本發(fā)明涉及細胞免疫治療領域，具體涉及一種體外擴增淋巴細胞的培養(yǎng)體系及擴增方法和應用。

背景技術：

nk細胞(自然殺傷細胞，naturalkillercell)又稱為大顆粒性淋巴細胞。和γδt細胞，nkt細胞在形式和功能上行使著連接獲得性免疫和固有免疫橋梁的作用。一方面，當機體發(fā)生感染及創(chuàng)傷時，nk細胞以防御者的身份通過非肽-mhc的識別方式快速，廣泛，特異地識別抗原，及時地清除病原微生物，變異細胞，發(fā)揮固有免疫的作用。另一方面nk細胞被認為也部分參與了適應性免疫應答，能夠影響αβt細胞和b細胞的效應功能。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，nk細胞既可以通過活化性受體直接識別腫瘤細胞并被活化，也可以被輔助細胞(單核細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞等)活化。這些輔助細胞通過其模式識別受體來應答內外環(huán)境的變化，再通過分泌多種可溶性因子或直接接觸的方式將信號傳導給nk細胞。在人類，已經證實存在的可溶性因子有il12，il-18，typeiifn,tnf-α等；直接接觸的分子有gitrl/gitr,cd48/2b4，micaormicborulbp1-ulbp3/nkg2d,aicl/nkp80等?；谝陨显碓隗w外擴增活化的nk細胞對腫瘤細胞顯示出良好的殺傷活性，并應用于腫瘤生物治療中。

目前制約nk細胞的臨床應用的主要障礙之一就是難以得到足夠數(shù)量的nk細胞。如何在體外實現(xiàn)nk細胞大規(guī)模擴增是目前nk細胞治療的關鍵問題。外周血中nk細胞僅占很小的部分。而腫瘤病人的外周血中往往nk細胞的數(shù)量和活性有明顯的下降。不同人nk細胞的性質有很大差異。應用嵌合抗原受體(car)修飾nk細胞來治療腫瘤也對nk細胞數(shù)量有很高要求。所以尋找高效的個性化的nk細胞大規(guī)模擴增方法對nk細胞的臨床應用有重大意義。

近年，人工抗原提呈細胞(使用基因工程技術制作的滋養(yǎng)層細胞)越來越多的用于nk細胞的體外擴增。比如把膜結合il15和4-1bbl導入k562細胞，這種方法得到的人工抗原提呈細胞可以將nk細胞在21天平均擴增277倍。把mica和4-1bbl導入k562細胞，并加以il15刺激nk細胞可在24天平均擴增550倍.把mil21，4-1bbl，cd64，cd86，tcd19導入k562細胞，這種方法得到的人工抗原提呈細胞可以將nk細胞3周平均擴增一萬倍以上。

cn103484429a公開了一種nk細胞的高效制備方法，即通過聯(lián)合細胞因子和飼養(yǎng)細胞的刺激作用，提高nk細胞的增殖速度和純度。該發(fā)明將ncr3lg1和mil-15同時轉染到k562細胞，mil-15可以調節(jié)nk細胞的活化和增殖，而ncr3lg1作為nk細胞表面主要的活化受體之一nkp30的配體，可以有效的刺激nk細胞活化，且兩者有協(xié)同作用。再加上游離添加的il-2和il-21等因子的刺激，可以在21天的培養(yǎng)時間內，使pbmc細胞數(shù)量得到超過500倍的增殖，cd3^-cd56⁺nk細胞的比例超過70％。

但目前的擴增方法都不能滿足臨床對nk細胞的大量需求，提供一種快速擴增nk細胞的方法是一個亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種體外擴增淋巴細胞的培養(yǎng)體系及擴增方法和應用，所述培養(yǎng)體系和方法在提高臨床應用安全性同時，有效提升nk細胞培養(yǎng)增殖效率，擴大nk細胞的應用。

為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種體外擴增淋巴細胞的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述培養(yǎng)體系包括：白細胞介素21(il-21)、白細胞介素12(il-12)和cd80的混合物。

