本發(fā)明涉及數(shù)字pcr技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于數(shù)字pcr的方法及裝置。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)是一種用于放大擴(kuò)增特定的dna片段的分子生物學(xué)技術(shù)，液滴式數(shù)字pcr需要在擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，通過將樣品一次性分散到幾十甚至上百萬個微液滴中來實現(xiàn)單模板分子的隔離。

目前，數(shù)字pcr儀大都需要單獨(dú)的液滴生成設(shè)備(液滴發(fā)生器)來產(chǎn)生液滴，單獨(dú)的液滴生成設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜、尺寸較大，導(dǎo)致數(shù)字pcr儀不方便攜帶，而目前利用微管道生成液滴的方式中，普遍是通過外部設(shè)備來為油相和水相的流動提供動力，由于外部設(shè)備的存在，數(shù)字pcr儀攜帶不方便的問題同樣難以得到解決。另外，液滴生成設(shè)備或提供動力的外部設(shè)備將使得數(shù)字pcr儀造價高昂。

因此，如何能提供一種攜帶方便、價格經(jīng)濟(jì)的數(shù)字pcr裝置，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種用于數(shù)字pcr的方法及裝置，該裝置不僅結(jié)構(gòu)簡單、便于攜帶，而且由于無需配置為油相和水相的流動提供動力的外部設(shè)備，所以該裝置具有價格經(jīng)濟(jì)、操作簡便的優(yōu)點。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種用于數(shù)字pcr的方法，包括：

取油相容器和水相容器，所述油相容器和所述水相容器通過三通管路與用于形成液滴的微管道連通；

調(diào)整所述油相容器和所述水相容器的位置，使所述油相容器內(nèi)的油相不封堵所述油相容器與所述三通管路的連接口，使所述水相容器內(nèi)的水相不封堵所述水相容器與所述三通管路的連接口；

向所述水相容器、所述油相容器和所述微管道組成的系統(tǒng)的內(nèi)腔中充入氣體，使所述系統(tǒng)的內(nèi)部壓強(qiáng)高于外部壓強(qiáng)；

再次調(diào)整所述油相容器和所述水相容器的位置，使油相封堵所述油相容器與所述三通管路的連接口，使水相封堵所述水相容器與所述三通管路的連接口；

將所述微管道遠(yuǎn)離所述三通管路的一端與所述系統(tǒng)的外部導(dǎo)通，所述水相容器和所述油相容器的容積保持不變，所述水相容器內(nèi)的氣體推動所述水相流過所述微管道，所述油相容器內(nèi)的氣體推動所述油相流過所述微管道。

優(yōu)選地，在上述方法中，還包括：

以恒溫器作為熱源使導(dǎo)熱片上的溫度形成梯度分布，所述導(dǎo)熱片的高溫區(qū)的溫度包含pcr擴(kuò)增的高溫變性溫度，所述導(dǎo)熱片的低溫區(qū)的溫度包含pcr擴(kuò)增的低溫復(fù)性溫度；

將所述微管道布設(shè)在所述導(dǎo)熱片上，且所述微管道以預(yù)設(shè)次數(shù)循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過所述導(dǎo)熱片的高溫區(qū)和低溫區(qū)。

優(yōu)選地，在上述方法中，所述微管道在所述導(dǎo)熱片的高溫區(qū)和低溫區(qū)之間循環(huán)往復(fù)20次～80次。

一種用于數(shù)字pcr的裝置，包括用于形成液滴的微管道，所述微管道的進(jìn)口連接有進(jìn)口管，所述進(jìn)口管遠(yuǎn)離所述微管道的一端分叉延伸出兩個支管，其中一個支管連通油相容器的出口，另一個支管連通水相容器的出口，所述裝置還包括用于向所述水相容器、所述油相容器和所述微管道組成的系統(tǒng)的內(nèi)腔中充入氣體的加壓器。

優(yōu)選地，在上述裝置中，還包括：

導(dǎo)熱片，所述微管道以預(yù)設(shè)匝數(shù)纏繞布設(shè)在所述導(dǎo)熱片上，且所述微管道循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過所述導(dǎo)熱片的上表面和下表面；

