合液，并向7個(gè)pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照和待檢6個(gè)稀釋度的螺原體dna模板各2ul；然后在每個(gè)反應(yīng)管中再分別加入30ul封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

(3)顯色檢測：

取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lul顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，若顯示綠色，說明樣品中含有羅氏沼蝦螺原體核酸，顯示為淺黃色則無羅氏沼蝦螺原體核酸，結(jié)果見圖2，經(jīng)real-timepcr定量后的羅氏沼蝦螺原體dna系列稀釋的擴(kuò)增顯色圖，當(dāng)反應(yīng)體系中加入12個(gè)螺原體基因拷貝的dna，擴(kuò)增顯色結(jié)果就為陽性。

本發(fā)明利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測羅氏沼蝦螺原體的檢測試劑盒，在已試驗(yàn)的4種不同的病毒、2種細(xì)菌和1種螺原體進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果僅羅氏沼蝦螺原體和羅氏沼蝦螺原體對應(yīng)基因?yàn)殛栃?，其它均為陰性，說明該檢測方法特異性高。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江省淡水水產(chǎn)研究所

<120>一種羅氏沼蝦螺原體可視化快速檢測試劑盒及方法

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttggagcggaaggaacta18

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gtcatcgtcatcatcatcgt20

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gggatcacccgcagattcttttgaagaagagtatcaccaagatg44

<210>4

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tggttcgcaaacgaccaagttatttacatgttctcttcacgcatta46

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tcatcgctaactggttcatcat22

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

catgagaatgctaatcgtcgc21