本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程和基因遺傳修飾領(lǐng)域，具體地說，涉及基于crispr/cas9技術(shù)的pd-1基因修飾人源化動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其在生物醫(yī)藥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人源化動(dòng)物模型是指帶有人類功能性基因、細(xì)胞或組織的動(dòng)物模型。這種模型通常作為研究人類疾病的活體替代模型，在闡明發(fā)病機(jī)制、藥物篩選等方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用前景。研究人類復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制,篩選有效藥物,需要理想的動(dòng)物模型來進(jìn)行大量的體內(nèi)試驗(yàn).小鼠是應(yīng)用最為廣泛的生物模型之一，但考慮到小鼠與人類在生理、病理等諸多方面存在差異,構(gòu)建具有人類功能性基因、細(xì)胞或組織的人源化小鼠模型尤為重要。利用基因修飾的方法，將人類基因“放置”在大、小鼠染色體上所制備的人源化基因動(dòng)物模型，是進(jìn)行一些人類疾病研究的方法。腫瘤免疫療法是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域中最具前景的研究方向之一，《science》雜志將腫瘤免疫療法評(píng)為2013年十大科學(xué)突破第一位。目前，針對(duì)pd-1/pd-l1通路抑制劑的研究受到了特別的關(guān)注。pd-1(programmeddeath-1)主要表達(dá)于t細(xì)胞及初級(jí)b細(xì)胞表面，pd-1的兩個(gè)配體(pd-l1和pd-l2)，廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(apcs)等。pd-1與其受體的相互作用，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。在許多人類腫瘤組織中均可檢測(cè)到pd-l1蛋白的表達(dá)，腫瘤部位的微環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的pd-l1的表達(dá)，表達(dá)的pd-l1有利于腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)抗腫瘤t細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。抑制pd-1與其配體的結(jié)合，可以使腫瘤細(xì)胞暴露于免疫系統(tǒng)的殺傷視野，進(jìn)而達(dá)到殺傷腫瘤組織及治療癌癥的作用。目前有國(guó)內(nèi)外很多大公司開始正在加緊開發(fā)抗pd-1藥物。最熟悉的全球制藥巨頭當(dāng)屬bms和默沙東，兩家公司的opdivo和keytruda均已拿下黑色素瘤和肺癌適應(yīng)癥。2015年11月，fda批準(zhǔn)opdivo用于晚期腎細(xì)胞癌，opdivo頭頸癌關(guān)鍵iii期臨床已成功完成。在2016年1月舉辦ascogi2016上公布的結(jié)果顯示，這兩款藥在管癌、胃癌顯示積極療效。在我國(guó)，2015年底，君實(shí)生物成為首家pd-1單抗獲批臨床的企業(yè)；2016年1月，百濟(jì)神州的pd-1單抗bgb-a317通過fda的新藥研究申請(qǐng)審評(píng)，獲準(zhǔn)在美國(guó)開展臨床試驗(yàn)；2月19日，恒瑞醫(yī)藥開發(fā)的注射用shr-1210(pd-1單克隆抗體)獲得藥物臨床試驗(yàn)批件，主要適應(yīng)癥為實(shí)體瘤；2月22日，沃森生物發(fā)布公告稱，其子公司嘉和生物研發(fā)的抗pd-1單抗(杰諾單抗注射液)產(chǎn)品臨床研究申請(qǐng)獲得受理，主要的潛在適應(yīng)癥包括各種血癌及黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等多種實(shí)體瘤。截止2016年3月，國(guó)內(nèi)已有兩家pd-1單抗藥物獲得了臨床試驗(yàn)批件，另有兩家正在受理中。藥廠之間激烈的競(jìng)爭(zhēng)表明了對(duì)該類藥物高度認(rèn)同，pd-1抑制劑可能成為醫(yī)藥史上一個(gè)重要的里程碑。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(nci)將pd-1列為140種癌癥免疫治療途徑和分子中的第二最有前景的潛在靶點(diǎn)。由于免疫療法有較明顯的免疫毒性，如皮炎、大腸炎、垂體炎等，這種副作用與免疫應(yīng)答程度直接相關(guān)，很難通過劑量調(diào)整避免。pd-1單抗nivolumab、mk-3475都報(bào)道了肺炎這一嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此嚴(yán)格的藥物篩選程序非常重要。但由于人類生理與動(dòng)物生理有顯著的差別，利用動(dòng)物模型得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有時(shí)不能適用到人體上，而人源化動(dòng)物模型則能很好地“復(fù)制”人類某些功能，這種模型通常被用做人類疾病體內(nèi)研究的活體替代模型。人源化動(dòng)物模型的應(yīng)用很廣泛，比如在腫瘤、艾滋病、傳染病、人類退化性疾病、血液病研究領(lǐng)域等都有很強(qiáng)的適用性。目前已有一些pd-1基因相關(guān)的動(dòng)物模型，如nihimura等人早在2001年已經(jīng)制備了pd-1敲除的balb/c小鼠，這些模型主要用于研究pd-1基因的功能(基因型、功能、調(diào)控)及相關(guān)疾病機(jī)制研究。