本發(fā)明屬于抗菌肽制備與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種基于陽(yáng)離子多肽納米聚集體的制備與抗菌方向的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

青霉素在細(xì)菌感染中的應(yīng)用,使人們擺脫了細(xì)菌感染死亡的威脅。隨后,越來越多的抗生素被人們發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于醫(yī)療中。然而抗生素的快速發(fā)展雖然為人類的健康做出了卓越的貢獻(xiàn),但它卻是一把雙刃劍,如今隨著抗生素的過度使用，細(xì)菌的耐藥性問題也越來越嚴(yán)重。特別是醫(yī)藥領(lǐng)域抗生素的使用，使得抗生素的效果越來越弱，近年來更是因“超級(jí)耐藥菌”的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。由此研究新型抗菌劑取代傳統(tǒng)抗生素，解決耐藥性的問題迫在眉睫。

抗菌肽(antimicrobialpeptides,amps)，其廣泛存在于細(xì)菌、植物、動(dòng)物中,在生物體內(nèi)由特定基因編碼產(chǎn)生的一類兩親性帶正電荷的小分子多肽(氨基酸數(shù)目一般12-50),是天然免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分,被稱為“第二防御體系”。重要的是抗菌肽具有其獨(dú)特的殺菌機(jī)理,多數(shù)抗菌肽在溶液中帶正電，而細(xì)菌細(xì)胞膜帶負(fù)電，抗菌肽通過靜電吸附于細(xì)胞膜，破壞膜結(jié)構(gòu)，這樣使細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性。因而抗菌肽有希望替代傳統(tǒng)抗生素,成為新一類的殺菌藥物。同時(shí)，抗菌肽的應(yīng)用也將為食品，醫(yī)藥，生物等領(lǐng)域帶來一場(chǎng)“綠色革命”。

目前抗菌肽與細(xì)菌的作用機(jī)理主要認(rèn)為與其本身的兩親性結(jié)構(gòu)以及正電性有關(guān)。多肽鏈段的n端一般富含陽(yáng)離子型的氨基酸,且是親水氨基酸,c端一般富含疏水氨基酸,因此抗菌肽通常具有兩親性和正電性。為獲得理想的抗菌肽，在對(duì)其進(jìn)行分子設(shè)計(jì)時(shí)，必須考慮到正電性和兩親性兩個(gè)特點(diǎn)?？咕乃鶐У恼姾膳c微生物細(xì)胞膜的負(fù)電荷相互吸引，最終使抗菌肽接近微生物細(xì)胞膜表面。抗菌肽接近微生物細(xì)胞膜后，其親水端與磷脂分子層(細(xì)胞膜骨架)親水端接觸，進(jìn)而將疏水端插入磷脂分子層的疏水內(nèi)部，干擾細(xì)胞膜的通透性。在這兩種機(jī)制下，抗菌肽最終破壞微生物細(xì)胞膜，使微生物死亡。

傳統(tǒng)的抗菌肽在溶液中通常以單體與細(xì)菌相互作用，而單體在生理環(huán)境下容易被降解喪失一定的抗菌效果，而聚集體結(jié)構(gòu)的抗菌肽在溶液中更穩(wěn)定，相比單體，也不易被降解，因此開發(fā)新型抗菌肽使其自組裝為聚集體結(jié)構(gòu)成為目前研究的熱點(diǎn)。

人類淀粉樣多肽aβ16-22(klvffae)，包含疏水核心lvff，在一定環(huán)境溶液中，能夠在溶液中自組裝為纖維或兩端修飾后能自組裝為納米管。根據(jù)這段序列，將其中的親水性氨基酸-丙氨酸(a)和谷氨酸(e)都替換為賴氨酸(k)，亮氨酸(l)和纈氨酸(v)都替換為苯丙氨酸(f),綜合設(shè)計(jì)了兩親性多肽序列kkkfafafafakkk和kkkfafafafakkk，兩段多肽在溶液中帶正電荷(ph＝1～10，電位圖見圖2)，使其具備抗菌肽特征，又同時(shí)具備自組裝的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

制備陽(yáng)離子多肽納米聚集體，并用于光熱殺菌。該納米聚集體結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不易被降解，與細(xì)菌相互作用強(qiáng)，可在短時(shí)間內(nèi)殺死細(xì)菌。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種陽(yáng)離子多肽納米聚集體的殺菌應(yīng)用，按照下述步驟進(jìn)行：

將50μl細(xì)菌懸浮液(～5×10⁶cfuml^–1)分別加入2ml陽(yáng)離子多肽的納米聚集體溶液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1h，用磷酸鹽緩沖液稀釋10000倍，取100μl稀釋后的懸浮液放到lysogenybroth固體培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)18h，計(jì)算菌落數(shù)。

