本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980128485.x，申請(qǐng)日為2009年6月5日，發(fā)明名稱為“用于高通量試驗(yàn)的三維組織”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2008年6月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)no.61/059,126的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，在此作為參考引用其全部?jī)?nèi)容。

本發(fā)明涉及用于高通量試驗(yàn)的三維組織。還涉及通過(guò)進(jìn)行使用三維生物人工組織的試驗(yàn)檢測(cè)生物人工組織對(duì)試劑的響應(yīng)的方法。

背景技術(shù)：

對(duì)在正常發(fā)育過(guò)程中以及在疾病狀態(tài)下的活細(xì)胞中的各種生物分子的表征的需要促進(jìn)了細(xì)胞基試驗(yàn)的發(fā)展。如今高通量細(xì)胞基試驗(yàn)形成了生物醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)。這些試驗(yàn)不僅用于基礎(chǔ)研究，如細(xì)胞組分和方法的發(fā)現(xiàn)，也用于應(yīng)用研究，如藥物開(kāi)發(fā)。例如，已開(kāi)發(fā)細(xì)胞基試驗(yàn)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞活動(dòng)和功能，如細(xì)胞生存能力、細(xì)胞增殖、基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和細(xì)胞間信號(hào)。這種試驗(yàn)可用于高通量(htp)篩選應(yīng)用。然而，許多細(xì)胞基試驗(yàn)不適于高通量篩選，因?yàn)闄z測(cè)靈敏度或信號(hào)強(qiáng)度過(guò)低。此外，高通量細(xì)胞基試驗(yàn)通常在單層細(xì)胞上進(jìn)行，這些試驗(yàn)不能充分描述組織內(nèi)的細(xì)胞行為。需要增加的靈敏度和增加的信號(hào)強(qiáng)度，使得細(xì)胞基試驗(yàn)可適用于高通量應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供了使用三維組織模型的高通量細(xì)胞試驗(yàn)體系以及進(jìn)行這種試驗(yàn)的方法。所述試驗(yàn)可用于監(jiān)測(cè)組織對(duì)使用各種試劑和應(yīng)激源的處理的響應(yīng)。三維組織在置于多孔板中的一個(gè)孔內(nèi)的支架上形成。組織懸浮于孔底部以上。試驗(yàn)在懸浮的組織上進(jìn)行，試驗(yàn)的輸出(output)在孔中測(cè)量。

在一個(gè)方面，本文提供了檢測(cè)組織對(duì)試劑的響應(yīng)的方法。所述方法包括使生物人工組織與試劑接觸，使用生物人工組織進(jìn)行產(chǎn)生指示劑的試驗(yàn)，以及檢測(cè)孔中的指示劑水平。指示劑水平表示生物人工組織對(duì)試劑的響應(yīng)。在試驗(yàn)中所用的生物人工組織包含細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，并在支架支撐上形成而不使用促進(jìn)組織粘合的持著器(fastener)。所述支架支撐位于孔底部以上。

試驗(yàn)輸出可為比色或熒光產(chǎn)物，產(chǎn)物的積聚可使用板閱讀器測(cè)量?？墒褂帽景l(fā)明的體系進(jìn)行的示例性的試驗(yàn)包括但不限于細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞死亡試驗(yàn)、細(xì)胞凋亡試驗(yàn)、蛋白質(zhì)表達(dá)試驗(yàn)、基因表達(dá)試驗(yàn)、酶試驗(yàn)、信號(hào)試驗(yàn)(如激酶活性試驗(yàn)、ca2+信號(hào)試驗(yàn)和gpcr信號(hào)試驗(yàn))、評(píng)估線粒體活性的試驗(yàn)，以及細(xì)胞外基質(zhì)降解試驗(yàn)。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明可參照結(jié)合附圖的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述而得以更好的理解。

圖1a顯示了一個(gè)高通量體系，其說(shuō)明了圖1b所示的三角形和矩形(可選擇的形狀)支架的使用，所述支架由直徑為約1毫米的不銹鋼絲制成，并提供了形成重組三維組織的支撐。

圖1b顯示了三角形和矩形的支架。

圖2a為支架的俯視圖。

圖2b為支架的側(cè)視圖。

圖2c為為了易于在高通量應(yīng)用中使用將幾個(gè)支架彼此連接的一種方式的側(cè)視圖。

圖3為顯示典型設(shè)計(jì)的三維組織的照片。

圖4a和4b為表示三維組織與細(xì)胞單層之間的區(qū)別的圖示。該圖演示了可通過(guò)使用三維組織(圖4a)代替細(xì)胞單層(圖4b)而實(shí)現(xiàn)的增加的細(xì)胞基試驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度。

圖5a為thepalpator^tm的照片。該體系包括等長(zhǎng)力(isometricforce)傳感器(a)、探針浴(b)和在溫度調(diào)節(jié)器板(d)上的水凝膠組織構(gòu)建物(htc)臺(tái)(c)。

圖5b為顯示將帶有連接的探針的力傳感器置于htc上并降低探針至用于力測(cè)量的組織之上的x-y-z移動(dòng)機(jī)械臂的照片。

圖5c為帶有連接的力傳感器和探針的機(jī)械臂的示意圖。

圖5d為置于hct的中平面以上1毫米處的探針(a)，然后降低直至該探針首先接觸(b)，然后拉伸(c)組織的照片。

圖5e為顯示在htc壓入過(guò)程中記錄的代表性力的圖。箭頭a、b和c顯示與在圖5d中所示的探針位置相關(guān)的力測(cè)量。

圖5f和5g為顯示依賴于rho激酶抑制劑1(rki1)、細(xì)胞松弛素d(cd)、魚藤酮(rot)和2,4-二硝基苯酚(dnp)的劑量而減小的htc收縮力的圖。將htcs預(yù)處理，然后用所示四種藥物的不同濃度進(jìn)行處理。在3小時(shí)(圖5f)和24小時(shí)(圖5g)時(shí)測(cè)量力。力測(cè)量相對(duì)于對(duì)照介質(zhì)處理的htcs(fc)進(jìn)行表示。數(shù)據(jù)顯示主要是4次重復(fù)，幾個(gè)2和3次重復(fù)的平均值和sem；z-因子>0.44(^#)和0.59(*)。

