本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重金屬離子吸附系統(tǒng)及其宿主菌、重金屬離子回收方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著我國經(jīng)濟建設(shè)的迅猛發(fā)展，對重金屬的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造活動日益增多，造成不少重金屬(如鉛、汞、鎘等)進(jìn)入大氣、水、土壤中，引發(fā)了一系列嚴(yán)重的污染事件，對生態(tài)環(huán)境造成了極大的危害。重金屬造成的急性中毒和各類人體慢性疾病如老年癡呆癥，也正在時刻威脅著人類的健康。而另一方面，隨著科技水平的日新月異，那些化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、物理屬性優(yōu)良的重金屬如金、銀、銅、鉑、鈀等，被廣泛應(yīng)用在了電子、通訊、航空航天、化工、醫(yī)療等領(lǐng)域，以及與人們?nèi)粘Ｉ钕嚓P(guān)的各類生活日用品中。如何合理地將自然界中的重金屬應(yīng)用到人類的生產(chǎn)生活中，使之與生態(tài)環(huán)境保護(hù)可持續(xù)性和諧發(fā)展是目前科技工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。一方面，一些重金屬離子在很低濃度時就會對生物體具有極強的毒性，且與有機化合物不同，重金屬具有富集性，在自然環(huán)境中很難被降解。由于生產(chǎn)工藝的限制，在一系列生產(chǎn)活動所產(chǎn)生的廢棄物，例如工業(yè)廢水中含有大量的重金屬離子，這既會對生態(tài)環(huán)境造成破壞，也使得生產(chǎn)成本居高不下。目前對于工業(yè)廢水中重金屬離子的檢測和富集主要采用的都是物理吸附和化學(xué)試劑法，這些方法一般檢測靈敏度較低，尤其是對各種性質(zhì)相近的重金屬離子的區(qū)分度較差，無法實現(xiàn)對某種特定重金屬離子的特異識別與去除。而采用大型分析設(shè)備如icp-ms(電感耦合等離子體質(zhì)譜)，雖然其對重金屬離子的檢測靈敏度更高，但是操作手段繁瑣，耗時較長，必須要將樣品送到指定部門由專業(yè)人員進(jìn)行檢測，難以實現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢驗和實時監(jiān)測，且在檢測的基礎(chǔ)之上再利用這些大型儀器實現(xiàn)重金屬的特異吸附就更加困難。

綜上，現(xiàn)有的重金屬離子回收的化學(xué)方法有三個缺點：第一是化學(xué)方法有可能由于加入的化學(xué)試劑的量不合適而造成二次污染；第二是化學(xué)方法選擇性不夠高，尤其是處理性質(zhì)極相近的各種重金屬離子效果不好，即使回收得到了一定的目的金屬，純度也不高，還需要進(jìn)一步處理；第三是化學(xué)方法回收工業(yè)廢水中的重金屬離子時所產(chǎn)生的污水對于環(huán)境不友好，沉淀劑等化學(xué)試劑可能對于自然環(huán)境造成更大的破壞。鉛、金與鈾酰是重金屬中少有的化學(xué)、物理、電子性能優(yōu)異的重金屬，應(yīng)用領(lǐng)域非常廣，但是現(xiàn)有的方法很難實現(xiàn)對工業(yè)廢水中重金屬離子的高效選擇性富集和回收。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種重金屬離子吸附系統(tǒng)及其宿主菌、重金屬離子回收方法，旨在解決現(xiàn)有重金屬離子回收選擇性不強、純度低、效果不理想，以及污染環(huán)境的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種重金屬離子吸附系統(tǒng)，包括相互連接的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列，且所述枯草芽孢桿菌芽生物膜蛋白tasadna序列與啟動子連接。。

另一方面，本發(fā)明提供一種重金屬離子吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，包括由上述重金屬離子吸附系統(tǒng)表達(dá)的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和重金屬離子結(jié)合蛋白。

另一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，包括上述重金屬離子吸附系統(tǒng)。

又一方面，本發(fā)明提供一種宿主菌，所述宿主菌包括上述表達(dá)載體；或所述宿主菌表達(dá)上述重金屬離子吸附蛋白表面展示系統(tǒng)。

再一方面，本發(fā)明提供一種上述重金屬離子吸附系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

從枯草芽孢桿菌基因組中擴增出枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列；

從表達(dá)重金屬離子結(jié)合蛋白的菌種基因組中擴增出所述重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列；

將啟動子、所述枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和所述重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列依次連接。

