本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因dna序列，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(實(shí)時(shí)pcr，real-time-pcr，)的方法來研究該基因的表達(dá)，并使用大腸桿菌bl21菌株表達(dá)蛋白u(yù)gt366，及研究對氣味物質(zhì)的降解功能。

背景技術(shù)：

暗黑鰓金龜在我國大部分省(區(qū))都有分布。成蟲食性較雜，主要取食榆樹、楊樹、柳樹、花生、大豆、玉米等植物葉片。幼蟲稱為蠐螬，是農(nóng)區(qū)地下害蟲的重要優(yōu)勢種之一，其在土中棲息，隱蔽為害，生活世代長，發(fā)生規(guī)律復(fù)雜，是國內(nèi)外公認(rèn)的難于防治的害蟲。長期以來，我國對地下害蟲蠐螬的控制主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，因而造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境污染的問題日趨嚴(yán)重。昆蟲的嗅覺系統(tǒng)與其取食等各種行為息息相關(guān)，鑒于此，從研究嗅覺相關(guān)基因入手，對暗黑鰓金龜?shù)臍馕督到饷富蜻M(jìn)行挖掘和機(jī)制的探討，可以為開拓防治地下害蟲的新思路提供理論基礎(chǔ)。

氣味降解酶是一種選擇性進(jìn)化出來的酶類，主要功能是迅速降解氣味分子，當(dāng)氣味分子完成對氣味受體的刺激后，氣味分子在降解酶的作用下被快速分解，進(jìn)而嗅覺受體神經(jīng)元反應(yīng)終止，以避免對受體的持續(xù)刺激。在昆蟲觸角中發(fā)現(xiàn)幾種表達(dá)量非常高的氣味降解酶類，分別是羧酸酯酶(cces)、細(xì)胞色素p450氧化還原酶(p450s)、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gsts)、醛氧化酶(aox)和尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(ugts)等。

尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(ugts)分布廣泛，其催化的糖基化反應(yīng)是生物體內(nèi)非常重要的代謝途徑。在昆蟲中，它主要催化糖基基團(tuán)從活化的udp-葡萄糖供體中轉(zhuǎn)移到受體疏水小分子-糖苷配基上，從而使疏水分子形成更親水的化合物，以利于高效降解排出，ugts是潛在的氣味降解酶之一。

隨著功能基因組的發(fā)展，生物信息學(xué)技術(shù)應(yīng)用的日臻成熟，有關(guān)昆蟲如何識(shí)別氣味分子等方面均有了深入的研究，對于昆蟲嗅覺系統(tǒng)的分子機(jī)制有了更深刻的認(rèn)識(shí)。盡管如此，但仍然存在許多問題，例如觸角中存在哪些ugts，ugts在氣味降解中發(fā)揮作用的內(nèi)在分子機(jī)制等。目前鮮有關(guān)于鞘翅目昆蟲嗅覺感器中氣味降解酶和氣味降解機(jī)制的研究報(bào)道，特別是關(guān)于鰓金龜類害蟲中尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶在氣味降解中的作用機(jī)理研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過生物信息學(xué)分析，在暗黑鰓金龜觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出一個(gè)尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt366，并結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其與同為鞘翅目的赤擬谷盜ugts親緣性較近，且在不同物種間具有廣泛的表達(dá)模式。利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，檢測基因ugt366在觸角、頭、胸、腹、足、翅各組織中的表達(dá)模式，該基因在觸角中高表達(dá)。本發(fā)明對基因ugt366進(jìn)行了克隆，并利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了目的蛋白的表達(dá)，經(jīng)sds-page檢測和質(zhì)譜分析確認(rèn)了表達(dá)的蛋白u(yù)gt366為尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明采用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行蛋白u(yù)gt366體外活性實(shí)驗(yàn)，鑒定表達(dá)的蛋白是否具有酶活性以及能否降解氣味分子。與傳統(tǒng)hplc方法相比更直觀精確，可以通過檢測反應(yīng)過程中底物的分子量變化，鑒定目的蛋白的活性及降解機(jī)制。本發(fā)明中，蛋白u(yù)gt366對氣味分子鄰苯二甲酸二丁酯有降解活性，起到了氣味降解酶的作用。