圖5h為顯示細(xì)胞松弛素d處理減少的細(xì)胞f肌動(dòng)蛋白的圖。將用藥物處理24小時(shí)的htcs固定并用alexa568共軛毒傘素標(biāo)記。熒光強(qiáng)度在板閱讀器上讀取并相對(duì)于對(duì)照介質(zhì)處理的htcs(ic)作圖。數(shù)據(jù)顯示3次重復(fù)的平均值和sem；通過(guò)student的t-測(cè)試相比對(duì)照物(ctrl)，^@p<0.02。

圖5i顯示分別用介質(zhì)(i，n，s)、cd(j，o，t)、rki1(k，p，u)、dnp(l，q，v)和rot(m，r，w)處理的ref單層的顯微圖片。在3小時(shí)(i-m)和24小時(shí)(n-r，s-w)后處理時(shí)，將代表性的單層固定，并用alexa568共軛毒傘素和dapi染色。在3小時(shí)之時(shí)(j)，cd引起大量肌動(dòng)蛋白解聚。rki1、dnp和rot限于無(wú)影響。cd和rot引發(fā)的細(xì)胞毒性由細(xì)胞收縮(g，i和j)、雙核形成(l)和核分裂(o)而得以證實(shí)。請(qǐng)注意在(g)和(l)中的更大的比例。圖像在leicasp5共焦顯微鏡上使用浸水63x物鏡，比例尺＝50微米截取。

圖6a為顯示dnp的解偶聯(lián)效應(yīng)使用板閱讀器在細(xì)胞單層中不可計(jì)量的圖。平均值和sem顯示，n＝11。

圖6b為顯示相同的效應(yīng)在htcs中可計(jì)量的圖。平均值和sem顯示，n＝4。

圖6c為顯示在用dnp處理的ref單層中的顯微鏡定量的tmre信號(hào)的代表性圖線的圖。

圖6d為顯示在用dnp處理的htc底細(xì)胞層中的顯微鏡定量的tmre信號(hào)的代表性圖線的圖。相比于來(lái)自htcs的細(xì)胞層的結(jié)果(c)，tmre信號(hào)的降低量級(jí)更高。

圖6e和6f為顯示dnp劑量依賴的解偶聯(lián)htc線粒體電位的圖。預(yù)載tmre(100nm，30分鐘)的htcs用不同濃度的cd、rki1、dnp和rot進(jìn)行處理。在3(圖6e)和24(圖6f)小時(shí)后處理時(shí)使用板閱讀器測(cè)量tmre熒光信號(hào)。信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照的介質(zhì)處理的htcs(ic)表示。顯示了4次(幾種為2或3次)重復(fù)的平均值和sem；z-因子>0.64(^#)和0.46(*)。

圖7a為顯示cd和rot表現(xiàn)出劑量依賴的細(xì)胞毒性的圖。藥物處理的htcs的生存能力在24小時(shí)時(shí)通過(guò)mtt試驗(yàn)測(cè)定。甲臜(formazan)(由活細(xì)胞中的mtt轉(zhuǎn)化)的吸光度在板閱讀器上讀取，并相對(duì)于對(duì)照的介質(zhì)處理的htcs(ac)表示。10％dmso處理用作該試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照(positivecontrol)，其得到0.11±9×10^-3的a/ac(在圖中未顯示)；對(duì)于對(duì)照相比10％dmso分析，z-因子>0.85。數(shù)據(jù)顯示主要4次(幾種為2和3次)重復(fù)的平均值和sem。

圖7b為htc篩選的工作流程圖。持續(xù)時(shí)間表示加工每一板(plate)htcs所需的時(shí)間量。合成htcs，并在使用之前使其收縮48小時(shí)。修色的(shaded)平形四邊形指示數(shù)據(jù)點(diǎn)獲取。對(duì)于原位指示器，例如tmre而言，重復(fù)測(cè)量是可能的。終點(diǎn)試驗(yàn)法，例如mtt，需要犧牲htcs，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行。

圖7c至7f為顯示用于篩選化合物的表型圖線(profiles)的圖。每個(gè)化合物在24小時(shí)時(shí)的生理學(xué)數(shù)據(jù)，即組織力(tissueforce)(force)、線粒體電位(mit.pot.)和mtt轉(zhuǎn)化率(mttconv.)歸一化至最大效應(yīng)(通過(guò)四個(gè)化合物之一)，然后用線性或四參數(shù)邏輯函數(shù)(直線)進(jìn)行擬合。由1減少至0的圖線表示化合物對(duì)特定的生理學(xué)具有最大負(fù)效應(yīng)。表型圖線通過(guò)證實(shí)rki1為最佳候選化合物(因?yàn)閞ki1有效降低了組織力(由1至0)，并同時(shí)表現(xiàn)出最小解偶聯(lián)活性(線粒體毒性)和mtt轉(zhuǎn)化率(細(xì)胞毒性)的降低)而簡(jiǎn)化了化合物選擇過(guò)程。

圖7g顯示用于篩選化合物的流程圖。

具體實(shí)施方式

由于由比色指示劑或熒光指示劑產(chǎn)生的低信號(hào)強(qiáng)度，許多可得的細(xì)胞基高通量篩選試驗(yàn)的有用性是有限的。這種試驗(yàn)通常使用在單層或懸浮體培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而不是存在于組織中的細(xì)胞。此外，單層和懸浮細(xì)胞不必然與組織的三維環(huán)境中的體內(nèi)細(xì)胞表現(xiàn)類似。本文呈現(xiàn)的試驗(yàn)和組織使得這些高通量試驗(yàn)?zāi)軌蛟诟咏愃朴隗w內(nèi)環(huán)境(setting)的組織基體系中進(jìn)行。此外，由于相比于在相同區(qū)域中的細(xì)胞單層，更多數(shù)目的細(xì)胞存在于三維組織中，在三維組織上進(jìn)行的試驗(yàn)的輸出所產(chǎn)生的信號(hào)得以放大。