最后，本發(fā)明提供一種重金屬離子回收方法，包括如下步驟：

提供含有重金屬離子的液體；

將本發(fā)明的宿主菌培養(yǎng)后加入所述液體中，靜置處理；

待所述溶液中出現(xiàn)沉淀后，進(jìn)行過濾處理得到吸附有重金屬離子的所述宿主菌；

用酸處理吸附有重金屬離子的所述宿主菌，分離后得到重金屬離子。

本發(fā)明的重金屬離子吸附系統(tǒng)高選擇性吸附重金屬離子，其根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌中重金屬離子的調(diào)控機制設(shè)計，其中包含了該菌調(diào)控機制中關(guān)鍵部分。本發(fā)明的重金屬離子吸附系統(tǒng)包括枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和重金屬離子結(jié)合蛋白的dna序列以及調(diào)控其表達(dá)的啟動子，而且其容易制備、成本較低、操作方便。將該系統(tǒng)連接到質(zhì)粒中后導(dǎo)入非致病性的枯草芽孢桿菌細(xì)胞體內(nèi)，在啟動子調(diào)控下使得吸附部分的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和重金屬離子結(jié)合蛋白大量表達(dá)，可高效選擇性吸附重金屬離子?？梢员磉_(dá)重金屬離子吸附蛋白表面展示系統(tǒng)的工程菌，對重金屬離子的吸附及回收具有很好的效果。

本發(fā)明提供的重金屬回收方法，利用可表達(dá)重金屬離子吸附蛋白表面展示系統(tǒng)的工程菌高效吸附回收重金屬離子，將工程菌液加入到含重金屬離子的廢水中，菌體能夠在細(xì)胞膜外大量表達(dá)重金屬離子結(jié)合蛋白，將廢水中的重金屬離子結(jié)合，其選擇性強、獲得的純度高；在完成重金屬離子結(jié)合吸附后，對菌體進(jìn)行聚集和沉淀，菌體回收方便，可二次使用。本發(fā)明最終能夠通過生物手段實現(xiàn)對工業(yè)廢水中重金屬離子的可循環(huán)富集和回收；因此，其夠克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，不會造成二次污染，對環(huán)境友好。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1重金屬離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖2是本發(fā)明實施例1重金屬離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒的電泳鑒定圖；其中，m是dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是重金屬離子檢測系統(tǒng)質(zhì)粒泳道；

圖3是本發(fā)明實施例2重金屬離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；

圖4是本發(fā)明實施例2重金屬離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒的電泳鑒定圖；其中，m是dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，1是融合蛋白表達(dá)tasa-golb/pbrr/sup質(zhì)粒泳道；

圖5是本發(fā)明實施例3重金屬離子吸附系統(tǒng)表達(dá)時使用的pdg1730質(zhì)粒載體圖譜；

圖6是本發(fā)明實施例6重金屬離子吸附系統(tǒng)對金離子吸附效果對比圖；

圖7是本發(fā)明實施例6重金屬離子吸附系統(tǒng)對鈾酰離子吸附效果對比圖；

圖8是本發(fā)明實施例6重金屬離子吸附系統(tǒng)對鉛離子吸附效果對比圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種重金屬離子吸附系統(tǒng)，包括相互連接的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列，且該枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列與啟動子連接。

在一實施例中，該啟動子為pcot，其序列如seqidno:18所示；或者該啟動子也可以為pveg，其序列如seqidno:21所示。而枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列如seqidno:3所示。

進(jìn)一步地，重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列的下游連接有綠色熒光蛋白egfpdna序列，如seqidno:15所示。如此，可以進(jìn)一步檢測到重金屬離子吸附系統(tǒng)的表達(dá)。

又一實施例中，該重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列為鉛離子結(jié)合蛋白pbrrdna序列，其如seqidno:6所示；或重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列為金離子結(jié)合蛋白golbdna序列，其如seqidno:9所示；或重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列為鈾酰離子結(jié)合蛋白supdna序列，其如seqidno:12所示。凡是可以與重金屬離子結(jié)合的功能蛋白dna序列，都是本發(fā)明實施例中金屬離子結(jié)合蛋白dna序列，這里不一一列舉。

另一方面，本發(fā)明實施例提供一種重金屬離子吸附蛋白表面展示系統(tǒng)，其包括由本發(fā)明實施例的重金屬離子吸附系統(tǒng)表達(dá)的枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa和金離子結(jié)合蛋白golb。