鑒于pd-1基因在腫瘤和免疫治療領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用價(jià)值，為了使臨床前期的藥效試驗(yàn)更有效并提高研發(fā)成功率，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種pd-1基因修飾人源化非人哺乳動(dòng)物模型。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該pd-1基因修飾人源化非人哺乳動(dòng)物的制備方法。本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出該模型的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為：本發(fā)明提供一種制備pd-1基因修飾人源化動(dòng)物模型的方法，所述方法包括：1)構(gòu)建打靶載體：從基因組dna經(jīng)pcr方法擴(kuò)增獲得同源臂，與待引入的hpd-1片段連接至打靶載體；2)構(gòu)建sgrna：根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)并選擇sgrna，將sgrna連接至載體質(zhì)粒并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；3)將打靶載體，轉(zhuǎn)錄的sgrna轉(zhuǎn)入到胚胎細(xì)胞，移植至假孕動(dòng)物體內(nèi)；4)對(duì)得到的嵌合體動(dòng)物進(jìn)行基因型鑒定，篩選基因成功敲進(jìn)的陽性動(dòng)物；進(jìn)一步與野生型動(dòng)物交配，獲得f1代雜合子；f1代雜合子之間交配后獲得純合子?；谏鲜黾夹g(shù)方案，本發(fā)明提供一種pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型，所述動(dòng)物為非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物，其基因組中含有人pd-1基因片段，能正常表達(dá)pd-1功能蛋白，且表達(dá)的蛋白含有人pd-1蛋白的功能域。所述的pd-1基因修飾是針對(duì)pd-1基因第二外顯子進(jìn)行的基因修飾。進(jìn)一步地，所述非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物為嚙齒類動(dòng)物。更進(jìn)一步，所述嚙齒類動(dòng)物為小鼠。優(yōu)選地，所述小鼠的品系為c57bl/6。本發(fā)明提供的pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型，其pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段進(jìn)行替代，保留包括跨膜區(qū)在內(nèi)的其他小鼠pd-1區(qū)域；所述人dna片段如seqidno：21所示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供的pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型，其pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段進(jìn)行替代，保留第二外顯子左右邊緣14/13bp和包括跨膜區(qū)在內(nèi)的其他小鼠pd-1區(qū)域；所述人dna片段如seqidno：21所示。優(yōu)選的，所述動(dòng)物模型由上述方法制備而成。本發(fā)明提供一種人源化小鼠pd-1基因的dna序列，dna序列編碼的蛋白含有人pd-1蛋白的功能域。本發(fā)明提供一種人源化小鼠pd-1基因的dna序列，是小鼠pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段進(jìn)行替代，保留包括第二外顯子左右邊緣各14/13bp和跨膜區(qū)在內(nèi)的其他小鼠pd-1區(qū)域，所述人dna片段如seqidno：21所示或與該片段具有80％及以上同源性的dna片段，該人源化小鼠pd-1基因的dna序列含有seqidno：14所示的核苷酸序列或與該人源化小鼠pd-1基因的dna序列具有80％及以上同源性的dna片段。優(yōu)選的，用于擴(kuò)增該人源化小鼠pd-1基因的dna序列的上下游引物序列如seqidno:22-23所示。進(jìn)一步，所述的人源化小鼠pd-1基因的dna序列，其cds序列如seqidno:15所示或與seqidno:15具有80％及以上同源性的片段，其mrna序列如seqidno:16所示或與seqidno:16具有80％及以上同源性的片段，其編碼的蛋白序列如seqidno：17所示或其特異性氨基酸片段，且功能不變。本發(fā)明提供了一種上述人源化小鼠pd-1基因的dna序列在構(gòu)建pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型中的用途。優(yōu)選的，所述小鼠pd-1基因的第二外顯子的第11053-11385位核苷酸用人dna片段進(jìn)行替代，且保留包括跨膜區(qū)在內(nèi)的其他小鼠pd-1區(qū)域，所述人dna片段如seqidno：21所示，該人源化小鼠pd-1基因的dna序列含有seqidno：14所示的核苷酸序列。進(jìn)一步地，在本發(fā)明具體實(shí)施例中，是在小鼠pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段進(jìn)行替代，左右邊緣各保留14/13bp。