本發(fā)明改進(jìn)了使用光檢測(cè)系統(tǒng)(如分光光度測(cè)量和熒光板閱讀器)的試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞生理學(xué)的效率。這是使用組織(如工程化或生物人工組織)的生理曲線體系的另一特征。如美國(guó)專利no.7,449,306中所在先描述，工程化組織(生物人工組織)可以小型形式，包括96孔板形式得以構(gòu)造。例如，在工程化組織(3d組織類器官)中的細(xì)胞生長(zhǎng)可加載熒光探針，該熒光探針用于報(bào)告細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外活性的生理學(xué)。熒光探針通過(guò)改變其強(qiáng)度或移動(dòng)其發(fā)射光譜而報(bào)告生理狀態(tài)。

本文提供了檢測(cè)組織對(duì)試劑的響應(yīng)的方法。所述方法包括使生物人工組織與試劑接觸，在生物人工組織上進(jìn)行產(chǎn)生指示劑的試驗(yàn)，以及檢測(cè)孔中的指示劑水平。指示劑水平表示生物人工組織對(duì)試劑的響應(yīng)。在試驗(yàn)中所用的生物人工組織包含細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，并在支架支撐上形成而不使用促進(jìn)組織粘合的持著器。試驗(yàn)可適用于高通量篩選方法。

可經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的任何方式使生物人工組織與試劑接觸。例如，可將試劑加入含有生物人工組織的孔中，或者可在形成生物人工組織之前將試劑提供至細(xì)胞?？蛇x擇地，可利用載體(如病毒載體或脂質(zhì)體)，或經(jīng)由受體介導(dǎo)靶向而使試劑與細(xì)胞接觸。

生物人工組織模型可用于定量和快速地評(píng)估許多不同類的試劑的效應(yīng)，所述試劑包括但不限于藥物或潛在的藥物、毒素、化學(xué)物質(zhì)、核酸、肽、多肽和包括病原體或載體的微生物。例如，可用作活化劑的試劑包括但不限于胎牛血清(fbs)、溶血磷脂酸(lpa)；凝血酶、包括表皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)的生長(zhǎng)因子，血管緊張素-ii，內(nèi)皮素-1，加壓素及其組合。抑制劑包括但不限于結(jié)合細(xì)胞表面受體的抑制劑(包括血管緊張素ii受體的受體拮抗劑)以及在細(xì)胞內(nèi)作用的抑制劑。本文可用的抑制劑包括但不限于抑制信號(hào)傳導(dǎo)通道的那些，包括染料木素、除莠霉素和在細(xì)胞骨架上作用的試劑。抑制劑也包括但不限于細(xì)胞松弛素d、拉春庫(kù)林b、帕克利托科(paclitoxol)、諾考達(dá)唑、花萼海綿誘癌素a、丁烷二酮一肟(bdm)及其組合。

提供至生物人工組織的試劑的含量為有效引起來(lái)自組織模型或經(jīng)由組織模型的響應(yīng)的含量。有效含量通常在約1nm至100mm，合適地100nm至1mm，更合適的500nm至500μm之間。

在用試劑處理之后，可在生物人工組織上進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)計(jì)用以產(chǎn)生如比色指示劑、熒光指示劑或放射性指示劑的指示劑的任何試驗(yàn)可適用于本發(fā)明的3d生物人工組織。包括但不限于細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞死亡試驗(yàn)、凋亡試驗(yàn)、蛋白質(zhì)表達(dá)試驗(yàn)、基因表達(dá)試驗(yàn)、酶試驗(yàn)、信號(hào)試驗(yàn)(如激酶活性試驗(yàn)、ca2+信號(hào)試驗(yàn)和gpcr信號(hào)試驗(yàn))、評(píng)估線粒體活性的試驗(yàn)和細(xì)胞外基質(zhì)降解試驗(yàn)的試驗(yàn)可用于本文所述的方法中。開(kāi)發(fā)用于細(xì)胞單層，特別是依賴于細(xì)胞攝取的試劑或試驗(yàn)試劑的那些的試驗(yàn)需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間以使得試劑和試驗(yàn)試劑由生物人工組織內(nèi)的細(xì)胞吸收。試驗(yàn)試劑濃度也需要調(diào)節(jié)。

最后，檢測(cè)由試驗(yàn)產(chǎn)生的指示劑水平。產(chǎn)生的指示劑水平是指由試驗(yàn)進(jìn)行所產(chǎn)生的試驗(yàn)輸出或信號(hào)。所述水平可與產(chǎn)生的指示劑含量或指示劑本身的變化(例如發(fā)射光譜的改變，或由細(xì)胞攝取的標(biāo)記指示劑的改變)相關(guān)。指示劑水平表示生物人工組織對(duì)試劑的響應(yīng)。指示劑水平的檢測(cè)可利用顯微鏡、光學(xué)或熒光板閱讀器或閃爍器，這取決于所選的指示劑和試驗(yàn)。由顯微鏡檢測(cè)的信號(hào)靈敏度高于板閱讀器檢測(cè)的信號(hào)靈敏度。顯微鏡聚焦于細(xì)胞層以極有效地收集光信號(hào)(檢測(cè)體積集中且小)。板閱讀器使用散射(未聚焦)光束(例如未聚焦激光)以檢測(cè)在由光束照明的大體積中的分子。在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，板閱讀器測(cè)量來(lái)自單個(gè)細(xì)胞層的光信號(hào)。然而，在工程化組織中的細(xì)胞形成至少5-10層，因此板閱讀器可立刻測(cè)量大量細(xì)胞，從而得到被放大至少5-10倍的由板閱讀器檢測(cè)的光信號(hào)。參見(jiàn)圖4a和4b。板閱讀器可快得多地讀取信號(hào)，因?yàn)樗鼈儾恍枰劢褂趩蝹€(gè)細(xì)胞，因此板閱讀器的使用適于高通量應(yīng)用。由顯微鏡拍攝的圖像的分析也比使用板閱讀器拍攝的那些更耗時(shí)。