本發(fā)明提供了暗黑鰓金龜中一種含尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶功能域的與氣味分子降解有關(guān)的蛋白及其編碼基因序列，通過生物信息學(xué)對該基因進(jìn)一步解析并利用體外的糖基化反應(yīng)進(jìn)行功能驗(yàn)證：

本發(fā)明提供的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因，名稱為ugt366，其核苷酸序列如seqidno：1所示。通過暗黑鰓金龜觸角轉(zhuǎn)錄組庫中得到基因ugt366。該基因共由1711個(gè)堿基組成，完整的開放閱讀框含有1569bp，同時(shí)還含有5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)序列，開放閱讀框的起始密碼子為atg，終止密碼子為tag。

本發(fā)明所提供的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白u(yù)gt366，來源于暗黑鰓金龜，具有降解氣味分子的能力，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

所述尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白u(yù)gt366的編碼基因ugt366，其編碼基因ugt366的編碼序列為編碼序列表中seqidno:1的核苷酸分子。

一種重組表達(dá)載體，含有尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白u(yù)gt366的編碼基因ugt366。

一種重組菌，含有尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白u(yù)gt366的編碼基因ugt366。

序列表中的序列2根據(jù)dnaman分析，蛋白由525個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)8.40，蛋白總量59.71kda。蛋白親水性平均系數(shù)(gravy)為0.082，具有弱疏水性，根據(jù)netnglyc1.0分析含有4個(gè)n-糖基化位bi點(diǎn)，signalp4.1和tmhmm2.0網(wǎng)站預(yù)測蛋白具有信號肽及跨膜區(qū)。

本發(fā)明涉及的原核表達(dá)載體pet-28a(+)與基因ugt366重組為pet28a-ugt366，該原核表達(dá)載體除了含有基因ugt366的編碼dna序列外，還攜帶有蛋白純化的6xhistag等外源基因蛋白高效表達(dá)所需的各種調(diào)控元件，且該重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌bl21，該重組菌含有尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因ugt366，可以表達(dá)蛋白u(yù)gt366。

本發(fā)明通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測了該基因在暗黑鰓金龜頭、胸、腹、足、翅、觸角六個(gè)組織中的相對表達(dá)量且在觸角中高表達(dá)，進(jìn)一步推測該基因與嗅覺機(jī)制有關(guān)，參與氣味物質(zhì)的降解。

本發(fā)明在通過表達(dá)的蛋白u(yù)gt366與氣味物質(zhì)體外的糖基化反應(yīng)研究后，基因ugt366表達(dá)的蛋白u(yù)gt366可以與氣味分子發(fā)生糖基化反應(yīng)，具有氣味降解酶的能力。

附圖說明

圖1暗黑鰓金龜觸角總rna提取圖片

圖2為基因ugt366在ncbi中功能域比對分析結(jié)果

圖3為基因ugt366與其它物種的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4為基因ugt366在暗黑鰓金龜頭、胸、腹、足、翅、觸角中的相對表達(dá)量

圖5為基因ugt366克隆pcr擴(kuò)增凝膠電泳圖

圖6為pet28a-ugt366重組質(zhì)粒pcr擴(kuò)增凝膠電泳圖

圖7為蛋白u(yù)gt366在bl21中的蛋白表達(dá)檢測

圖8為蛋白u(yù)gt366與氣味物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯糖基化反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：基因ugt366的生物信息學(xué)分析

通過對暗黑鰓金龜觸角進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt366的核苷酸序列及尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白u(yù)gt366的氨基酸序列，通過ncbi分析，尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt366具有完整的orf及結(jié)構(gòu)域(udpgt)，并且通過預(yù)測顯示蛋白u(yù)gt366為糖基轉(zhuǎn)移酶(gt)家族中的gt-b超家族類型(圖2)。expasy-computepi/mw分析蛋白質(zhì)的分子量為59.71，等電點(diǎn)為8.40。