本發(fā)明中，采用白細胞介素21、白細胞介素12和cd80的混合物來共培養(yǎng)淋巴細胞，使得淋巴細胞中的nk細胞快速增長，能獲得高純度的nk細胞，nk細胞的擴增數(shù)量也比使用轉染跨膜白介素21和cd137的k562滋養(yǎng)細胞擴增的方法效率提高5.5倍。

優(yōu)選地，所述白細胞介素21、白細胞介素12和cd8的比例為(1-5):(0.5-3):1，例如可以是1:0.5:1、1:0.8:1、1:1:1、1:1.5:1、1:2:1、1:2.5:1、1:3:1、2:0.5:1、2:0.8:1、2:1:1、2:1.5:1、2:2:1、2:2.5:1、2:3:1、3:0.5:1、3:0.8:1、3:1:1、3:1.5:1、3:2:1、3:2.5:1、3:3:1、4:0.5:1、4:0.8:1、4:1:1、4:1.5:1、4:2:1、4:2.5:1、4:3:1、5:0.5:1、5:0.8:1、5:1:1、5:1.5:1、5:2:1、5:2.5:1或5:3:1，優(yōu)選為(1-3):(0.8-2):1，進一步優(yōu)選為2:2:1。

優(yōu)選地，所述混合物的添加量為10-1000pmol，例如可以是10pmol、20pmol、30pmol、40pmol、50pmol、60pmol、70pmol、80pmol、90pmol、100pmol、150pmol、200pmol、250pmol、300pmol、350pmol、400pmol、450pmol、500pmol、550pmol、600pmol、650pmol、700pmol、750pmol、800pmol、850pmol、900pmol、950pmol或1000pmol，優(yōu)選為100-800pmol，進一步優(yōu)選為300-500pmol。

優(yōu)選地，所述白細胞介素21、白細胞介素12和cd80為共表達在宿主細胞中，優(yōu)選為共表達在同一個宿主細胞中。

本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將白細胞介素21、白細胞介素12和cd80分別表達在不同的宿主中可以刺激淋巴細胞的擴增，將白細胞介素21、白細胞介素12和cd80共表達在同一個宿主細胞中，可以進一步刺激淋巴細胞的擴增，淋巴細胞擴增的數(shù)量相比于表達在不同宿主中時增多。

優(yōu)選地，所述白細胞介素12為由白細胞介素12a和白細胞介素12b的組成，所述白細胞介素12a和白細胞介素12b表達出來的蛋白會直接結合形成白細胞介素12。

本發(fā)明中，所述白細胞介素21、白細胞介素12和cd80是通過將含有白細胞介素21的基因、白細胞介素12a的基因、白細胞介素12b的基因和cd80基因的不同載體質粒導入宿主細胞得到的。

本發(fā)明中，所述白細胞介素21的基因、白細胞介素12a的基因、白細胞介素12b的基因和cd80基因中的一個氨基酸或多個氨基酸的改變，若不影響蛋白質的性能，都在本申請的保護范圍之內。

本發(fā)明中，k562細胞為跨膜白介素21、白介素il12和cd80的載體。所述載體包括但不僅僅限于金屬、玻璃、塑料、聚合物、脂質體、磷脂雙分子層、細胞膜和類似物。重要的是載體表面能夠粘附上述蛋白質，并且不影響蛋白質的生物活性。

優(yōu)選地，所述白細胞介素21與跨膜蛋白的跨膜區(qū)和胞外區(qū)相連，共表達為一個融合蛋白；所述白細胞介素12a和/或白細胞介素12b與跨膜蛋白的跨膜區(qū)和胞外區(qū)相連，共表達為一個融合蛋白，優(yōu)選為白細胞介素12b與跨膜蛋白的跨膜區(qū)和胞外區(qū)相連，共表達為一個融合蛋白；所述cd80與跨膜蛋白的跨膜區(qū)和胞外區(qū)相連，共表達為一個融合蛋白；優(yōu)選的所述跨膜蛋白為cd4跨膜蛋白。