位于所述導(dǎo)熱片的上表面一側(cè)或下表面一側(cè)的恒溫器，所述恒溫器用于使所述導(dǎo)熱片靠近所述恒溫器的一面加熱至pcr擴(kuò)增的高溫變性溫度，而使所述導(dǎo)熱片相對的另一面加熱至pcr擴(kuò)增的低溫復(fù)性溫度。

優(yōu)選地，在上述裝置中，所述預(yù)設(shè)匝數(shù)為20匝～80匝。

優(yōu)選地，在上述裝置中，還包括：

用于作為熱源的恒溫器；

導(dǎo)熱片，所述導(dǎo)熱片的一部分搭接在所述恒溫器上，其余部分懸在所述恒溫器之外，所述微管道布設(shè)在所述導(dǎo)熱片的相對所述恒溫器的另一面上，且所述微管道以預(yù)設(shè)次數(shù)循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過所述導(dǎo)熱片與所述恒溫器搭接的部分和懸在所述恒溫器之外的部分。

優(yōu)選地，在上述裝置中，所述水相容器、所述油相容器和所述加壓器中的至少一者為注射器。

優(yōu)選地，在上述裝置中，所述微管道的出口一端連通有流量可調(diào)的排氣閥。

優(yōu)選地，在上述裝置中，所述導(dǎo)熱片為pdms芯片，所述導(dǎo)熱片上集成有與所述微管道的出口連通的收集器。

根據(jù)上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供的用于數(shù)字pcr的方法中，首先向水相容器、油相容器和微管道組成的系統(tǒng)內(nèi)充氣加壓，使系統(tǒng)的內(nèi)部壓強(qiáng)大于外部壓強(qiáng)，然后通過水相和油相的封堵分別截住一部分高壓強(qiáng)的氣體，最后將微管道的末端與系統(tǒng)的外部導(dǎo)通，使微管道與水相容器和油相容器之間形成壓差，于是水相和油相在高壓氣體的作用下流過微管道。由此可見，該方法避免了使用外部設(shè)備來為油相和水相的流動提供動力，所以根據(jù)該方法設(shè)計的數(shù)字pcr裝置體積較小、結(jié)構(gòu)簡單、便于攜帶，而且具有價格經(jīng)濟(jì)、操作簡便的優(yōu)點。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實施例一提供的一種用于數(shù)字pcr的裝置的示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例二提供的一種用于數(shù)字pcr的裝置的示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例三提供的一種用于數(shù)字pcr的裝置的示意圖。

圖中標(biāo)記為：

a、液滴生成區(qū)；b、pcr擴(kuò)增區(qū)；c、收集區(qū)；1、加壓器；2、油相容器；3、管接頭；4、連接管；5、通氣閥；6、水相容器；7、四通管；8、恒溫器；9、導(dǎo)熱片；10、微管道；11、收集器；12、排氣閥。

具體實施方式

為了便于理解，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

參見圖1，為本發(fā)明實施例一提供的一種用于數(shù)字pcr的裝置的示意圖，實施例一提供的用于數(shù)字pcr的裝置包括微管道10，微管道10用于形成液滴，微管道10的進(jìn)口連接有進(jìn)口管(圖中未標(biāo)記)，進(jìn)口管遠(yuǎn)離微管道10的一端分叉延伸出兩個支管，其中一個支管連通油相容器2的出口，另一個支管連通水相容器6的出口，該裝置還包括用于向水相容器6、油相容器2和微管道10組成的系統(tǒng)的內(nèi)腔中充入氣體的加壓器1。

由圖1可見，在實施例一中，微管道10的進(jìn)口由連接管4連通四通管7的第一接口，四通管7的第二接口和第三接口分別通過連接管4及管接頭3與油相容器2和水相容器6連通，四通管7的第四接口依次連接通氣閥5、連接管4、管接頭3和加壓器1。

為了實現(xiàn)pcr擴(kuò)增，現(xiàn)有技術(shù)中一般需要配置熱循環(huán)儀，由于熱循環(huán)儀進(jìn)行溫度循環(huán)控制普遍需要較為復(fù)雜的控制系統(tǒng)，所以使得整個數(shù)字pcr裝置的成本較高，而且，由于控制系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的需要，一般也會造成數(shù)字pcr裝置的體積很大。為此，本發(fā)明實施例一提供的數(shù)字pcr裝置還包括恒溫器8和導(dǎo)熱片9，其中，微管道10以預(yù)設(shè)匝數(shù)纏繞布設(shè)在導(dǎo)熱片9上，且微管道10循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過導(dǎo)熱片9的上表面和下表面，如圖1所示，恒溫器8既可以位于導(dǎo)熱片9的上表面一側(cè)，也可以位于導(dǎo)熱片9的下表面一側(cè)，恒溫器8用于使導(dǎo)熱片9靠近恒溫器8的一面加熱至pcr擴(kuò)增的高溫變性溫度，而使導(dǎo)熱片9相對的另一面加熱至pcr擴(kuò)增的低溫復(fù)性溫度。