進(jìn)一步地，所述用途是將含有人源化小鼠pd-1基因的dna序列的表達(dá)載體與cas9mrna，小鼠pd-1基因第二外顯子的sgrna質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物注射至小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，移植入受體母鼠生產(chǎn)pd-1基因修飾人源化小鼠模型。本發(fā)明還提供一種特異性靶向小鼠pd-1基因第二外顯子的sgrna，其靶位點(diǎn)序列如seqidno:3或seqidno:8所示。優(yōu)選的，合成序列如seqidno:3所示靶位點(diǎn)的上下游單鏈序列分別如seqidno:9-10所示；合成序列如seqidno:8所示靶位點(diǎn)的上下游單鏈序列分別如seqidno:11-12所示。本發(fā)明還提供一種含有上述sgrna的dna序列的crispr/cas9打靶載體。本發(fā)明還提供了上述sgrna或上述crispr/cas9打靶載體在制備pd-1基因修飾動(dòng)物模型中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，提供一種制備pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型的方法，包括以下步驟：(1)將本發(fā)明上述的人源化小鼠pd-1基因的dna序列、3’同源臂和5’同源臂連接至質(zhì)粒上，構(gòu)建人源化小鼠pd-1基因第二外顯子的同源重組表達(dá)載體；所述5’同源臂如seqidno:18所示，所述3’同源臂如seqidno:24所示；(2)構(gòu)建小鼠pd-1基因第二外顯子的sgrna的質(zhì)粒；(3)將步驟(2)的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與步驟(1)的表達(dá)載體以及和cas9mrna注射至小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，移植入受體母鼠生產(chǎn)pd-1基因修飾人源化小鼠模型。優(yōu)選的，步驟(1)中，是以野生型c57bl/6小鼠基因組dna為模板pcr擴(kuò)增5’同源臂片段和3’同源臂片段，擴(kuò)增的引物對(duì)序列分別如seqidno:19-20和seqidno:25-26所示；所述質(zhì)粒為pv-4g。優(yōu)選的，步驟(2)小鼠pd-1基因第二外顯子的sgrna的質(zhì)粒是將上述sgrna連接至pt7-sgrna質(zhì)粒獲得。本發(fā)明還提供一種上述方法制備得到的pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型。本發(fā)明還聽過一種上述pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型在制備雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種制備雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型的方法，所述雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型由上述任一pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型制備而成。優(yōu)選的，利用上述攜帶有人源化修飾pd-1基因的動(dòng)物模型通過交配或進(jìn)一步的基因編輯方法制備獲得的雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型。本發(fā)明還提供一種雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型，所述雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型由上述制備雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型的方法制備而成。本發(fā)明還提供一種分離的細(xì)胞或組織，所述細(xì)胞或組織分離自上述任一pd-1基因修飾人源化的動(dòng)物模型或者上述任一的雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型。優(yōu)選的，所述組織是脾臟，所述細(xì)胞是脾細(xì)胞。本發(fā)明還提供上述任一動(dòng)物模型、或上述的人源化小鼠pd-1基因的dna序列、或上述針對(duì)小鼠pd-1基因第二外顯子的sgrna、或其crispr/cas9打靶載體、或上述分離的細(xì)胞或組織在pd-1調(diào)節(jié)劑、pd-l1調(diào)節(jié)劑或藥物研發(fā)中的應(yīng)用或在pd-1、pd-l1信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理研究中的應(yīng)用或在腫瘤學(xué)研究方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種細(xì)胞或組織，所述細(xì)胞或組織是pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織。優(yōu)選的，所述細(xì)胞或組織為雙基因或多基因人源化的細(xì)胞或組織。