由mega6.0構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖3)，包括暗黑鰓金龜(holotrichiaparallela)的20個(gè)ugts、赤擬谷盜(triboliumcastaneum)的42個(gè)ugts、埃及伊蚊(aedesaegypti)的30個(gè)ugts以及意大利蜜蜂(apismellifera)的10個(gè)ugts。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，基因ugt366與赤擬谷盜tcas008192323節(jié)點(diǎn)處自展值為97％，與埃及伊蚊aaeg001650803和意大利蜜蜂amel394772自展值為100％，推測這四種ugts可能為同一類或同一家族基因，且在不同物種間廣泛存在。

實(shí)施例二：基因ugt366在暗黑鰓金龜各組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量pcr使用的試劑為takara公司的熒光定量試劑premixextaq^tmii，儀器為abi-7500熒光定量pcr儀，選取gapdh為內(nèi)參基因，檢測基因ugt366在雌雄暗黑鰓金龜各組織中的轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，55℃退火延伸10秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95℃變性15秒，60℃退火延伸1分鐘，95℃變性15秒；60℃延伸15秒。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量pcr說明書，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)合適引物，并由華大基因公司合成，ugt366-f：ggaaagacatcccgcactcg，ugt366-r：ataaacccgttctcgccgc。計(jì)算靶標(biāo)基因的相對表達(dá)量采用2^-δδct法，顯著性分析采用graphpadinstat3軟件，結(jié)果顯示該基因在觸角中高表達(dá)(圖4)。

實(shí)施例三：基因ugt366的克隆

選取暗黑鰓金龜雄蟲為實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行觸角分離，提取觸角rna(圖1)，并反轉(zhuǎn)錄成cdna，以暗黑鰓金龜雄蟲觸角cdna為模板，利用設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，得到目的基因完整的orf(圖5)。

1.rna的提取：

(1)取組織材料于液氮中備用，將1mlrna提取劑rnaisoplus加入到勻漿器后，將材料置于勻漿器中充分研磨，轉(zhuǎn)移至ep管中，全程在冰上操作；

(2)在含有組織材料的ep管中加入充分冷卻的氯仿200μl，上下顛倒充分混勻后，放置冰上5min，然后4℃，12000g條件離心15min；

(3)離心結(jié)束后，吸取上層無色透明水相轉(zhuǎn)移至新的無rna酶ep管中，加入等體積的充分冷卻的異丙醇，輕輕混勻，然后置于-20℃冰箱中10min，靜置后4℃，12000g條件離心10min，在ep管的底部有沉淀；

(4)小心傾倒上清，然后將1ml無水乙醇充分預(yù)冷后沿管壁緩慢加入，用振蕩儀劇烈振蕩幾秒，然后4℃，12000g條件離心5min；

(5)盡量傾倒全部乙醇，室溫條件下?lián)]發(fā)2-5min，加入40μl預(yù)冷的depc水充分溶解rna，得到最終的rna溶液，取2μl用來測濃度，2μl用來瓊脂糖凝膠電泳檢測rna質(zhì)量。

2.基因的克?。?/p>

pcr反應(yīng)體系(25μl)：buffer2.5μl、上下游引物各1μl、tag酶0.3μl、dntp2μl、模板1μl、ddh2o17.2μl。pcr反應(yīng)的條件：在94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒；迅速冷卻至57℃退火30秒；72℃延伸2分鐘，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃冷卻保存。pcr反應(yīng)結(jié)束后，在1700bp左右處得到目的條帶(圖5)。產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，條件為120v，30min。切下目的條帶，利用eastep^tm凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，具體步驟如下：

(1)切下目的條帶放入滅菌的1.5mlep管中，去皮稱量膠塊重量，按照10mg:10μl的比例加入膜結(jié)合液，在59℃的水浴鍋中孵育10min使膠塊完全溶解；

(2)取出ep管用移液槍輕輕混勻，冷卻至室溫；

(3)在收集管中插入微量純化柱，然后將冷卻至室溫的樣品倒入微量純化柱中，室溫條件下孵育1min；

(4)16000g，室溫條件離心1min，離心結(jié)束后倒掉濾液；

(5)將700μl膜清洗液加入微量純化柱中，16000g，室溫條件離心1min，倒掉濾液；

(6)將500μl膜清洗液加入微量純化柱中，16000g，室溫條件離心1min，倒掉濾液；

(7)16000g，室溫條件離心1min，離心后37℃條件干燥10min；

(8)將微量純化柱插到經(jīng)滅菌處理的1.5mlep管中，加入40μl的無核酸酶水，室溫條件靜置2min，16000g，室溫條件離心1min；

(9)將得到的dna溶液存于-20℃冰箱中備用。

實(shí)施例四：pet28a-ugt366重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白在重組菌中的表達(dá)