微管道10纏繞導(dǎo)熱片9的預(yù)設(shè)匝數(shù)可以為20匝～80匝，例如纏繞40匝或60匝。

如圖1所示，微管道10的出口連通有收集器11，收集器11連通有排氣閥12，熒光檢測儀可以放置在微管道10的末端，用于對液滴總數(shù)和具有熒光的液滴進(jìn)行計數(shù)。整個數(shù)字pcr裝置包括液滴生成區(qū)a、pcr擴(kuò)增區(qū)b和收集區(qū)c，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，利用該數(shù)字pcr裝置可以將液滴生成，pcr擴(kuò)增、檢測三個過程一次連續(xù)進(jìn)行，在時間上是連續(xù)的，省去了復(fù)雜的中間操作，如樣品的設(shè)備間轉(zhuǎn)移等操作。

具體實際應(yīng)用中，水相容器6、油相容器2和加壓器1均可采用注射器或其他密閉容器，為了試驗方便，采用其他密閉容器時應(yīng)盡量選用容積可調(diào)的容器。

下面以水相容器6、油相容器2和加壓器1均為注射器時的情形為例介紹該數(shù)字pcr裝置的工作原理：

將除了水相容器6、油相容器2和加壓器1以外的部分如圖1所示連接起來后，將纏繞了微管道10的導(dǎo)熱片9放置在恒溫器8上，設(shè)置恒溫器8的溫度為pcr擴(kuò)增的高溫變性溫度，例如95℃。導(dǎo)熱片9的上、下表面的溫差隨材質(zhì)導(dǎo)熱率和導(dǎo)熱片9的幾何尺寸改變，因此可以通過合理的設(shè)計使導(dǎo)熱片9遠(yuǎn)離恒溫器8的一面的溫度為pcr擴(kuò)增的低溫復(fù)性溫度，例如65℃。

取20ml注射器作為加壓器1，取兩個5ml注射器分別作為油相容器2和水相容器6，將油相容器2固定在4ml位置，里面加入200微升礦物油；將水相容器6固定在1ml位置，里面加入20微升核酸溶液。待導(dǎo)熱片9上表面溫度平衡后，將三個注射器接入管接頭3，關(guān)閉末端排氣閥12，打開通氣閥5，將油相容器2和水相容器6水平放置(液體不淹沒注射器出口即可)，將加壓器1由20ml位置壓縮到5ml位置并固定，此時系統(tǒng)內(nèi)部壓力高于外界大氣壓，一段時間(10s即可)后，關(guān)閉通氣閥5，將油相容器2和水相容器6豎直放置(液體淹沒注射器出口)，緩慢打開排氣閥12，油相和水相即可流向微管道10并在微管道10內(nèi)產(chǎn)生微小液滴，液滴沿著微管道10循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過導(dǎo)熱片9的上表面和下表面，最后進(jìn)入收集器11。

由上述工作原理可知，使用本發(fā)明提供的用于數(shù)字pcr的裝置時，首先向水相容器6、油相容器2和微管道10組成的系統(tǒng)內(nèi)充氣加壓，使系統(tǒng)的內(nèi)部壓強(qiáng)大于外部壓強(qiáng)，然后通過水相和油相的封堵分別截住一部分高壓強(qiáng)的氣體，最后將微管道10的末端與系統(tǒng)的外部導(dǎo)通，使微管道10與水相容器6和油相容器2之間形成壓差，于是水相和油相在高壓氣體的作用下流過微管道10。由此可見，該裝置避免了使用外部設(shè)備來為油相和水相的流動提供動力，所以該裝置體積較小、結(jié)構(gòu)簡單、便于攜帶，而且具有價格經(jīng)濟(jì)、操作簡便的優(yōu)點。