用于測(cè)量細(xì)胞生理學(xué)的常規(guī)細(xì)胞基試驗(yàn)常常使用圖像分析。圖像通常由自動(dòng)化顯微鏡捕獲并由圖像分析軟件進(jìn)行分析。治療和測(cè)量治療效果的試驗(yàn)必須通過(guò)收集來(lái)自數(shù)百個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)而進(jìn)行評(píng)估。自單個(gè)細(xì)胞獲得的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方差過(guò)高而不能預(yù)測(cè)任何治療的平均效果。為了獲得統(tǒng)計(jì)上顯著的數(shù)據(jù)，必須收集來(lái)自至少數(shù)百個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。

板閱讀器可用于獲得相同的信息(例如ca濃度)，但信號(hào)比由自動(dòng)化顯微鏡獲得的信號(hào)弱得多。該問(wèn)題的一個(gè)解決辦法是增加由板閱讀器測(cè)量的細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞形成工程化3d組織中的多層，因此板閱讀器可測(cè)量在相同區(qū)域中更多的細(xì)胞。

對(duì)于分析活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，板閱讀器優(yōu)于顯微鏡。使用本文所公開(kāi)的組織構(gòu)建物的測(cè)量的改進(jìn)信號(hào)和高統(tǒng)計(jì)上的顯著性將使得許多小規(guī)模試驗(yàn)可應(yīng)用于細(xì)胞基高含量分析。由于增大的靈敏度，目前通常使用顯微鏡，但本文所述的方法使得板閱讀器可用于細(xì)胞基高含量分析。

現(xiàn)在參照?qǐng)D1a和1b，其中顯示了支架20，該支架合適地包括框架22，例如三角形框架。重組組織26在支架20上形成。在此說(shuō)明性的具體實(shí)施方案中，孔42向底部略微逐漸變細(xì)，并且是96孔板40的孔。支架20牢固地位于每個(gè)孔42的底部以上，合適地為約1毫米以上。將含有所述的細(xì)胞和適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的膠原的非聚合溶液傾入孔中，將孔填充至孔底部以上3毫米的水平(圖1a)。96孔板40可在37℃下用5％co2培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞自組裝為生物人工組織26，并通過(guò)擠出液體而壓縮膠原基體，由此總體積減少了約10倍。無(wú)支架20時(shí)，重組或生物人工組織收縮為漂浮于組織培養(yǎng)介質(zhì)中的小球。

支架20合適地由任何無(wú)孔生物可相容的材料，如金屬、非金屬或塑料制成。在實(shí)施例中，支架由不銹鋼制成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解包括但不限于玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯的其他材料也可合適地用于制備支架。

框架22合適地支撐于孔42的底部43以上?？赏ㄟ^(guò)使用具有錐形孔的組織培養(yǎng)板40由孔側(cè)支撐框架22?？蛇x擇地，可通過(guò)使用具有連接至孔側(cè)的內(nèi)置支架或具有帶壁架(框架22擱在該壁架上)的孔的特別設(shè)計(jì)的板40而將框架22支撐于孔42的底部以上。在另一可選擇的具體實(shí)施方案中，支架20可包括至少一個(gè)連接至框架22的支柱24以將框架支撐于孔底部以上。支撐框架所需的支柱24的數(shù)目取決于框架的形狀而變化。圖1b顯示了具有4個(gè)支柱的支架20，但可如圖2a至2c所示將支架設(shè)計(jì)為具有更少或更多個(gè)支柱。支柱24可通過(guò)從框架向下伸出并接觸孔42的底部而用于支撐框架22，或者支柱24可從框架22向上伸出并通過(guò)將支架固定至孔42的頂部45而支撐支架20的框架。例如，支柱24可在末端具有小鉤結(jié)構(gòu)，其使得支架20能夠懸掛于孔的頂部(圖2b)。盡管支架20的框架22合適地支撐于孔42的底部以上，只要組織可浸入介質(zhì)中，則精確的距離并不關(guān)鍵。合適地，框架22在孔底部以上至少約0.25毫米，更合適地，框架在孔底部以上至少約0.5或1.0毫米。

支架20可采用多種形狀。使用不同的支架形狀，如環(huán)狀或矩形(如圖2a至2c所示)可將含膠原基體壓縮至不同的形狀。其他支架形狀，如圖1b和圖2a至2c中所示的那些，產(chǎn)生具有不同寬度和形狀的組織條?？墒褂萌魏涡螤畹闹Ъ?0，包括但不限于環(huán)狀、矩形、三角形、五邊形、六邊形或其他更高階多邊形。支架也可由超過(guò)一個(gè)元件形成。例如，支架22可由兩個(gè)分隔的平行元件形成，其具有或不具有一個(gè)或多個(gè)連接所述平行元件的垂直元件(圖1b和圖2a至2c)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，細(xì)胞自組裝形成與支架，即支撐(例如線框)的形狀相符合的組織模型。在形成中，組織覆蓋支架的元件并跨越元件之間的間距。例如，在三角形支架上，細(xì)胞形成跨越在三個(gè)邊之間的膜，如圖1a所示。在實(shí)施例中的支架由截面直徑為約1毫米的元件制成，但支架可適當(dāng)?shù)鼐哂懈』蚋蟮慕孛嬷睆?。合適地，支架由一個(gè)或多個(gè)截面直徑在約100微米至約2毫米之間的元件制成。支架通常由圓柱狀或管狀元件組成，其使得組織圍繞元件形成，從而使得組織覆蓋元件。組成支架的元件合適地為稍微圓形以將施用力時(shí)組織的撕裂最小化。例如，若邊為圓形的，可使用具有矩形截面的元件使得在施用力時(shí)組織不會(huì)被撕裂。所述元件合適地由無(wú)孔材料制成，并具有約2毫米以下，合適地約1毫米以下的截面直徑。

生物人工組織形成跨越組成支架的元件之間或橫過(guò)元件的水平截面空間的膜結(jié)構(gòu)。生物人工組織跨越的水平截面空間合適地大于10微米，但也可為孔42所允許的那樣大，合適地，組織跨越約100微米至約5毫米之間，更合適地1毫米至4毫米之間的空間。如圖3所示的典型的生物人工組織為大約4x4x0.8毫米，并在8毫米x8毫米方形盒(chamber)中形成。(調(diào)節(jié)盒的形狀以觀察樣品。組織用甲醛(10％)固定并用橙色染料染色以清楚觀察)。

