本發(fā)明屬于酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多巴胺及其衍生物快速交聯(lián)表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酶固定化不僅能夠顯著提高酶的穩(wěn)定性，而且可以實(shí)現(xiàn)酶的回收再利用，大大降低酶的使用成本。在酶固定化過(guò)程中，常使用戊二醛作為交聯(lián)劑，然而，已有研究表明：固定化酶活力與戊二醛用量成反比，過(guò)量的戊二醛會(huì)引起不必要的酶分子間交聯(lián)，而過(guò)度的交聯(lián)會(huì)扭曲酶的結(jié)構(gòu)，致使酶活力降低,此外，戊二醛的生物毒性，限制了其應(yīng)用范圍。因此，急需尋找一種簡(jiǎn)單的、無(wú)毒的、溫和的方法進(jìn)行酶的高效綠色固定化。

多巴胺是一種生物神經(jīng)遞質(zhì)，可在堿性有氧溶液中發(fā)生自聚合反應(yīng)，從而形成一層強(qiáng)力粘附在固體材料表面的聚多巴胺層。由于多巴胺具有優(yōu)良分散性、生物相容性和溫和反應(yīng)條件，已作為一種理想的黏合材料用于酶固定化領(lǐng)域。

申請(qǐng)?zhí)?01110460474.0的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了一種采用戊二醛交聯(lián)固定化修飾脂肪酶novozyme435的方法，該制備方法是將脂肪酶novozyme435以戊二醛為交聯(lián)劑，在20-50℃、40-240rpm下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)15-120min，化學(xué)交聯(lián)后得到的二次修飾后脂肪酶novozy435的穩(wěn)定性得到了提高，經(jīng)二次修飾后的novozyme435重復(fù)使用5次后所得產(chǎn)率較未交聯(lián)修飾的脂肪酶novozyme435提高了49.3%。

上述及現(xiàn)有的交聯(lián)固定化酶催化劑的主要交聯(lián)劑是戊二醛溶液，所制備得到的二次修飾后的固定化酶，雖然重復(fù)利用率得到了提高，但固定化酶在戊二醛的作用下，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，致使酶活力降低，此外，戊二醛的生物毒性，限制了其應(yīng)用范圍，因此，急需尋找一種簡(jiǎn)單的、無(wú)毒的、溫和的方法進(jìn)行固定化酶的高效綠色二次修飾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多巴胺及其衍生物快速交聯(lián)表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法及其應(yīng)用，該方法以多巴胺或其衍生物為交聯(lián)劑，在磁力攪拌的作用下提供溶解氧進(jìn)行氧化自聚-交聯(lián)，是一種簡(jiǎn)單的、無(wú)毒的、溫和的、高效綠色的二次修飾固定化酶。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種多巴胺及其衍生物快速交聯(lián)表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法，首先在室溫水相快速共沉淀制備得表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑，然后以多巴胺或其衍生物為交聯(lián)劑，攪拌下進(jìn)行自聚-交聯(lián)，當(dāng)表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑外包裹黑色聚多巴胺時(shí)，離心冷凍干燥，即得多巴胺交聯(lián)包埋后的“核殼”狀的表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑。

作為改進(jìn)的是，所述多巴胺或其衍生物為鹽酸多巴胺。

上述一種多巴胺及其衍生物快速交聯(lián)表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，室溫水相快速共沉淀制備得表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑

1）配制0.01-1mmol/ml表面活性劑水溶液，室溫下，以100~150rpm的速度邊攪拌邊滴加游離酶水溶液至澄清，得混合液；

2）將混合液邊攪拌邊滴加至0.01-1mmol金屬離子鹽溶液，室溫下以100~150rpm的速度攪拌反應(yīng)30-60min后得表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑水溶液；

3）將表面活性劑-酶的納米復(fù)合催化劑水溶液離心，并用去離子水沖洗1-3次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可得到表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑；

步驟2，多巴胺自聚-交聯(lián)

取20-200mg表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑在超聲作用下均勻分散在10-100ml摩爾濃度為10-100mmol的tris-hcl緩沖液中，添加10-40mg的多巴胺或其衍生物，室溫下磁力攪拌24h后離心，并用去離子水洗滌1-3次，真空冷凍干燥至恒重即得多巴胺交聯(lián)包埋后的“核殼”狀的表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑。