本發(fā)明還提供上述動(dòng)物模型或者分離的細(xì)胞或組織與pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織聯(lián)合使用時(shí)在pd-1或pd-l1調(diào)節(jié)劑或藥物研發(fā)中的應(yīng)用、在pd-1或pd-l1信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)理研究中的應(yīng)用、以及在腫瘤學(xué)研究方面的應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織單獨(dú)使用或者與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織聯(lián)合使用時(shí)在評(píng)估靶向pd-1/pd-l1藥物有效性或者篩選靶向pd-1/pd-l1藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織單獨(dú)使用或者與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織聯(lián)合使用時(shí)在評(píng)估靶向pd-1/pd-l1藥物和其他藥物聯(lián)用的有效性或者篩選靶向pd-1/pd-l1藥物和其他藥物聯(lián)用的組合藥物的應(yīng)用。優(yōu)選的，上述應(yīng)用中，所述靶向pd-1/pd-l1藥物為治療腫瘤的藥物。優(yōu)選的，所述的藥物為單抗、雙抗或多抗以及其它大分子、小分子藥物。本發(fā)明還提供上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織單獨(dú)使用或者與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織聯(lián)合使用時(shí)在篩選用于人pd-1/pd-l1信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種評(píng)估靶向pd-1/pd-l1藥物有效性的方法，單獨(dú)利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織或者聯(lián)合利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明還提供一種評(píng)估靶向pd-1/pd-l1藥物和其他藥物聯(lián)用的有效性的方法，單獨(dú)利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織或者聯(lián)合利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織對(duì)靶向pd-1/pd-l1藥物進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明還提供一種篩選靶向pd-1/pd-l1藥物的方法，單獨(dú)利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織或者聯(lián)合利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織對(duì)藥物進(jìn)行篩選。本發(fā)明還提供一種篩選靶向pd-1/pd-l1藥物和其他藥物聯(lián)用的組合藥物的方法，單獨(dú)利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織或者聯(lián)合利用上述動(dòng)物模型或者上述分離的細(xì)胞或組織與上述pd-l1基因人源化的細(xì)胞或組織對(duì)所述組合藥物進(jìn)行篩選。優(yōu)選的，上述方法中，所述靶向pd-1/pd-l1藥物為治療腫瘤的藥物。優(yōu)選的，所述的藥物為單抗、雙抗或多抗，以及其它生物或化學(xué)類藥物。本發(fā)明還涉及來自基因修飾動(dòng)物的精子、卵細(xì)胞、受精卵、胚胎、子代、細(xì)胞或組織，及上述生物材料在pd-1/pd-l1信號(hào)機(jī)理研究及在pd-1/pd-l1調(diào)節(jié)劑藥物毒理研究和pd-1/pd-l1調(diào)節(jié)劑的篩選開發(fā)等臨床前實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種攜帶有人源化修飾pd-1基因的小鼠，其基因組中含有人pd-1基因片段，能正常表達(dá)pd-1功能蛋白，且表達(dá)的蛋白含有人pd-1蛋白的功能域。進(jìn)一步地，上述攜帶有人源化修飾pd-1基因的小鼠，其pd-1基因的第二外顯子的第11053-11385位核苷酸用人pd-1基因的dna片段進(jìn)行替代，左右邊緣各保留14/13bp，且保留包括跨膜區(qū)在內(nèi)的其它小鼠pd-1區(qū)域；所述人dna片段如seqidno：21所示。本發(fā)明提供了上述動(dòng)物模型或攜帶有人源化修飾pd-1基因的小鼠在制備雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型的應(yīng)用。利用上述動(dòng)物模型或攜帶有人源化修飾pd-1基因的小鼠通過交配或進(jìn)一步的基因編輯方法制備獲得的雙基因或多基因人源化動(dòng)物模型也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。進(jìn)一步地，上述動(dòng)物模型或由其制得的雙基因或者多基因人源化動(dòng)物模型在藥物研發(fā)中的應(yīng)用或在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述的藥物為單抗、雙抗或多抗，以及其它生物或化學(xué)類藥物。本發(fā)明的特點(diǎn)在于：1)本發(fā)明的動(dòng)物模型，是通過dna序列同源重組的方式，其pd-1基因的第2外顯子部分地被人為替換成人源pd-1基因第2外顯子。2)本發(fā)明的動(dòng)物模型能在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)含有人pd-1蛋白功能域的pd-1蛋白。