本發(fā)明中，可以從高表達跨膜白介素21、白介素il12a、跨膜白介素12b和cd80的細胞株里分離純化出蛋白，所述純化技術包括但不限于以下方法：硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素法，所述高效液相色譜法(hplc)可作最后的純化步驟進一步純化蛋白質。

優(yōu)選地，所述宿主細胞為k562細胞。

本發(fā)明k562細胞通過基因工程技術表達跨膜il-21、il-12、cd80，改造為刺激型工程細胞，使得il-21、il-12、cd80在細胞生物膜上正常表達，體外刺激淋巴細胞生長。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)體系還包括白細胞介素2，所述白細胞介素2的添加量為50-400u/ml，例如可以是50u/ml、55u/ml、60u/ml、65u/ml、70u/ml、80u/ml、90u/ml、100u/ml、110u/ml、120u/ml、130u/ml、150u/ml、160u/ml、180u/ml、200u/ml、210u/ml、220u/ml、230u/ml、250u/ml、260u/ml、280u/ml、300u/ml、320u/ml、330u/ml、350u/ml、360u/ml、380u/ml或400u/ml，優(yōu)選為80-200u/ml。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)體系還包括培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為rpmi1640和1-10％人血清或rpmi1640和1-10％胎牛血清。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)體系包括培養(yǎng)液、k562細胞和白細胞介素2，其中，所述培養(yǎng)液為rpmi1640和1-10％人血清或rpmi1640和1-10％胎牛血清，所述k562細胞包括白細胞介素21、白細胞介素12a、白細胞介素12b和cd80。

第二方面，本發(fā)明提供一種淋巴細胞的擴增方法，利用如第一方面所述的培養(yǎng)體系，以淋巴細胞為原料，進行培養(yǎng)5-10天，補加培養(yǎng)體系，再培養(yǎng)5-10天。

優(yōu)選地，所述補加培養(yǎng)體系的次數(shù)為1-5次，例如可以是1次、2次、3次、4次或5次，優(yōu)選為2-3次。

優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)的條件為37℃，5％co2。

優(yōu)選地，所述淋巴細胞為純化的或未純化的包含淋巴細胞的細胞組合，優(yōu)選為外周血單核細胞和/或純化的nk細胞。

本發(fā)明中，所述k562工程細胞通過輻照等方法，去除k562細胞活性后，再加入擴增nk細胞培養(yǎng)體系。

優(yōu)選地，所述k562工程細胞與所述單核細胞的比例為1:(0.25-5)，例如可以是1:0.25、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.5、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.5、1:4.8或1:5，優(yōu)選為1:(1-4)，進一步優(yōu)選為1:(3-4)。

作為優(yōu)選技術方案，所述的nk細胞的擴增方法包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)：采集純化的或未純化的包含淋巴細胞的細胞組合，優(yōu)選為外周血單核細胞和/或純化的nk細胞；

(2)培養(yǎng)體系制備：將所述k562細胞進行采用劑量為100-500gy輻照滅活，再加入培養(yǎng)液中，再向培養(yǎng)液中加入50-400u/ml的白細胞介素2；

(3)擴增：將步驟(1)得到的細胞加入步驟(2)所述的培養(yǎng)液中，所述k562工程細胞與所述單核細胞的比例為1:(0.25-5)，培養(yǎng)5-10天，離心獲得單核細胞，再次補加培養(yǎng)體系，再培養(yǎng)5-10天；

(4)收獲：培養(yǎng)結束后離心收集獲得的淋巴細胞。

第三方面，本發(fā)明提供一種淋巴細胞的體內擴增方法，其特征在于，將權利要求1-5中任一項所述的培養(yǎng)體系中的白細胞介素21、白細胞介素12和cd80的混合物輸入體內或將培養(yǎng)體系中的k562細胞輸入體內。