利用t4dnaligase將回收的基因ugt366分別與線性化的pet-28a空載相連，16℃過夜，目的基因回收片段6μl，線性化的pet-28a2μl，10×buffer1μl，t4dnaligase1μl。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，對于長出的單克隆進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證，然后送公司測序，對測序結(jié)果正確的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取得到重組質(zhì)粒(圖6)。

分別取2μl重組質(zhì)粒pet28a-ugt366轉(zhuǎn)化到bl21感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布在含有硫酸卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)sds-page檢測表達(dá)結(jié)果，基因ugt366在iptg誘導(dǎo)表達(dá)后，與對照組未加iptg誘導(dǎo)的pet28a-ugt366和加iptg誘導(dǎo)的空載體pet28a相比，在60kda左右處有一條明顯增粗的條帶(圖7)。

(1)在過夜培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基上長出一些單菌落，挑選一個(gè)長勢良好的單菌落，用滅菌處理過的10μl槍頭接種到10ml含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，180r/min條件震蕩培養(yǎng)12h；

(2)將培養(yǎng)好的菌液按照菌種與培養(yǎng)基1:100的比例接到300ml含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，180r/min條件震蕩培養(yǎng)，直到od600＝0.55-0.6；

(3)加入1mol/l的iptg儲(chǔ)存液，使其終濃度為1mmol/l，并設(shè)不加iptg的菌液為對照組；

(4)37℃，180r/min條件震蕩培養(yǎng)4h；

(5)分別取1ml對照組和處理組的菌液，4℃，12000rpm的條件離心5min，倒掉上清液，重復(fù)離心1次。

(6)將沉淀用100μlddh2o溶解，加100μl2×loadingbuffer混勻后，95℃金屬浴10min，離心后取上清進(jìn)行sds-page檢測。

實(shí)施例五：蛋白u(yù)gt366對氣味分子降解能力的測定

利用酶和底物相互作用的關(guān)系進(jìn)行體外糖基化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，檢測表達(dá)的蛋白是否有活性以及能否降解氣味分子，先將緩沖液、蛋白及udp-葡萄糖依次加到ep管中，溫浴后加入底物開始反應(yīng)，反應(yīng)過程中用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測，所用儀器為agilent1290-microtof-qiimassspectrometer(超高效液相色譜/四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀)。

(1)色譜條件：色譜柱：waterssymmetryc18(2.1x100mm，3.5μm)；流動(dòng)相：0.1％甲酸，乙腈；梯度洗脫程序：0-5min，5-15％乙腈；5-25min，15-40％乙腈；25-30min，40-90％乙腈；30-32min，90-95％乙腈；流速：0.3ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μl。

(2)質(zhì)譜條件：ajsesi離子源，正離子檢測模式；干燥氣流速：16l/min；干燥氣溫度：200℃；霧化氣流速：50psi；鞘氣流速：12l/min；鞘氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3.5kv；噴嘴電壓：0.5kv。

在蛋白u(yù)gt366與氣味物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯發(fā)生反應(yīng)后，質(zhì)譜峰上顯示物質(zhì)的分子量為638.4，這說明在蛋白u(yù)gt366的作用下，鄰苯二甲酸二丁酯成功被轉(zhuǎn)移上兩個(gè)葡萄糖基，分子量由279.2變?yōu)?38.4(圖8)，結(jié)果表明蛋白u(yù)gt366具有糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，可以催化氣味物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯與udp-葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng)，對底物有降解作用，據(jù)此推測，注意可能在暗黑鰓金龜觸角中作為氣味降解酶發(fā)揮作用。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