采用本方法能最大程度減少人源化可能造成的因基因剪切、編輯造成的影響；保留包括跨膜區(qū)在內(nèi)的其它小鼠pd-1基因功能區(qū)域，避免基因人源化造成小鼠表達(dá)pd-1蛋白以及涉及pd-1蛋白生理功能的異常。附圖說明圖1：5’端靶位點(diǎn)sgrna(sgrna1-sgrna4)和3’端靶位點(diǎn)sgrna(sgrna5-sgrna8)活性檢測(cè)結(jié)果，其中con為陰性對(duì)照，pc為陽性對(duì)照，blank為空白對(duì)照。圖2：pt7-sgrna質(zhì)粒圖譜示意圖。圖3：tv-pd重組載體的酶切電泳結(jié)果，圖中1和2分別指2個(gè)tv-pd克隆。圖4：為首建鼠鼠尾pcr鑒定結(jié)果，其中，wt為野生型小鼠，nc為陰性對(duì)照，m為標(biāo)記，圖中1、2、3分別指代實(shí)施例9的三只f0小鼠的鼠尾pcr鑒定結(jié)果。圖5：為f1代小鼠pcr結(jié)果，其中wt為野生型，nc為陰性對(duì)照,m為標(biāo)記。圖6：為f1代小鼠southernblot結(jié)果，其中m為標(biāo)記,wt為野生型。圖7：為雜合小鼠細(xì)胞流式分析結(jié)果。圖8：流式分析結(jié)果，其中，取野生型c57bl/6小鼠和b-hpd-1純合子小鼠，分別用抗鼠cd3抗體刺激脾臟內(nèi)t細(xì)胞激活，再用抗鼠pd-1抗體mpd-1pe(圖a、b)和抗人pd-1抗體hcd47fitc(圖c、d)，進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析可見：與對(duì)照組(圖a、b)相比，可在b-hpd-1純合子小鼠脾臟內(nèi)，檢測(cè)到表達(dá)人pd-1蛋白的細(xì)胞；而在c57bl/6小鼠的脾臟內(nèi)，未檢測(cè)到表達(dá)人pd-1蛋白的細(xì)胞。圖9：rt-pcr檢測(cè)結(jié)果，其中，+/+為野生型c57bl/6小鼠，h/h為b-hpd-1純合子小鼠；gapdh為內(nèi)參對(duì)照。圖10：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用人pd-1抗體keytruda進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，g1溶劑對(duì)照組和g2keytruda治療組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無明顯差異。圖11：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用人pd-1抗體keytruda進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，g2治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤平均體積明顯小于g1對(duì)照組，且具有顯著差異。圖12：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用不同劑量的人pd-1抗體keytruda進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)，g1-g5各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無顯著差異。圖13：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用不同劑量的人pd-1抗體keytruda進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)，g2-g5治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤平均體積明顯小于g1對(duì)照組，且具有顯著差異。圖14：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1(pdl1基因人源化的mc38細(xì)胞)植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用人pd-l1抗體tecentriq進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無顯著差異。圖15：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用人pd-l1抗體tecentriq進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤平均體積明顯小于對(duì)照組，且具有明顯差異。圖16：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用不同劑量的人pd-l1抗體tecentriq進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)(3mg/kg和10mg/kg)，g1-g4各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無顯著差異。圖17：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用不同劑量的人pd-l1抗體tecentriq進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)(3mg/kg和10mg/kg)，g2-g4治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤平均體積明顯小于g1對(duì)照組，且具有明顯差異。圖18：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用cisplatin、keytruda和tecentriq中的1種或2種聯(lián)用進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，g1-g4各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無明顯差異。