優(yōu)選地，所述k562細胞中包括白細胞介素21、白細胞介素12和cd80的組合。

優(yōu)選地，所述輸入的劑量為0.1-800pm，例如可以是0.1pm、0.2pm、0.3pm、0.5pm、0.8pm、1pm、2pm、3pm、5pm、8pm、10pm、20pm、30pm、50pm、80pm、100pm、150pm、200pm、250pm、300pm、350pm、400pm、450pm、500pm、550pm、600pm、650pm、700pm、750pm或800pm，優(yōu)選為0.5-500pm。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的擴增方法擴增的淋巴細胞。

本發(fā)明中，所述淋巴細胞可以用來進行自體移植和異體移植，捐助人被激活和擴增的淋巴細胞可以通過靜脈滴注等方式注入到被捐助人的血管中。

第四方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的擴增方法擴增的淋巴細胞用于制備治療腫瘤性疾病和/或傳染性疾病的藥物。

優(yōu)選地，所述腫瘤性疾病選自但不限于急性髓細胞性白血病、膠質細胞瘤、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤、腎細胞惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌或肝癌中的任意一種或至少兩種的組合；

優(yōu)選地，所述傳染性疾病為細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染中任意一種或至少兩種組合感染的疾??；所述傳染性疾病選自但不限于乙型肝炎、丙型肝炎或艾滋病中的任意一種或至少兩種的組合。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明培養(yǎng)體系培養(yǎng)，批次獲得nk細胞質量均一、穩(wěn)定，適合規(guī)?；叫蟹糯?，解決了高純度nk細胞體外培養(yǎng)快速規(guī)模擴增技術問題；

(2)本發(fā)明培養(yǎng)體系擴增的nk細胞純度高，對腫瘤細胞殺傷力強，體外培養(yǎng)第14天nk細胞可擴增約9100倍，獲得具有高活性的nk細胞，達到各種臨床適合治療病癥預期療效應用要求；

(3)本發(fā)明培養(yǎng)體系擴增的淋巴細胞，達到各種臨床應用nk細胞適合治療病癥對nk細胞的數(shù)量，活性和安全性的要求，有效降低淋巴細胞的應用成本，為淋巴細胞過繼免疫治療的廣譜應用奠定了基礎。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中宿主細胞同時表達跨膜白介素21、白介素il12a、跨膜白介素12b和cd80的結構示意圖；

圖2為體外pbmc與所述k562工程細胞共培養(yǎng)所得到的淋巴細胞數(shù)量的線性圖；

圖3為體外pbmc與所述k562工程細胞共培養(yǎng)14天后，對所得淋巴細胞進行流式分析，檢測nk細胞(cd3-cd56+)的比例；

圖4為體外pbmc與所述k562工程細胞共培養(yǎng)所得nk細胞與hela細胞混合(使用icelligence實時無標記細胞功能分析儀)得到的實時無標記細胞功能分析數(shù)據(jù)。，其中，control為對照組，是將pbmc細胞與轉染了跨膜白介素21，cd137l的k562細胞共培養(yǎng)14天得到nk細胞，然后將此nk細胞與hela細胞混合。

具體實施方式

為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術手段及其效果，以下結合本發(fā)明的優(yōu)選實施例來進一步說明本發(fā)明的技術方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內。

實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產品。

實施例1基因工程細胞的制備

基因工程細胞的制備方法如下：首先構建能穩(wěn)定表達跨膜白介素21,白介素il12a,跨膜白介素12b和cd80的載體。載體上有選擇標記基因?？缒ぐ捉樗?1或跨膜白介素12b是通過cd4的跨膜部分連接到細胞膜上，白介素il12a和cd80為跨膜蛋白。將這些載體轉染k562細胞，用抗生素和流式細胞儀選擇高表達的細胞克隆。

實施例2淋巴細胞擴增培養(yǎng)體系的配制

將實施例1制備的基因工程細胞用于淋巴細胞的擴增，包括以下步驟：

(1)滅活基因工程細胞：通過100gy放射線照射30分鐘，獲得滅活的k562工程細胞；

(2)配制培養(yǎng)基：取淋巴細胞培養(yǎng)液rpmi1640和10％胎牛血清，再向混合培養(yǎng)基加入步驟(1)滅活的k562工程細胞，添加量為1×10⁶/ml，再添加il-2，il-2的添加量為50u/ml。