本發(fā)明提供的用于數(shù)字pcr的裝置采用系統(tǒng)內(nèi)部高于外部環(huán)境的內(nèi)部壓力作為動力，能夠?qū)崿F(xiàn)液滴的自發(fā)形成和流動，通過設(shè)計油相容器2和水相容器6之間的空氣體積比可以得到所需的油相和水相液滴體積的比例，其具體原理是：在油相容器2和水相容器6內(nèi)部壓力相同的情況下，當(dāng)兩者末端壓降相同時，油相容器2和水相容器6會分別排出與各自內(nèi)部空氣體積成相同比例的礦物油和核酸溶液。

為了控制液滴的pcr擴(kuò)增時間。可以通過改變排氣閥12的空氣通量來改變液滴的流速，因此排氣閥12可以選用流量可調(diào)的排氣閥。具體實際應(yīng)用中，排氣閥12可以選用透氣性材料，如微型透氣管道、硅膠管等。

圖2和圖3分別為本發(fā)明實施例二和實施例三提供的用于數(shù)字pcr的裝置的示意圖，實施例二和實施例三中，導(dǎo)熱片9為pdms芯片，實施例三與實施例二的不同僅在于將y型管(三通管)和收集器11集成到了導(dǎo)熱片9上。

實施例二和實施例三與實施例一的區(qū)別之處除了將四通管7改用y型管(三通管)之外，還包括pcr擴(kuò)增區(qū)的不同。在實施例二和實施例三中，導(dǎo)熱片9的一部分搭接在恒溫器8上，其余部分懸在恒溫器8之外，微管道10布設(shè)在導(dǎo)熱片9的相對恒溫器8的另一面上，且微管道10以預(yù)設(shè)次數(shù)循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過導(dǎo)熱片9與恒溫器8搭接的部分和懸在恒溫器8之外的部分。與實施例一相類似，微管道10可以在導(dǎo)熱片9的表面循環(huán)往復(fù)20次～80次，例如循環(huán)往復(fù)40次或60次。

由于實施例二和實施例三采用了y型管(三通管)連接油相容器2、水相容器6和微管道10，所以在對系統(tǒng)進(jìn)行充氣加壓時，加壓器1可以通過排氣閥12向系統(tǒng)內(nèi)充入氣體，即采用末端加壓的方式。

本發(fā)明還提供了一種用于數(shù)字pcr的方法，該方法包括：

取油相容器2和水相容器6，油相容器2和水相容器6通過三通管路與用于形成液滴的微管道10連通；

調(diào)整油相容器2和水相容器6的位置，使油相容器2內(nèi)的油相不封堵油相容器2與三通管路的連接口，使水相容器6內(nèi)的水相不封堵水相容器6與三通管路的連接口；

向水相容器6、油相容器2和微管道10組成的系統(tǒng)的內(nèi)腔中充入氣體，使系統(tǒng)的內(nèi)部壓強(qiáng)高于外部壓強(qiáng)；

再次調(diào)整油相容器2和水相容器6的位置，使油相封堵油相容器2與三通管路的連接口，使水相封堵水相容器6與三通管路的連接口；

將微管道10遠(yuǎn)離三通管路的一端與系統(tǒng)的外部導(dǎo)通，水相容器6和油相容器2的容積保持不變，水相容器6內(nèi)的氣體推動水相流過微管道10，油相容器2內(nèi)的氣體推動油相流過微管道10。

具體實際應(yīng)用中，為了便于實現(xiàn)pcr擴(kuò)增所需的溫度變化，本發(fā)明提供的用于數(shù)字pcr的方法還包括：

以恒溫器8作為熱源使導(dǎo)熱片9上的溫度形成梯度分布，導(dǎo)熱片9的高溫區(qū)的溫度包含pcr擴(kuò)增的高溫變性溫度，導(dǎo)熱片9的低溫區(qū)的溫度包含pcr擴(kuò)增的低溫復(fù)性溫度；

將微管道10布設(shè)在導(dǎo)熱片9上，且微管道10以預(yù)設(shè)次數(shù)循環(huán)往復(fù)地經(jīng)過導(dǎo)熱片9的高溫區(qū)和低溫區(qū)。

微管道10在導(dǎo)熱片9的高溫區(qū)和低溫區(qū)之間一般循環(huán)往復(fù)20次～80次。

對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。