圖19：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用cisplatin、keytruda及2種藥物聯(lián)用進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，g2-g6各治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤平均體積明顯小于對(duì)照組，且cisplatin與keytruda聯(lián)用治療組(g4)的小鼠荷瘤體積明顯小于單獨(dú)使用cisplatin(g2)或keytruda(g3)治療組，表明聯(lián)合用藥的療效優(yōu)于cisplatin或keytruda單獨(dú)使用的療效。圖20：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，并利用cisplatin、tecentriq及2種藥物聯(lián)用進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤平均體積明顯小于對(duì)照組，且cisplatin與tecentriq聯(lián)用治療組(g6)的小鼠荷瘤體積明顯小于單獨(dú)使用cisplatin(g2)或tecentriq(g3)，表明聯(lián)合用藥的療效優(yōu)于cisplatin或keytruda單獨(dú)使用的療效。圖21：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，使用陽性對(duì)照藥tecentriq或兩種抗人pd-l1抗體pdl1-ab1、pdl1-ab2中的1種進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，g1-g4各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無顯著差異。圖22：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，使用陽性對(duì)照藥tecentriq或兩種抗人pd-l1抗體pdl1-ab1、pdl1-ab2中的1種進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，其中使用pdl1-ab1抗體治療(g3)與tecentriq治療組(g2)小鼠腫瘤體積大小差別不大，且g2、g3組與對(duì)照組(g1)的瘤體積相比均具有顯著的差異(p＜0.05)；而使用pdl1-ab2抗體治療(g4)的小鼠腫瘤體積明顯大于tecentriq治療組(g2)及pdl1-ab1抗體治療(g3)，表明在相同的給藥劑量和頻次下，抗人pdl1-ab1抗體與陽性對(duì)照品tecentriq藥效相似，在抑制腫瘤生長(zhǎng)上效果相當(dāng)，而抗人pdl1-ab2抗體藥效不如tecentriq或pdl1-ab1抗體。圖23：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，使用5種抗人pd-1抗體進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，g1-g6各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重增長(zhǎng)無明顯差異。圖24：將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38植入b-hpd-1小鼠體內(nèi)，使用5種抗人pd-1抗體進(jìn)行抗腫瘤藥效試驗(yàn)，所有g(shù)2-g6治療組小鼠與對(duì)照組相比，腫瘤體積呈現(xiàn)不同程度的縮小和/或消失，表明5種抗人pd-1單抗均具有良好的抑瘤作用。圖25：流式分析結(jié)果，其中，取c57bl/6小鼠和雙重人源化ctla-4/pd-1雜合子，分別用抗鼠cd3抗體刺激脾臟內(nèi)t細(xì)胞激活，再用鼠源ctla-4抗體mctla-4apc(圖a、b、c)或人源ctla-4抗體hctla-4pe(圖d、e、f)，或鼠源pd-1抗體mpd-1pe(圖g、h、i)或人源pd-1抗體hpd-1fitc(圖j、k、l)，和鼠源t細(xì)胞表面抗體mtcrβ對(duì)t細(xì)胞胞外蛋白同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，可在雙重人源化ctla-4/pd-1雜合子的雜合鼠脾臟內(nèi)，表達(dá)人ctla-4和pd-1蛋白的細(xì)胞；而在c57bl/6對(duì)照鼠的脾臟內(nèi)未檢測(cè)到表達(dá)人ctla-4或pd-1蛋白的細(xì)胞。具體實(shí)施方式本申請(qǐng)實(shí)施例所用的生化試劑為：ecori，ecorv，hindiii，kpni,bglii酶購(gòu)自neb，貨號(hào)分別為r3101m，r3195m，r3104m，r3142m,r0144m；xtramaxiplusef購(gòu)自macherey-nagel，貨號(hào)為740426；卡那霉素購(gòu)自amresco,貨號(hào)為0408；ambion體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ambion，貨號(hào)am1354；aio試劑盒,uca試劑盒來源百奧賽圖公司，貨號(hào)分別為bcg-dx-004，貨號(hào)bcg-dx-001；cas9mrna來源sigma，貨號(hào)cas9mrna-1ea；小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38購(gòu)自上海酶研生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自tiangen公司，貨號(hào)為cb104－02；anti-mousepd-1來源biolegend，貨號(hào)為135210；cisplatin來源hospiraaustraliaptyltd.