另一方面，本發(fā)明實施例提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括本實施例的重金屬離子吸附系統(tǒng)。同時，本發(fā)明實施例提供了一種宿主菌，該宿主菌包括本實施例的表達(dá)載體；或表達(dá)本實施例的重金屬離子吸附蛋白表面展示系統(tǒng)。

又一方面，本發(fā)明實施例提供一種上述重金屬離子吸附系統(tǒng)的制備方法，包括如下步驟：

s011：從枯草芽孢桿菌基因組中擴增出枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列；

s012：從表達(dá)重金屬離子結(jié)合蛋白的菌種基因組中擴增出該重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列；

s013：將啟動子、枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列和重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列依次連接。

在一實施例中，擴增所述枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasadna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；又一實施例中，該啟動子可以為pcot或pveg，且擴增pcot的引物如seqidno:16、seqidno:17所示，擴增pveg的引物如seqidno:19、seqidno:20所示，該兩啟動子都可從本實驗室枯草芽孢桿菌基因組中擴增出；又一實施例中，重金屬離子結(jié)合蛋白dna序列為鉛離子結(jié)合蛋白pbrrdna序列或金離子結(jié)合蛋白golbdna序列或鈾酰離子結(jié)合蛋白supdna序列，且擴增該鉛離子結(jié)合蛋白pbrrdna序列的引物如dnaseqidno:4、seqidno:5所示，擴增該金離子結(jié)合蛋白golbdna序列的引物如dnaseqidno:7、seqidno:8所示，擴增該鈾酰離子結(jié)合蛋白supdna序列的引物拉如seqidno:10、seqidno:11所示。本實施例中，可從鼠傷寒沙門氏菌基因組(ncbi中的引用位置：nc_003197)與嗜銅桿菌基因組(ncbi中的引用位置：nc_007973)中分別擴增出金離子結(jié)合蛋白golbdna序列和鉛離子結(jié)合蛋白pbrrdna序列；而鈾酰離子結(jié)合蛋白supdna序列可人工合成，效果更好。

最后，本發(fā)明實施例還提供了一種重金屬離子回收方法，其包括如下步驟：

s021：提供含有重金屬離子的液體；

s022：將本發(fā)明實施例的宿主菌培養(yǎng)后加入上述液體中，靜置處理；

s023：待溶液中出現(xiàn)沉淀后，進(jìn)行過濾處理得到吸附有重金屬離子的宿主菌；

s024：用酸處理吸附有重金屬離子的宿主菌，分離后得到重金屬離子。

在一選實施例中，上述步驟s021中，含有重金屬離子的液體可以是各種工業(yè)廢水、礦業(yè)廢水等中含有重金屬離子的回收液，在該液體中重金屬離子的濃度范圍優(yōu)選為0.1μm～20μm；上述步驟s022中，靜置處理的時間范圍為40h～48h，該范圍內(nèi)宿主菌對液體中重金屬離子起到很好的吸附效果。

本發(fā)明先后進(jìn)行過多次試驗，現(xiàn)舉一部分試驗結(jié)果作為參考對發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

實施例1重金屬離子檢測系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.檢測系統(tǒng)中重金屬離子結(jié)合蛋白基因片段的擴增

使用特異引物(seqidno:4)(seqidno:5)(seqidno:7)(seqidno:8)從嗜銅桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_007973)與鼠傷寒沙門氏菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中擴增出編碼重金屬離子結(jié)合蛋白基因的dna序列(seqidno:6)(seqidno:9)，人工合成的sup基因的dna序列(seqidno:12)，并設(shè)計對應(yīng)的擴增引物(seqidno:10)(seqidno:11)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，3分鐘

第二步：95℃，1分鐘

第三步：60℃，2分鐘

第四步：72℃，4分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2.枯草芽孢桿菌生物膜蛋白(tasa)片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物tasa1(seqidno:1)和tasa2(seqidno:2)，從枯草芽孢桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中擴增出編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa第1位至第314位dna的堿基序列(seqidno:3)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3.檢測系統(tǒng)中報告基因egfp-terminator片段的擴增

1)綠色熒光蛋白egfp片段基因的擴增

使用特異引物(seqidno:13)(seqidno:14)從本實驗室所有的大腸桿菌表達(dá)載體基因組dna中擴增出編碼綠色熒光蛋白egfp的dna序列(seqidno:15)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2)終止子terminator片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物term1(seqidno:22)和term2(seqidno:23)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達(dá)載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:24)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3)egfp-terminator片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，使用特異引物(seqidno:13)(seqidno:23),以上述第1和2點回收的擴增產(chǎn)物為模版，擴增出egfp-terminator片段的dna序列，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr反應(yīng)條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：65℃，0.5分鐘