圖3顯示包括支架20的原型多孔板40。在所示具體實(shí)施方案中，使用桌面cnc碾磨機(jī)(sherlineproductsinc.,vista,ca)自聚碳酸酯棒(25x60x10毫米)機(jī)器加工8孔板。8x8毫米的8個(gè)方形孔42含有制造框架22(1毫米直徑)的2個(gè)不銹鋼棒。不銹鋼棒的中心位于孔底部以上2毫米，并距孔側(cè)2毫米，使得2個(gè)棒分隔4毫米。使用硅膠(dowchemicalco.,midland,mi)，使用顯微鏡蓋玻片(1號(hào)厚度，fisherbrand)密封每個(gè)孔底部以促進(jìn)顯微鏡成像。

為了便于在高通量體系中使用多孔板形式，可將支架20通過(guò)連接體28一起連接成組，且包括但不限于如圖2c所示的2、4、8、12或96個(gè)支架。通過(guò)將支架20一起連接成組，支架可易于定位于多孔板40中?？蓪⑦B接體28制備為易于分離，例如，使得快速牽引動(dòng)作將打破連接并允許使用者自定義所用的支架數(shù)目。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可使本文所述的支架和生物人工組織體系適用于任何多孔板，包括但不限于6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、192孔或384孔板。

由如下實(shí)施例可以看出，不需要多孔支撐材料或如velcro持著器的其他持著器以促進(jìn)組織甚至粘附至所用線框的無(wú)孔不銹鋼表面。膠原在膜的外部或組織條上被較大程度地壓縮，并使得組織懸浮于支架上而無(wú)需持著器。因此，該膜的外部可承受由細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)力，并防止生物人工組織從線框上撕裂。

如圖4a和4b所示，根據(jù)本發(fā)明的數(shù)個(gè)具體實(shí)施方案的生物人工組織提供了比現(xiàn)有細(xì)胞基試驗(yàn)的細(xì)胞單層更類似于體內(nèi)環(huán)境的三維組織。增加的細(xì)胞數(shù)目導(dǎo)致特定測(cè)試試驗(yàn)的增加的信號(hào)輸出。因此本發(fā)明提供了一種機(jī)理，通過(guò)該機(jī)理，所有方式的細(xì)胞基試驗(yàn)可在高通量體系中成功產(chǎn)生。此外，不同于其他三維組織，本文的組織并非在篩網(wǎng)或框架(其隨后會(huì)干擾光學(xué)測(cè)量)上生長(zhǎng)。相反，組織跨越框架，有可能進(jìn)行光學(xué)測(cè)量。

本發(fā)明的體系不僅使用更少量的試劑(由于用于測(cè)試所需組織的小尺寸)，而且使得組織分析能夠保持在組織培養(yǎng)條件中，包括在整個(gè)試驗(yàn)程序中保持恒定的溫度和無(wú)菌條件。例如，試驗(yàn)可在層流通風(fēng)櫥中進(jìn)行以避免生物人工組織的污染。此外，組織內(nèi)的細(xì)胞是穩(wěn)定的，使得試驗(yàn)可在數(shù)小時(shí)、數(shù)天或甚至數(shù)周過(guò)程中在同一組生物人工組織上重復(fù)數(shù)次。

多孔板40可為包括用于保持生物人工組織的支架20的特定設(shè)計(jì)的板，或者合適地為可加入支架的通常市售的組織培養(yǎng)多孔板。每個(gè)板的孔數(shù)目可變化。通常使用具有2至1000個(gè)孔的板，合適地使用具有50至500個(gè)孔的板。

用于形成生物人工組織的細(xì)胞可包括但不限于肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和心臟細(xì)胞。生物人工組織可包含細(xì)胞和膠原或者細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)?？捎糜谛纬缮锶斯そM織的膠原包括膠原1-4類，其包括所有的i-xiii型及其組合。各種類型的細(xì)胞外基質(zhì)也可用于形成生物人工組織，如水凝膠或

在根據(jù)本發(fā)明的數(shù)個(gè)具體實(shí)施方案的重組組織模型中的細(xì)胞在類似于它們?cè)谔烊唤M織和器官中的條件的環(huán)境中。因此，使用該方法的試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生類似于使用動(dòng)物模型獲得的那些結(jié)果的結(jié)果。預(yù)期一些動(dòng)物測(cè)試可由本發(fā)明的組織模型代替。例如，作用于皮膚的試劑的一些測(cè)試可使用人工活組織進(jìn)行。

實(shí)施例

方法

由直徑為1毫米的不銹鋼線制成的三角形框架用作支架，重組組織在其上形成?？紫虻撞柯晕⒅饾u變細(xì)，框架牢固地定位于孔底部以上1毫米處(圖1a)。將含有細(xì)胞和適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的膠原的非聚合溶液傾入孔中，將孔填充至底部以上3毫米的水平(圖1b和圖3)。圖3中的8孔板可在37℃下用5％co2培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)從多孔膠原基體擠出液體而壓縮膠原基體。在無(wú)線框下，重組組織收縮為漂浮于組織培養(yǎng)介質(zhì)中的小球。發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用不同形狀的線框，膠原基體被壓縮為對(duì)應(yīng)于框架形狀的形狀。說(shuō)明性地，三角形線框制得跨越在三條邊之間的膜，如圖1a所示。其他線框形狀，如圖1b所示的一種，生成具有不同寬度的組織條。無(wú)需如velcro持著器的多孔支撐材料以促進(jìn)組織甚至粘合至線的無(wú)孔不銹鋼表面。膠原在膜或條的外部更大程度地被壓縮。因此，該膜的外部可承受由細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)力，并防止其從線框上撕裂膜。