；鼠cd3抗體來源bd，貨號(hào)為563123；mpd-1_pe來源biolegend，貨號(hào)為109104；hpd-1fitc來源biolegend，貨號(hào)為329904；mtcrβpercp來源biolegend，貨號(hào)為109228；mctla-4apc來源biolegend，貨號(hào)為106310；hctla-4pe來源biolegend，貨號(hào)為349906。實(shí)施例1pd-1基因sgrna的設(shè)計(jì)靶序列決定了sgrna的靶向特異性和誘導(dǎo)cas9切割目的基因的效率。因此，高效特異的靶序列選擇和設(shè)計(jì)是構(gòu)建sgrna表達(dá)載體的前提。設(shè)計(jì)并合成識(shí)別5’端靶位點(diǎn)(sgrna1-sgrna4)、3’端靶位點(diǎn)(sgrna5-sgrna8)的向?qū)na序列。以小鼠為例，根據(jù)pd-1基因的功能和序列特征，5’端靶位點(diǎn)和3’端靶位點(diǎn)均位于小鼠pd-1基因的第二外顯子上，各sgrna在pd-1上的靶位點(diǎn)序列如下：sgrna-1靶位點(diǎn)序列(seqidno：1)：5’-agggacctccagggcccattggg-3’sgrna-2靶位點(diǎn)序列(seqidno：2)：5’-cagaggtccccaatgggccctgg-3’sgrna-3靶位點(diǎn)序列(seqidno：3)：5’-gtagaaggtgagggacctccagg-3’sgrna-4靶位點(diǎn)序列(seqidno：4)：5’-ccctcaccttctacccagcctgg-3’sgrna-5靶位點(diǎn)序列(seqidno：5)：5’-gcaccccaaggcaaaaatcgagg-3’sgrna-6靶位點(diǎn)序列(seqidno：6)：5’-ggagcagagctcgtggtaacagg-3’sgrna-7靶位點(diǎn)序列(seqidno：7)：5’-gttaccacgagctctgctccagg-3’sgrna-8靶位點(diǎn)序列(seqidno：8)：5’-gcaaaaatcgaggagagccctgg-3’實(shí)施例2sgrna的篩選利用uca試劑盒檢測(cè)實(shí)施例1篩選得到的多個(gè)向?qū)grna的活性，從結(jié)果可見向?qū)grna具有不同活性，檢測(cè)結(jié)果參見圖1。從中優(yōu)先選擇2個(gè)，分別是sgrna3和sgrna8，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。合成sgrna的上下游單鏈，見表1：表1sgrna3和sgrna8序列列表實(shí)施例3pt7-sgrna質(zhì)粒構(gòu)建pt7-sgrna質(zhì)粒來源：pt7-sgrna載體圖譜，參見圖2。該質(zhì)粒骨架來源takara，貨號(hào)3299。由質(zhì)粒合成公司合成含有t7啟動(dòng)子(taatacgactcactatagg)及sgrnascaffold的片段dna(見seqidno：13)并通過酶切(ecori及bamhi)連接至骨架載體上，經(jīng)專業(yè)測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明獲得了目的質(zhì)粒。實(shí)施例4pt7-pd-3和pt7-pd-8重組表達(dá)載體的構(gòu)建將表1中列出的sgrna3和sgrna8的上游單鏈5’端加上tagg，下游單鏈5’端加上aaac，上下游單鏈退火后分別連接至pt7-sgrna質(zhì)粒(質(zhì)粒先用bbsi線性化)，獲得表達(dá)載體pt7-pd-3和pt7-pd-8，連接反應(yīng)體系見表2：表2連接反應(yīng)體系sgrna退火產(chǎn)物1μl(0.5μm)pt7-sgrna載體1μl(10ng)t4dnaligase1μl(5u)10×t4dnaligasebuffer1μl50％peg40001μlh2o補(bǔ)至10μl反應(yīng)條件為：室溫連接10-30min，轉(zhuǎn)化至30μltop10感受態(tài)細(xì)胞中，然后取200μl涂布于kan抗性的平板，37℃培養(yǎng)至少12小時(shí)后挑選2個(gè)克隆接種含有kan抗性的lb培養(yǎng)基(5ml)中，37℃，250rpm搖培至少12小時(shí)。隨機(jī)挑選克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，選擇連接正確的表達(dá)載體pt7-pd-3和pt7-pd-8進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例5序列設(shè)計(jì)將小鼠pd-1基因(geneid:18566)第二外顯子的第11053-11385位核苷酸用人dna片段(seqidno:21)進(jìn)行替代，最終得到改造后的人源化小鼠pd-1基因的dna序列(嵌合pd-1基因dna)如seqidno:14所示，seqidno:14僅列出涉及改造部分的dna序列，其中219-551bp區(qū)域?yàn)槿嗽雌?。