優(yōu)選的是，步驟1的1）中所述表面活性劑為脫氧膽酸鈉、?；敲撗跄懰徕c、甘氨脫氧膽酸納或鵝脫氧膽酸鈉中任一種；游離酶為南極假絲酵母脂肪酶a、南極假絲酵母脂肪酶b、褶皺假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪酶、疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中一種或多種組合，所述游離酶水溶液中游離酶與水的質(zhì)量比為0.1~1:50。

優(yōu)選的是，步驟1的1）中以表面活性劑水溶液為參照物，所述游離酶水溶液的添加量為0.005~1ml/ml。

優(yōu)選的是，步驟1的2）中所述金屬離子為co²⁺、ca²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ba²⁺、cu²⁺、ni²⁺、sn²⁺或mg²⁺中任一種。

優(yōu)選的是，步驟1的3）中離心5~15min，離心時(shí)轉(zhuǎn)速為4000~8000rpm，真空冷凍干燥的真空度為1.3~13pa，溫度為-85℃~-10℃。

優(yōu)選的是，步驟2中tris-hcl緩沖液的ph為8，磁力攪拌速度為100~150rpm，攪拌時(shí)間為1-36h，離心時(shí)轉(zhuǎn)速為4000~8000rpm離心5-15min，真空冷凍干燥的真空度為1.3~13pa，溫度為-85℃~-10℃。

上述多巴胺及其衍生物快速交聯(lián)表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑在純有機(jī)相或水油兩相生物催化中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用多巴胺自聚-交聯(lián)，附著在表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的表面，從而將表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑包埋起來(lái)，使得到的表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、重復(fù)利用率及耐受性，大大降低酶的使用成本，尤其適合在純有機(jī)相生物催化中的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1的掃描電鏡圖，其中，（a）為crl-msnc，（b）為pda@crl-msnc；

圖2為實(shí)施例1的透射電鏡圖，其中，（a）為crl-msnc，（b）為pda@crl-msnc；

圖3為實(shí)施例1中crl、crl-msnc和pda@crl-msnc的耐有機(jī)溶劑穩(wěn)定性；

圖4為實(shí)施例2掃描電鏡圖，其中，（a）為papain-msnc，（b）為pda@papain-msnc；

圖5為實(shí)施例1中crl-msnc與pda@crl-msnc在水溶液中的重復(fù)利用率；

圖6為實(shí)施例1中crl、crl-msnc和pda@crl-msnc催化合成維生素e琥珀酸酯的轉(zhuǎn)化率；

圖7為實(shí)施例1中crl-msnc和pda@crl-msnc在dmso中的重復(fù)利用率。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

一種鹽酸多巴胺快速交聯(lián)改性脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，室溫水相快速共沉淀制備表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑

1）表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml脫氧膽酸鈉水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml假絲酵母脂肪酶水溶液（crl）2ml，攪拌至溶液澄清，得混合液；

2）將混合液邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol六水合氯化鈷水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

3）將脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可得到脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑（crl-msnc），其中，真空度為1.3~13pa，溫度為-85℃~-10℃。

步驟2，多巴胺自聚-交聯(lián)改性

取100mgcrl-msnc，超聲作用5min使其均勻分散在10ml10mm的tris-hcl（ph8.0）緩沖液中，添加20mg的鹽酸多巴胺，在室溫下以120rpm的轉(zhuǎn)速磁力攪拌交聯(lián)24h；

將crl-msnc水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水洗滌2次，洗去未反應(yīng)的多巴胺，真空冷凍干燥至恒重即得多巴胺交聯(lián)改性后“核殼”狀脫氧膽酸-假絲酵母脂肪酶-co²⁺納米復(fù)合催化劑（pda@crl-msnc），其中，真空度為1.3~13pa，溫度為-85℃~-10℃。

本實(shí)施例制備的crl-msnc和pda@crl-msnc在電鏡下的掃描圖如圖1-2所示，從圖中可以看出，crl-msnc是一種球狀顆粒，其平均粒徑在80nm左右。而經(jīng)過(guò)聚多巴胺改性后生成的“核殼”狀的pda@crl-msnc也呈現(xiàn)相類(lèi)似的形狀，其粒徑范圍在100nm左右，表明聚多巴胺已經(jīng)成功地粘附在其表面，且厚度約為20nm。