細(xì)胞培養(yǎng)和htc形成

在補(bǔ)加有10％胎牛血清(fbs,s11050,atlantabiologicals,lawrenceville,ga)的dulbecco'smodifiedeagle'smedium(dmem,mt10013cm,fisherscientific,pittsburgh,pa)中培養(yǎng)大鼠胚胎纖維母細(xì)胞(ref-52)。每2至3天將細(xì)胞進(jìn)行再次培養(yǎng)(subcultured)。為了制備水凝膠組織構(gòu)建物(htcs)，通過(guò)用0.05％胰蛋白酶(mt-25-025-cl,fisherscientific)處理10至15分鐘而將ref-52細(xì)胞(40至70傳代(passages))自培養(yǎng)板解離。然后在1000g下離心細(xì)胞10分鐘。倒出胰蛋白酶溶液，將細(xì)胞小球再懸浮于10％fbsdmem介質(zhì)中。將該細(xì)胞懸浮體稀釋至htc組織溶液中以獲得8×10⁵細(xì)胞/毫升的最終濃度。所述htc組織溶液由10％fbsdmem、1毫克/毫升的在0.02n乙酸中的類型1膠原(354249,bdbiosciences,sanjose,ca)、充足的用以中和膠原中的酸的氫氧化鈉，和充足的用以補(bǔ)償膠原和naoh的體積的5×dmem組成。為了防止過(guò)早的膠原聚合，將htc組織溶液保持于冰上直至其分布至發(fā)明人的定制組織模具中(圖3)。每個(gè)模具含有8個(gè)分開(kāi)的具有兩個(gè)內(nèi)置水平支撐棒的htc-形成孔。將300毫升的htc組織溶液等分至在這些模具中的每個(gè)孔中，然后在37℃和5％co2下培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)階段之后，將350毫升10％fbsdmem介質(zhì)加入每個(gè)孔中，模具進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)。在此時(shí)間中，溶液收縮，從而形成跨越孔中的支撐棒的htcs。

htc力測(cè)量

使用palpator^tm(如美國(guó)專利no.7,449,306中所述，其以全文引用方式并入本文)定量htcs的收縮性。將模具置于palpator^tm的臺(tái)上，其將探針自動(dòng)插入每個(gè)孔中，并拉伸單獨(dú)的htc。將探針連接至力傳感器，該力傳感器測(cè)量在htc中引起的對(duì)拉伸響應(yīng)的阻力，并將數(shù)值輸出至計(jì)算機(jī)以記錄。使用常規(guī)matlab算法處理并分析力數(shù)據(jù)以報(bào)導(dǎo)數(shù)值參數(shù)，該數(shù)值參數(shù)指示在htc中的活細(xì)胞力。為了獲得htc收縮力的穩(wěn)定測(cè)量，必要的是通過(guò)在實(shí)際力測(cè)量之前通過(guò)拉伸三次以預(yù)處理htcs。若隨后的力測(cè)量在先前拉伸的30分鐘之內(nèi)，則無(wú)需預(yù)處理。在24小時(shí)后處理之時(shí)的htcs總是在力測(cè)量之前進(jìn)行預(yù)處理。

htctmre標(biāo)記和mtt試驗(yàn)

使用四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)的乙酯(tmre,t-669,invitrogen,carlsbad,ca)定量htcs的線粒體電位。htcs在100nmtmre中培養(yǎng)30分鐘，然后在不含酚紅的10％fbsdmem中培養(yǎng)60分鐘。使用不含酚紅的介質(zhì)以避免干擾tmre熒光讀取。在標(biāo)記之后，在背景力測(cè)量之前以三次拉伸預(yù)處理htcs。然后在synergyht板閱讀器(biotekinstruments,winooski,vt)上讀取htctmre信號(hào)。使用定制固定板(adapterplate)將組織模具定位于板閱讀器的板固定架上。使用543/590激發(fā)/發(fā)射過(guò)濾設(shè)定和50的增益設(shè)定從底部讀取熒光信號(hào)。在藥物處理之后在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)在每次力測(cè)量之后也讀取tmre熒光強(qiáng)度。

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(mtt,m-6494,invitrogen)定量htcs中的細(xì)胞活力。在藥物暴露之后，在預(yù)定時(shí)間將mtt加入每個(gè)孔中以獲得0.5毫克/毫升。將mtt留在孔中2小時(shí)，然后去除。然后將在細(xì)胞內(nèi)形成的甲臜染料懸浮于含有0.1n鹽酸的500微升異丙醇(s77795,fisherscientific)中。然后將200毫升甲臜溶液置入96孔板孔中，并在synergyht板閱讀器上讀取。記錄在570和650納米處的吸光度，差異(a570-a650)用作甲臜的吸光度強(qiáng)度。

htc藥物處理

除非另外指出，所有的化學(xué)品均來(lái)自sigma(sigma-alrich,st.louis,mo)。將細(xì)胞松弛素d(cd,c8273)、魚藤酮(rot,r8875)、2,4-二硝基苯酚(dnp,d198501)，和rho激酶抑制劑1(rki1,555550,calbiochem,gibbstown,nj)懸浮于二甲亞砜(dmso,d4540)中以進(jìn)行儲(chǔ)存。cd、rot和rki1的儲(chǔ)液為1mm，將其連續(xù)稀釋至在不含酚紅、fbs、葡萄糖或丙酮酸鹽(-f/p/g)的dmem中100、10和1μm。將dnp稀釋至在dmso中1m，然后稀釋至在-f/g/pdmem中100、10和1mm。在htc預(yù)處理和背景力(即前藥)測(cè)量之后，將50微升適當(dāng)?shù)乃幬锵♂屢杭尤朊總€(gè)孔中以獲得所需的處理濃度。將50微升-f/g/pdmem加入對(duì)照孔中。當(dāng)加入藥物時(shí)，通過(guò)移液四次混合孔中的介質(zhì)。

ref-52細(xì)胞處理和固定

將ref-52細(xì)胞置于35毫米培養(yǎng)皿(50,000個(gè)細(xì)胞)的10％fbs介質(zhì)(2毫升)中。將細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，然后用化合物進(jìn)行處理。將濃縮cd、rki1、dnp和rot溶解于-f/g/p介質(zhì)中，然后在每個(gè)細(xì)胞板(每2毫升介質(zhì)220微升)中稀釋10×。在固定之前，細(xì)胞用藥物培養(yǎng)24小時(shí)。為了固定，經(jīng)處理的細(xì)胞用2毫升磷酸鹽緩沖鹽水(pbs,d5652)潤(rùn)洗一次，然后在1毫升4％的多聚甲醛(sigma)溶液(在pbs中)培養(yǎng)30分鐘。經(jīng)固定的細(xì)胞潤(rùn)洗兩次，然后在2毫升pbs中儲(chǔ)存。