第四步：72℃，1分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

4.檢測系統(tǒng)中重金屬離子表面展示和報告基因融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1)使用dna限制性內(nèi)切酶ecori和psti酶切上述tasa基因的dna片段，然后使用t4dna連接酶插入到本實驗室所有的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

2)使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶切上述得到的三個重金屬離子吸附蛋白的dna片段(pbrr,golb與sup)然后使用t4dna連接酶插入1)步驟構(gòu)建完成的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

3)最后使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶切上述egfp-terminator片段，然后使用t4dna連接酶插入2)步驟構(gòu)建完成的大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中，得到重金屬離子檢測系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒見圖1，電泳鑒定結(jié)果請見圖2。

實施例2重金屬離子吸附系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.吸附系統(tǒng)中專用啟動子片段ptas與pveg的擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物(seqidno:16)(seqidno:17)或(seqidno:19)(seqidno:20)，從本實驗室枯草芽孢桿菌基因組中擴增出重金屬離子調(diào)控基因的啟動子的ptas序列(seqidno:18)或pveg序列(seqidno:21)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2.吸附系統(tǒng)中重金屬離子吸附基因片段的擴增

1)枯草芽孢桿菌生物膜蛋白(tasa)片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物tasa1(seqidno:1)和tasa2(seqidno:2)，從枯草芽孢桿菌基因組dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中擴增出編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa第1位至第314位dna的堿基序列(seqidno:3)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：95℃，2分鐘

第二步：95℃，0.5分鐘

第三步：63℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：4℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

2)重金屬離子結(jié)合蛋白片段的基因擴增

見實施例1。

3)終止子terminator片段的基因擴增

根據(jù)所需擴增目的dna序列和堿基互配原理，設(shè)計特異引物term1(seqidno:22)和term2(seqidno:23)，從本實驗室所有的大腸桿菌表達(dá)載體基因組dna中擴增出終止子terminator的dna序列(seqidno:24)，反應(yīng)條件如下。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr條件：

第一步：94℃，2分鐘

第二步：94℃，0.5分鐘

第三步：60℃，0.5分鐘

第四步：72℃，0.5分鐘

第五步：重復(fù)第二步至第四步，29個循環(huán)

第六步：72℃，10分鐘

第七步：10℃保溫。

回收pcr產(chǎn)物，備用。

3.tasa-golb融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1)使用dna限制性內(nèi)切酶xbai和psti酶解上述tasa和三種重金屬離子結(jié)合蛋白的dna片段，然后使用t4dna連接酶插入大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中，tasa-pbrr/golb/sup融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜請詳見圖3，鑒定結(jié)果見圖4。

酶切反應(yīng)體系(20μl)

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl(100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

實施例3重金屬離子吸附系統(tǒng)同源重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.使用dna限制性內(nèi)切酶psti和spei酶解上述得到的啟動子pcot/pveg片段，使用dna限制性內(nèi)切酶psti和xbai酶解上述tasa-pbrr/golb/sup的dna片段，然后使用t4dna連接酶插入到大腸桿菌生物磚質(zhì)粒骨架pzh2中，將大腸桿菌生物磚表達(dá)載體pzh2中的目的片段使用dna限制性內(nèi)切酶psti和ecori酶切下來整合到pdg1730枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(見圖5)，同源重組到枯草芽孢桿菌的基因組上進(jìn)行表達(dá)，即獲得所述的重金屬離子吸附系統(tǒng)。

酶切反應(yīng)體系(20μl)：

反應(yīng)條件：37℃水浴10小時。

dna連接反應(yīng)體系(10μl，100ngdna)：

反應(yīng)條件：16℃水浴16小時。

實施例4重金屬離子吸附系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌

1)將上述同源重組所得的表達(dá)型質(zhì)粒載體用cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，酶切鑒定重組整合載體。

2)枯草芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化，活化枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)接到spi培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)到spⅱ培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成感受態(tài)，將重組pdg1730質(zhì)粒切成線狀轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌，具體方法參照zeigler(2002)。

3)重組菌的篩選和鑒定

采用常規(guī)菌落pcr法和抽提陽性克隆的質(zhì)粒后酶切鑒定法，具體可參見《takara限制性內(nèi)切酶采購目錄和技術(shù)指南》。測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。重金屬離子吸附及回收系統(tǒng)質(zhì)粒的提取與鑒定。