上述技術(shù)方案中所述的陽(yáng)離子多肽納米聚集體，其制備方法如下：

將濃度為80～480μgml^–1的陽(yáng)離子多肽加入(ph＝6.5～8.5)的溶液中，并置于恒溫振蕩器上孵育30～60min(35～38℃，360rpm)，陽(yáng)離子多肽自組裝后形成納米聚集體。

上述方案中所述細(xì)菌為大腸桿菌(e.coli)、沙門氏菌(salmonella)或枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)中的一種。

上述方案中所述陽(yáng)離子多肽為k3(fa)4k3、k6(fa)4、k2(fa)3k2、k4(fa)3、ac-k3(fa)4k3-nh2、k2(fa)2、k(fa)2k、kfa、ac-k2(fa)3k2-nh2、ac-k2(fa)2-nh2、ac-k(fa)2k-nh2、ac-k2(fa)2-nh2和ac-k6(fa)4-nh2中的一種,優(yōu)選k3(fa)4k3和k6(fa)4中的一種。

上述方案中所述納米聚集體為納米片狀聚集體、納米球形聚集體、納米環(huán)形聚集體、納米棒狀聚集體和納米囊泡聚集體中的一種。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，納米聚集體為納米片狀聚集體或納米球形聚集體。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，片狀聚集體尺寸為10～1000nm。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，納米球形聚集體尺寸10～1000nm。

上述方案中所述懸浮液和溶液為水溶液，優(yōu)選純水、磷酸緩沖液(pb)或磷酸鹽緩沖液(pbs)中的一種。

本發(fā)明所制備的陽(yáng)離子多肽納米聚集體，可通過改變陽(yáng)離子多肽濃度、ph、溫度、時(shí)間，進(jìn)而調(diào)控納米聚集體，與細(xì)菌相互作用，在溶液中快速殺死細(xì)菌。

附圖說明

圖1為陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4在水溶液中不同ph下的電位圖。

圖3為陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4納米聚集體的原子力顯微鏡(afm)圖。

圖4為陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4納米聚集體與細(xì)菌作用后，細(xì)菌存活率隨時(shí)間的變化隨時(shí)間的變化。

圖5為陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的納米聚集體與大腸桿菌作用后，掃描電子顯微鏡(sem)圖。

圖6為改變陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4在不同的濃度、溶液、溶液的ph和孵育的時(shí)間下形成的納米聚集體的afm圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試劑、材料等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的聚集體制備：

將濃度為166μgml^–1的陽(yáng)離子多肽加入37℃(ph＝7.04)的水中，并置于振蕩器上孵育40min(360rpm)，陽(yáng)離子多肽自組裝后形成納米聚集體，所得的形貌圖見圖3。由此可見，經(jīng)過孵育后的多肽k3(fa)4k3自組裝形成了片狀納米聚集體，經(jīng)過孵育后的多肽k6(fa)4自組裝形成了比較均勻的球形納米聚集體。

實(shí)施例2

陽(yáng)離子多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的納米聚集體抗菌應(yīng)用：

將50μl大腸桿菌懸浮液(～5×10⁶cfuml^–1)分別加入2ml陽(yáng)離子多肽自組裝后的納米聚集體溶液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1h，用磷酸鹽緩沖液稀釋10000倍，取100μl稀釋后的懸浮液放到lysogenybroth固體培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)18h，計(jì)算菌落數(shù)。

實(shí)施例3

同實(shí)施例2，僅改變陽(yáng)離子多肽抗菌步驟中細(xì)菌分別為大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌，所得的細(xì)菌存活率隨時(shí)間的變化見圖4。由此可見，在同一條件下，多肽k3(fa)4k3和k6(fa)4的納米聚集體均能殺死細(xì)菌，但多肽k6(fa)4的納米聚集體對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌不具有殺菌作用，可歸因于，不同的細(xì)菌具有不同的生物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

實(shí)施例4

同實(shí)施例1，僅改變陽(yáng)離子多肽濃度分別為200μgml^–1，陽(yáng)離子多肽自組裝后形成納米聚集體，所得的形貌圖見圖6a。由此可見，經(jīng)過孵育后的多肽k3(fa)4k3自組裝形成了納米環(huán)形聚集體和納米球形聚集體，經(jīng)過孵育后的多肽k6(fa)4自組裝形成了的納米球形聚集體。

實(shí)施例5

同實(shí)施例1，改變陽(yáng)離子多肽濃度分別為170μgml^–1、溶液為10mmpbs、ph＝7.4和孵育時(shí)間為60min,陽(yáng)離子多肽自組裝后形成納米聚集體，所得的形貌圖見圖6b。由此可見，經(jīng)過孵育后的多肽k3(fa)4k3自組裝形成了納米環(huán)形聚集體和納米球形聚集體，經(jīng)過孵育后的多肽k6(fa)4自組裝形成了的納米球形聚集體。