ref-52標(biāo)記和成像

通過(guò)在1毫升0.1％triton(bp151,fisherscientific)溶液(在pbs中)中培養(yǎng)15分鐘滲透經(jīng)固定的ref-52細(xì)胞。經(jīng)滲透的細(xì)胞用1毫升tbst緩沖液潤(rùn)洗兩次，然后用在tbst中的1毫升5％山羊血清封閉1小時(shí)。然后將在具有2％山羊血清的tbst中的1毫升1:200稀釋的alexa568共軛毒傘素(a12380,invitrogen)加入細(xì)胞。該染色溶液也含有400nm的dapi(d9564)。將細(xì)胞染色30分鐘，然后用tbst潤(rùn)洗兩次。將標(biāo)記的細(xì)胞安裝在vectashield(vectorlaboratories,burlingame,ca)上，用蓋玻片覆蓋然后用指甲油密封。然后將板倒扣在leicasp5共焦顯微鏡(leicamicrosystems,bannockburn,il)上，并用63×水浸泡物鏡成像。使用543激光線激發(fā)alexa568，并使用maitai多光子激光激發(fā)dapi。

統(tǒng)計(jì)分析

使用student的t測(cè)試對(duì)cd處理的htcs和對(duì)照htcs中的熒光信號(hào)的降低進(jìn)行測(cè)試(圖5h)。使用z因子評(píng)估tmre(圖6e和6f)和mtt(圖7a、7c、7e和7f)試驗(yàn)的信噪比。在mtt試驗(yàn)中，使用10％dmso作為陽(yáng)性對(duì)照。

結(jié)果

為了測(cè)量細(xì)胞力學(xué)以進(jìn)行化合物篩選，發(fā)明人開(kāi)發(fā)了制造小型化的水凝膠組織構(gòu)建物(htcs)和高通量篩選體系palpator^tm(圖5a、5b、5c)的技術(shù)以定量組織的力學(xué)性質(zhì)。3dhtcs提供了更天然的微環(huán)境，且細(xì)胞可更好地模擬體內(nèi)形態(tài)和生理學(xué)。此外，可使用力探針拉伸自支撐htcs以測(cè)量細(xì)胞力學(xué)(圖5d)。使用該體系，htcs的力學(xué)性質(zhì)可定量測(cè)得(圖5e)而無(wú)需細(xì)胞標(biāo)記、復(fù)雜的顯微鏡學(xué)或圖像分析。

在該研究中，將具有已知靶向和生物效應(yīng)的四種不同類型的化合物加入htcs并測(cè)定它們對(duì)htc力學(xué)的劑量依賴效應(yīng)。用ρ激酶抑制劑(rki)、h-1152和細(xì)胞松弛素d(cd)處理htc3和24小時(shí)，其干擾肌動(dòng)蛋白聚合，劑量依賴地降低組織力(兩者ec50≈0.1μm，圖5f，3小時(shí))。二硝基苯酚(dnp)、線粒體膜電位(mmp)的解偶聯(lián)也降低組織力，但在比h-1152或cd～10,000倍更高的濃度下。廣泛使用的對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有公知毒性效應(yīng)的殺蟲劑魚藤酮(rot)也降低組織力。由于其在水性介質(zhì)中的低溶解度(～100μm)，發(fā)明人不能進(jìn)一步增加rot濃度。通常所有化合物的24小時(shí)培養(yǎng)會(huì)增加它們對(duì)力降低的效應(yīng)(圖5g)。特別地，通過(guò)另外～20小時(shí)的培養(yǎng)，dnp的ec50由1.3mm下降至20μm。然而，最高濃度的dnp、cd和h-1152在24小時(shí)時(shí)不會(huì)進(jìn)一步降低組織力，這表明這些劑量在3小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大效應(yīng)。這些結(jié)果說(shuō)明每個(gè)化合物對(duì)于降低組織力是有效的。

組織力在整個(gè)細(xì)胞骨架(特別是肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白)的整體得以保持。為了定量在用所述化合物處理的htcs中的f(細(xì)絲狀)-肌動(dòng)蛋白的含量，用alexa546共軛毒傘素染色htcs。alexa-毒傘素的強(qiáng)度通過(guò)板閱讀器測(cè)量，在用cd(2μm)處理的htcs中的f-肌動(dòng)蛋白含量顯著降低(圖5h)。這與發(fā)明人的先前報(bào)道，即cd介導(dǎo)的組織力降低是由于完整f肌動(dòng)蛋白的損失相一致。然而，通過(guò)h1152和dnp力降低與f-肌動(dòng)蛋白的損失無(wú)關(guān)。在這些htcs中的alexa-毒傘素標(biāo)記可相比于對(duì)照物。f-肌動(dòng)蛋白也通過(guò)rot處理而得以降低，然而，由于不充足的統(tǒng)計(jì)顯著性，該結(jié)果是非決定性的。用2μmcd處理的毒傘素-染色的細(xì)胞的顯微鏡分析顯示早在3小時(shí)時(shí)f-肌動(dòng)蛋白大量破裂(圖5i的j)。在24小時(shí)時(shí)，短f-肌動(dòng)蛋白被再分布于較不鋪展(圖5i的o)的細(xì)胞和雙核(圖5i的t)細(xì)胞內(nèi)。

rki、dnp和rot不顯著影響f-肌動(dòng)蛋白形貌(圖5i的k-m)。rki處理的細(xì)胞不顯示有限的膜皺褶和降低的在細(xì)胞的中心區(qū)域中的毒傘素染色(圖5i中的p)。用dnp(圖5i的q)和rot(圖5i的r)處理24小時(shí)的細(xì)胞的融合度低于對(duì)照物的融合度(圖5i的n)。在rot處理的細(xì)胞中的顯著核碎裂表明凋亡的引發(fā)(圖5i的w)。這些形貌變化可人工地在這些圖像中確認(rèn)，而自動(dòng)化定量htp分析將需要復(fù)雜的分析算法。