實施例5重金屬離子吸附系統(tǒng)對重金屬離子選擇性能力的檢測

1.將用于檢測重金屬離子的枯草芽孢桿菌菌種接入適量含有壯觀霉素(50μgml^-1)的lb液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)菌液1:100稀釋入適量含有壯觀霉素(50μgml^-1)dsm液體培養(yǎng)基中于37℃中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600＝0.6，向培養(yǎng)液中分別加入終濃度為20μm的銀、鎳、鋅、銅、鎘、鉻、鉛離子，培養(yǎng)液在37℃中繼續(xù)培養(yǎng)48h；

2.培養(yǎng)48h的細(xì)菌培養(yǎng)液通過離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘，2min)收集后，用去離子水清洗1次；

3.清洗后的菌體使用1×pbs緩沖液重懸；

4.使用酶標(biāo)儀檢測重懸后的菌液。

檢測結(jié)果顯示：經(jīng)改造的工程菌對相對應(yīng)的重金屬離子有較好的選擇性。

實施例6tasa-pbrr/golb/sup、wt168重金屬離子吸附能力的檢測

對工程菌tasa-pbrr/golb/sup(對應(yīng)連接兩種不同的啟動子：pcot或pveg)以及wt168(枯草芽孢桿菌常用品系，此處為對照組)進(jìn)行吸附實驗，檢測重金屬離子吸附能力。實驗前兩種菌均劃線培養(yǎng)于lb固體培養(yǎng)基中(壯觀霉素抗性)。

①從兩個個培養(yǎng)皿中分別挑取單菌落接種于5mllb(含5ul壯觀霉素)培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)過夜。

②將細(xì)菌培養(yǎng)液以1：100重新接種于100mllb(含100ul氨芐青霉素)培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)至od600＝0.6，加入重金屬離子濃度終濃度分別為1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm繼續(xù)培養(yǎng)48h。每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)。

③收集細(xì)菌，棄上清液。ddh2o清洗3次。-80℃凍存6h后用凍干機凍干細(xì)菌沉淀。

④稱重后用1ml濃硝酸消解至完全，用雙蒸水定容至10ml，最后使用電感耦合等離子發(fā)射光譜(icp-aes)檢測。

在重金屬離子濃度為20μmol時，其吸附檢測結(jié)果如圖6、圖7和圖8所示：圖6為兩種工程菌(pcot/pveg-tasa-golb)相對對照組對金離子吸附效果圖，圖7為兩種工程菌(pcot/pveg-tasa-sup)相對對照組對鈾酰離子吸附效果圖，圖8為兩種工程菌(pcot/pveg-tasa-pbrr)相對對照組對鉛離子的吸附效果圖。檢測結(jié)果顯示：經(jīng)改造的工程菌對相對應(yīng)的重金屬離子有更好的吸附性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳勁宇生物科技有限公司

<120>重金屬離子吸附系統(tǒng)及其宿主菌、重金屬離子回收方法

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<210>1

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<213>擴增編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa的基因的引物

<400>1

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<213>擴增編碼枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa的基因的引物

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<213>枯草芽孢桿菌生物膜蛋白tasa的dna序列

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<213>擴增編碼鉛離子結(jié)合蛋白pbrr的基因的引物

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<213>擴增編碼鉛離子結(jié)合蛋白pbrr的基因的引物

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<213>鉛離子結(jié)合蛋白pbrr的dna序列

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<213>擴增編碼金離子結(jié)合蛋白golb的基因的引物

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<213>擴增編碼金離子結(jié)合蛋白golb的基因的引物

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<213>金離子結(jié)合蛋白golb的dna序列

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<213>擴增編碼鈾酰離子結(jié)合蛋白sup的基因的引物

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<213>擴增編碼鈾酰離子結(jié)合蛋白sup的基因的引物

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<213>鈾酰離子結(jié)合蛋白sup的dna序列

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<213>擴增編碼綠色熒光蛋白egfp的基因的引物

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<213>擴增編碼綠色熒光蛋白egfp的基因的引物

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<213>綠色熒光蛋白egfp的dna序列

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<213>擴增啟動子ptas的引物

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<213>擴增啟動子ptas的引物

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<213>啟動子ptas的序列

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<213>擴增啟動子pveg的引物

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<213>擴增啟動子pveg的引物

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<213>啟動子pveg的序列

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<213>擴增終止子terminator的引物

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<213>擴增終止子terminator的引物

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<213>終止子terminator的序列

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