seqidno.1的序列

（i）序列特征：（a）長度：1711bp；（b）類型：核苷酸；（c）鏈性：單鏈；（d）1-57:5’-utr（e）1629-1711：3’-utr。

　　?。╥i）分子類型：核苷酸

　　?。╥ii）序列描述：seqidno.1

1gtactgataagtatccactgatttgatacaaatttgaaaaaaaaaaattaaagcgacatg

61acatcttcaggacatgtcatcatcctggcagttttggccgccttgaacgtatgcaactgc

121gccaacgtcctgatgataacgatgggcggcaccaagtctcataagattcccttttgggaa

181ttggcgaggggactcatccctcgtggacataacataacgttcatcaacgcctttcctcaa

241gattttatcacggacggccttgaagaaatcacgcctgccggcttggtattttacgtcaag

301aactttacgaattgggacctgttgggtgcaaggatgcgtggagaggaacccgtacatcca

361ctagatatgatgaggtacccgtacgaggcatgtgatattctatactcggacggcgaaatg

421aaggacttcctccattctggtcagacttttgacttgatcatcatggatggagcttttcca

481gagtgcgccttaggtctagtctattacttcaagattccatttatgtacattaataccgtg

541ggattctacactggttcgttgtcggtggcgggcaatccgacgccgtattccataacaccg

601ttcctagcgagacccttcacggacaacatgaacttgttggaaagaaccgtgaacagtttc

661tggcacatctgcgctaacttgatgcactccgtcatggtaaaagtgttcttgcacaacgtg

721ctgaagaagcatttcgggaaagacatcccgcactcgtacgagctgtccaaaaatgtcagt

781tttattcttcaaaatggttatacaaccgtgacttatgccagaccatacttacctaatgtt

841gcggaaatagcatgtatacactgcaaggatccaaaacctctgccgccgaatttcgaggaa

901tttatcaggggaagcggcgagaacgggtttatatacttcagcatgggctcgtctgtgaaa

961gctgccaatatgcccgaatatttgcgtcgtatgctgctgtgcgtcttcaaacaattacca

1021caaagggttttgtggaagtgggaagctgatgatatgccagatcttccgccaaatgtcaaa

1081ctcagtcgatggcttccccagcaagatttactaggtcatcctaaaatacgtgccttcgtg

1141acccacggcggtttgctaagcatgttcgaaacagtataccatggagttccaatagtcacc

1201ataccagtcttctgtgaccatgattccaatgctgccaaggcacaattagacggctacgct

1261atccaattagacttggcaacgttaacagctgacagtttgcttcgagccatcagaggcgtt

1321atacacaatccgaaatacaagagcgacgttaaaaggatgcaacgtctgttgaaagatcaa

1381aaagaaactccactagagagggccatttattggaccgaatacgttttaaggcacaaaggt

1441gccgaacatttgctctctccatcgagaaacctcaacgttatagaatactatttaattgat

1501gtgatgtttgtgttcctcattttagcgatagcgttgcaatatattttaagactgttaatc

1561aaaattatatataagtatttgagtagcagtgtaggtttcagcatagtcaggaaaaacatt

1621aaagtggagtagatatctgtacatagtatataaataggtttgttgttgctaatgttaaag

1681tgtgttgtgttttcagattgtttcttttttt

seqidno.2的序列

　　　（i）序列特征：（a）長度：524個(gè)氨基酸；(b)類型：氨基酸；（c）鏈性：單鏈。

　　　（ii）分子類型：多肽

　　?。╥ii）序列描述：seqidno.2

1mtssghviilavlaalnvcncanvlmitmggtkshkipfwelargliprghnitfinafp

61qdfitdgleeitpaglvfyvknftnwdllgarmrgeepvhpldmmrypyeacdilysdge

121mkdflhsgqtfdliimdgafpecalglvyyfkipfmyintvgfytgslsvagnptpysit

181pflarpftdnmnllertvnsfwhicanlmhsvmvkvflhnvlkkhfgkdiphsyelsknv

241sfilqngyttvtyarpylpnvaeiacihckdpkplppnfeefirgsgengfiyfsmgssv

301kaanmpeylrrmllcvfkqlpqrvlwkweaddmpdlppnvklsrwlpqqdllghpkiraf

361vthggllsmfetvyhgvpivtipvfcdhdsnaakaqldgyaiqldlatltadsllrairg

421vihnpkyksdvkrmqrllkdqketpleraiywteyvlrhkgaehllspsrnlnvieyyli

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