為了進(jìn)一步確定化合物降低組織力的基礎(chǔ)(underling)機(jī)理，使用生物染料四甲基羅丹明乙酯(tmre)定量線粒體電位的變化。tmre為陽(yáng)離子型，并作為mmp的函數(shù)而積聚在線粒體中。在96孔板中的dnp處理的單層和htcs的最初研究顯示在板閱讀器上在單層中無(wú)法檢測(cè)到dnp介導(dǎo)的tmre標(biāo)記的降低(圖6a)，但在htcs中易于量化(圖6b)。使用共焦顯微學(xué)對(duì)dnp對(duì)tmre積聚的影響的更詳細(xì)研究改進(jìn)了在單層和htcs兩者中的信號(hào)檢測(cè)(圖6c、6d)。然而，htc實(shí)驗(yàn)仍然顯示比細(xì)胞單層實(shí)驗(yàn)更優(yōu)越的在檢測(cè)通過(guò)dnp的劑量依賴mmp降低上的靈敏度?？紤]到信號(hào)檢測(cè)的優(yōu)越靈敏度、改進(jìn)的數(shù)據(jù)信噪比和板閱讀器掃描對(duì)htp應(yīng)用的兼容性，發(fā)明人使用htcs用于研究化合物對(duì)mmp的效應(yīng)。

dnp處理3小時(shí)解偶聯(lián)mmp并劑量依賴地降低tmre信號(hào)(圖6e)，且ec50～340μm。培養(yǎng)另外21小時(shí)僅略微增大dnp的效應(yīng)并將ec50進(jìn)一步降低至～95μm(圖6f)。該通過(guò)24小時(shí)處理將tmreec50降低3.6倍顯著小于dnp的ec50的65倍降低對(duì)組織力的影響(圖5f、5g)。該差異表明dnp的快速mmp解偶聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞收縮活性的逐漸降低。由于肌動(dòng)蛋白聚合和肌球蛋白依賴的細(xì)胞收縮需要atp，預(yù)期mmp的快速損失將降低線粒體中atp的生成，并因此降低細(xì)胞收縮性。該細(xì)胞力的時(shí)間延遲降低表明細(xì)胞內(nèi)atp儲(chǔ)備的存在和/或細(xì)胞上調(diào)糖酵解以生成atp的能力。經(jīng)由糖酵解上調(diào)atp生成已經(jīng)在腫瘤細(xì)胞和一些細(xì)胞系中報(bào)導(dǎo)。cd、rki和rot處理降低了線粒體膜電位，但它們降低mmp的程度局限于10-20％(圖6e、6f)。

最后，為了測(cè)量化合物對(duì)細(xì)胞生存能力的效應(yīng)，進(jìn)行使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(mtt)的試驗(yàn)。在細(xì)胞中，通過(guò)琥珀酸脫氫酶將黃色mtt轉(zhuǎn)化為紫色甲臜，該變化可通過(guò)在500-600納米之間的吸光度定量，所述吸光度使用板閱讀器定量記錄。處理3小時(shí)不會(huì)導(dǎo)致生存能力的顯著損失，如mtt試驗(yàn)所測(cè)得(結(jié)果未顯示)。cd和rot處理24小時(shí)顯示htcs的生存能力的劑量依賴降低(圖7a)。0.2和2μmcd處理將mtt信號(hào)降低40％。cd毒性的觀察水平類似于報(bào)導(dǎo)的人類表皮樣細(xì)胞系中的5-30μm的ld50。需要更高的rot濃度，10μm以將mtt信號(hào)降低40％(圖7a)。該rot毒性水平略高于先前報(bào)道的在hepg2細(xì)胞中的25％毒性。rki和dnp處理24小時(shí)不影響mtt信號(hào)。

htc力測(cè)量、tmre定量和mmt試驗(yàn)在相同的htc樣品上進(jìn)行。完整篩選工作流程圖(圖7b)顯示了使用htcs獲得高含量生理學(xué)信息的效率。結(jié)果總結(jié)為表示化合物的生理學(xué)影響的表型圖線板(圖7c至7f)。dnp、cd和rki對(duì)于降低htc力都非常有效。然而，dnp顯示線粒體電位的大量解偶聯(lián)效應(yīng)(圖7c)，而cd是高度毒性的(圖7d)。在另一方面，rot對(duì)htc力、線粒體電位和生存能力具有中等負(fù)影響(圖7f)。rki確定為最佳候選化合物，其具有0.1μm的力降低ec50和有限的線粒體和生存能力毒性。該結(jié)果并不令人驚訝，因?yàn)楣猺kis為可有效降低組織剛度的心臟保護(hù)的非毒性化合物。此外，最近rki藥物fasudil已完成用于動(dòng)脈粥樣硬化和高膽固醇血癥的第ii階段臨床研究。

總之，發(fā)明人已說(shuō)明htcs可如何用于篩選可降低組織收縮力并仍然對(duì)線粒體功能和細(xì)胞生存能力具有最小影響的化合物。使用該htc基篩選體系，發(fā)明人能夠研究細(xì)胞生理學(xué)并在比二維培養(yǎng)更天然的微環(huán)境(即埋入三維基體結(jié)構(gòu))中定量機(jī)械力。

此外，在htcs中細(xì)胞的緊密和多層排列大大增加了熒光試驗(yàn)的檢測(cè)極限和信噪比。具有0.44至0.85的z因子的所述試驗(yàn)的高準(zhǔn)確度和穩(wěn)健性(robustness)將有利于htcs引入現(xiàn)有的htp篩選工作流程。

總之，發(fā)明人提供了使用三維組織模型用于進(jìn)行細(xì)胞基試驗(yàn)的高通量體系。認(rèn)為前述描述僅為本發(fā)明原理的說(shuō)明。此外，由于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于想到許多改變和變化，其不旨在將本發(fā)明限制為所顯示和描述的精確的結(jié)構(gòu)和操作，因此，認(rèn)為所有的改變和等同形式落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。