如圖5所示，本實(shí)施例crl-msnc和pda@crl-msnc在水溶液中經(jīng)過(guò)10次重復(fù)利用后，crl-msnc的相對(duì)酶活低于80%，而pda@crl-msnc的相對(duì)酶活仍能維持93%以上。天然crl與pda@crl-msnc的最適ph均為7.0，但是由于納米載體對(duì)crl的保護(hù)作用，使得pda@crl-msnc對(duì)ph的適應(yīng)范圍更加廣泛，其在水溶液中最佳的催化ph范圍為6.0-8.0。

如圖3所示，經(jīng)過(guò)乙醇、甲醇與二甲基亞砜處理后，crl-msnc與pda@crl-msnc的相對(duì)活力分別能保持在68%、88%以上，而在相同的處理?xiàng)l件下，游離crl只能保持較少的活力（<10%）。

實(shí)施例2

一種鹽酸多巴胺快速交聯(lián)改性脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，室溫水相快速共沉淀制備表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑

1）表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml脫氧膽酸鈉水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液（papain）2ml，攪拌至溶液澄清，得混合液；

2）將混合液邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol四水合氯化錳水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

3）將脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可得到脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑（papain-msnc），其中，真空度為1.3~13pa，溫度為-85℃~-10℃。

步驟2，多巴胺自聚-交聯(lián)改性

取100mgpapain-msnc，超聲作用5min使其均勻分散在10ml10mm的tris-hcl（ph8.0）緩沖液中，添加20mg的鹽酸多巴胺，在室溫下以120rpm的轉(zhuǎn)速磁力攪拌交聯(lián)24h；

將papain-msnc水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水洗滌2次，洗去未反應(yīng)的多巴胺，真空冷凍干燥至恒重即得多巴胺交聯(lián)改性后“核殼”狀脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑（pda@papain-msnc），其中，真空度為1.3~13pa，溫度為-85℃~-10℃。

本實(shí)施例制備的papain-msnc和pda@papain-msnc在電鏡下的掃描電鏡圖如圖2所示，從圖中可以看出，papain-msnc是平均粒徑為50nm的球狀顆粒，pda@papain-msnc是部分解散的掃把狀，在水溶液經(jīng)過(guò)10次重復(fù)利用后，papain-msnc的相對(duì)酶活低于83%，而pda@papain-msnc的相對(duì)酶活仍能維持94%以上，且天然papain與pda@papain-msnc的最適ph均為5.0，pda@papain-msnc在水溶液中最佳的催化ph范圍為3.5-8.0。

實(shí)施例3

一種鹽酸多巴胺快速交聯(lián)改性甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，室溫水相快速共沉淀制備表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑

1）表面活性劑改性游離酶

配制0.1mmol/ml甘氨脫氧膽酸鈉水溶液10ml，室溫下，以120rpm速度邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液2ml，攪拌至溶液澄清，得混合液；

2）將混合液邊攪拌邊以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol四水合氯化錳水溶液，室溫下以120rpm的速度攪拌反應(yīng)30min后得甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液；

3）將甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水沖洗2次，洗去未吸附的游離酶，真空冷凍干燥至恒重即可得到甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑（papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺）。

步驟2，多巴胺自聚-交聯(lián)改性

取100mgpapain-msnc，超聲作用5min使其均勻分散在10ml10mm的tris-hcl（ph8.0）緩沖液中，添加20mg的鹽酸多巴胺，在室溫下以120rpm的轉(zhuǎn)速磁力攪拌交聯(lián)24h；

將papain-msnc水溶液用8000rpm的速度離心，并用去離子水洗滌2次，洗去未反應(yīng)的多巴胺，真空冷凍干燥至恒重即可得多巴胺交聯(lián)改性后“核殼”狀甘氨脫氧膽酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺納米復(fù)合催化劑（pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺）。

本實(shí)施例制備得到的papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺和pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺在電鏡下的掃描圖顯示，papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺是平均粒徑為80nm的球狀顆粒，pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺是部分解散的掃把狀，在水溶液經(jīng)過(guò)10次重復(fù)利用后，papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺的相對(duì)酶活低于76%，而pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺的相對(duì)酶活仍能維持90%以上，且天然papain與pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺的最適ph均為5.0，pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺在水溶液中最佳的催化ph范圍為4.0-8.0。

實(shí)施例4

用實(shí)施例1所得crl-msnc和pda@crl-msnc與天然crl在純有機(jī)相中催化合成維生素e琥珀酸酯的應(yīng)用，包括以下步驟：

第一步，取10ml的塑料管，依次加入0.2mmol的維生素e、1mmol的丁二酸酐、400μl的天然crl或者含有相等蛋白含量的crl-msnc與pda@crl-msnc、5ml的有機(jī)溶劑；