實施例3健康志愿者淋巴細胞的擴增

(1)培養(yǎng)：采集新鮮健康志愿者血液，經離心收集血清儲存，經淋巴分離液分離獲得人外周血單個核細胞(pbmc)，接種密度為1×10⁶/ml(根據(jù)所述k562工程細胞與所述單核細胞的比例為1:1)，接種到體外擴增淋巴細胞的培養(yǎng)體系中；

(2)擴增：37℃，5％co2條件下培養(yǎng)7天，再加入上述培養(yǎng)體系，再培養(yǎng)7天；

(3)收獲：培養(yǎng)結束后離心收集獲得nk細胞。

采用轉染跨膜白細胞介素21、cd137l的k562細胞與pbmc細胞共培養(yǎng)得到的nk細胞作為對照；

采用自動細胞計數(shù)儀對擴增的nk細胞進行計數(shù)，并繪制曲線，生長曲線如圖2所示，可以看出，nk細胞在轉染跨膜白介素21，cd137l的k562滋養(yǎng)細胞和低劑量白介素2的共同作用下，數(shù)量顯著增加，nk細胞數(shù)量在7天時進入對數(shù)生長期，14天時約增長1600倍。

轉染跨膜白介素21，白介素il12a，跨膜白介素12b和cd80的k562滋養(yǎng)細胞對于促進外周血淋巴細胞中nk細胞生長的作用明顯強于轉染跨膜白介素2和cd137的k562滋養(yǎng)細胞，白介素21，白介素il12a，白介素12b和cd80和低劑量白介素2擴增激活nk細胞的方法比用僅轉染跨膜白介素21和cd137的k562細胞激活擴增nk細胞的方法，擴增的效率高5.5倍，兩個星期后，細胞的數(shù)量增加到9100倍。

從圖3可以看出，第14天時90％以上的淋巴細胞為cd3-cd56+nk細胞。

實施例4健康志愿者淋巴細胞的擴增

培養(yǎng)與擴增方法同實施例3，采集健康新鮮血液經離心收集血清儲存，接種密度為2×10⁶/ml，進行培養(yǎng)。

其培養(yǎng)結果類似實施例3，后續(xù)試驗采用實施例3培養(yǎng)的淋巴細胞。

實施例5健康志愿者淋巴細胞的擴增

培養(yǎng)與擴增方法同實施例3，采集健康新鮮血液經離心收集血清儲存，接種密度為3×10⁶/ml，進行培養(yǎng)。

其培養(yǎng)結果類似實施例3，后續(xù)試驗采用實施例3培養(yǎng)的淋巴細胞。

實施例6擴增后的淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用

采用實施例3擴增的淋巴細胞與人宮頸癌細胞hela細胞進行裂解測試，人宮頸癌細胞hela細胞作為裂解測試的靶細胞，在裂解實驗的前一天將hela細胞鋪在icelligence實時無標記細胞功能分析儀的細胞檢測板上。第二天將擴增的nk細胞和靶細胞按照適當?shù)谋壤餐囵B(yǎng)，使用實時無標記細胞功能分析儀(美國艾森icelligence)得到實時的細胞指數(shù)曲線；

裂解測試對照組中，使用了轉染跨膜白介素21和cd137的k562滋養(yǎng)細胞擴增的淋巴細胞。

結果如圖4所示，與對照組相比，本申請擴增的淋巴細胞對hela細胞的裂解作用顯著增強。

綜上所述，采用本發(fā)明培養(yǎng)體系擴增的淋巴細胞，nk細胞純度高，對腫瘤細胞殺傷力強，在第14天可以將nk細胞擴增約9100倍。達到各種臨床應用nk細胞適合治療病癥對nk細胞的數(shù)量，活性和安全性的要求，有效降低nk細胞的應用成本，為nk細胞過繼免疫治療的廣譜應用奠定了基礎。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內。