第二步，將步驟1中得到的混合物，密閉處理后于55°c水浴加熱，以120rpm的速率攪拌反應(yīng)；

第三步，反應(yīng)72h后，利用美國(guó)安捷倫高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定底物和產(chǎn)物的含量。

通過(guò)高效液相色譜系統(tǒng)的測(cè)定底物和產(chǎn)物的含量來(lái)計(jì)算催化合成維生素e琥珀酸酯轉(zhuǎn)化率，當(dāng)反應(yīng)溫度為55°c，攪拌速率為800rpm時(shí)，在相同的反應(yīng)條件下，crl-msnc與pda@crl-msnc催化合成維生素e琥珀酸酯轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到55%（圖6），是天然crl催化合成的4倍以上，驗(yàn)證了本發(fā)明制備的pda@crl-msnc在純有機(jī)相中擁有與crl-msnc同樣優(yōu)越的催化效率。

其中高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為c-18反相柱（250mm×4.6mm,5μm），流動(dòng)相為甲醇和乙酸溶液（體積比為50:0.3），流速為1.0ml/min，柱箱溫度控制在36°c，檢測(cè)器為二極管陣列及檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為285nm。

實(shí)施例5

用實(shí)施例1所得的crl-msnc和pda@crl-msnc，測(cè)定含有相等蛋白含量的crl-msnc與pda@crl-msnc在dmso中催化合成維生素e琥珀酸酯的重復(fù)利用率，包括以下步驟：

第一步，取10ml的塑料管，依次加入0.2mmol的維生素e、1mmol的丁二酸酐、含有相等蛋白含量的crl-msnc與pda@crl-msnc、5ml的有機(jī)溶劑；

第二步，將步驟1中得到的混合物，密閉處理后于55°c水浴加熱，以120rpm的速率攪拌反應(yīng)；

第三步，攪拌反應(yīng)4h后，將步驟2中反應(yīng)的混合物在10000rpm下離心10min，使用高效液相色譜系統(tǒng)測(cè)定上清液中底物和產(chǎn)物的含量；

第四步，將步驟3中離心得到的沉淀，用去離子水洗滌2次，用于下一批酶反應(yīng)，反復(fù)進(jìn)行10次催化來(lái)計(jì)算其的重復(fù)利用率。

結(jié)果如圖7所示，通過(guò)高效液相色譜系統(tǒng)的測(cè)定底物和產(chǎn)物的含量來(lái)計(jì)算催化合成維生素e琥珀酸酯轉(zhuǎn)化率，當(dāng)反應(yīng)溫度為55°c，攪拌速率為800rpm時(shí)，在相同的反應(yīng)條件下，經(jīng)過(guò)10次重復(fù)利用后，pda@crl-msnc的酶活只下降了55%，表明在這種反應(yīng)系統(tǒng)中pda@crl-msnc擁有著良好的重復(fù)利用性能。而與之相比，crl-msnc在反應(yīng)30min后就已經(jīng)被dmso完全溶解，造成crl-msnc只經(jīng)過(guò)一次反應(yīng)后其酶活就受到極大的降低。進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明制備的pda@crl-msnc在純有機(jī)相中擁有更優(yōu)越的催化效率。

通過(guò)實(shí)施例1-3可以看出，本發(fā)明采用多巴胺自聚-交聯(lián)，附著在表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑的表面，從而將表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑包埋起來(lái)，使得到的表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、重復(fù)利用率及耐受性，大大降低酶的使用成本，尤其適合在純有機(jī)相生物催化中的應(yīng)用。在水溶液中經(jīng)過(guò)10次重復(fù)利用后，pda@crl-msnc的相對(duì)酶活能維持在93%以上，pda@papain-msnc的相對(duì)酶活能維持在94%以上，pda@papain-甘氨脫氧膽酸-mn²⁺的相對(duì)酶活能維持在90%以上；通過(guò)實(shí)施例4-5可以看出，本發(fā)明利用多巴胺交聯(lián)改性后制備得到的“核殼”狀表面活性劑-酶納米復(fù)合催化劑在油水兩相生物催化中有更優(yōu)越的催化效率，尤其是在純有機(jī)相中有著廣泛的應(yīng)用前景。