按照上述操作，將小鼠pd-1基因上的第二外顯子上用人dna片段進(jìn)行替代，最終獲得人源化小鼠，具體的：人源化小鼠pd-1基因的cds序列和mrna序列分別如seqidno：15和seqidno：16所示；seqidno：15(869bp)，其中第91-423位為人源片段，seqidno：16(1972bp)，其中第154-486位為人源片段：人鼠嵌合pd-1蛋白序列如seqidno：17所示，其中第31-141氨基酸區(qū)域?yàn)槿嗽雌?。?shí)施例6載體構(gòu)建根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方案，設(shè)計(jì)3段同源重組片段的上游引物和與其匹配的下游引物以及相關(guān)序列。具體為：以野生型c57bl/6小鼠基因組dna為模板pcr擴(kuò)增獲得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；以人基因組dna為模板pcr擴(kuò)增獲得人dna片段。5’端同源臂(1770bp)：ncbi登錄號(hào)為nc_000067.6的第94041502-94043271位核苷酸(seqidno:18),上游引物(seqidno:19)；下游引物(seqidno:20)。人源dna片段(333bp)：ncbi登錄號(hào)為nc_000002.12的第241852634-241852966位核苷酸(seqidno:21)：上游引物(seqidno:22)，下游引物(seqidno:23)。3’同源臂(1733bp)：ncbi登錄號(hào)為nc_000067.6的第94039436-94041168位核苷酸(seqidno:24)；上游引物(seqidno:25)，下游引物(seqidno:26)。通過aio試劑盒將5’端同源臂片段、3’端同源臂片段和人源dna片段連接至試劑盒配備的tv-4g質(zhì)粒上，最終獲得載體tv-pd。實(shí)施例7載體驗(yàn)證隨機(jī)挑選實(shí)施例6的2個(gè)tv-pd克隆，使用2組限制性內(nèi)切酶對(duì)克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證，其中，ecori+ecorv應(yīng)出現(xiàn)1812bp+5527bp，hindiii+kpni應(yīng)出現(xiàn)270bp+574bp+1091bp+5704bp。酶切結(jié)果參見圖3，質(zhì)粒1、2的酶切結(jié)果均符合預(yù)期，表明這2個(gè)編號(hào)的質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確結(jié)果。其中編號(hào)2的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證正確。實(shí)施例8顯微注射及胚胎移植取c57bl/6小鼠的受精卵，利用顯微注射儀將預(yù)混好的實(shí)施例4制得的pt7-pd-3、pt7-pd-8質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(使用ambion體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄)和cas9mrna，tv-pd質(zhì)粒注射至小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。按照《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)》中的方法進(jìn)行胚胎的顯微注射，注射后的受精卵轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中短暫培養(yǎng)，然后移植至受體母鼠的輸卵管，生產(chǎn)基因改造人源化小鼠，得到c57bl/6背景的首建鼠(即founder鼠，為f0代)。將獲得的小鼠通過雜交和自交，擴(kuò)大種群數(shù)量，建立穩(wěn)定的小鼠品系。應(yīng)用本方法得到的免疫節(jié)點(diǎn)人源化小鼠命名為b-hpd-1。實(shí)施例9基因改造人源化小鼠的鑒定1、f0代基因型鑒定分別使用兩對(duì)引物對(duì)實(shí)施例8得到的f0代b-hpd-1小鼠的鼠尾基因組dna進(jìn)行pcr分析，引物位置l-gt-f位于5’同源臂左側(cè)，r-gt-r位于3’同源臂右側(cè)，r-gt-f和l-gt-r均位于2號(hào)外顯子上，5’端上游引物：l-gt-f(seqidno:27)，下游引物：l-gt-r(seqidno:28)。3’端上游引物：r-gt-f(seqidno:29)，下游引物：r-gt-r(seqidno:30)。pcr反應(yīng)體系(20μl)如表3所示：表310×緩沖液2μldntp(2mm)2μlmgso4(25mm)0.8μl上游引物(10μm)0.6μl下游引物(10μm)0.6μl鼠尾基因組dna200ngkod-plus-(1u/μl)0.6μlpcr擴(kuò)增反應(yīng)條件如表4所示：表4如果重組載體插入位置正確，則應(yīng)只有1條pcr條帶，5’端引物產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為1956bp，3’端引物產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)為2245bp。在獲得的24只f0代小鼠中共有3只經(jīng)鑒定為陽性小鼠。3只小鼠的pcr鑒定結(jié)果見圖4。2、f1代基因型鑒定將f0鑒定為陽性的小鼠與野生型小鼠交配得到f1代小鼠。對(duì)f1代鼠尾基因組dna進(jìn)行pcr分析。pcr體系、反應(yīng)條件及引物同f0代基因型鑒定。f1代小鼠pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，顯示有6只f1代小鼠為陽性小鼠，具體編號(hào)為：f1-1、f1-2、f1-3、f1-5、f1-7、f1-8。進(jìn)一步的，應(yīng)用southernblot方法對(duì)pcr確認(rèn)為陽性的6只小鼠(f1-1，f1-2，f1-3，f1-5，f1-7，f1-8)進(jìn)行確認(rèn)是否存在隨機(jī)插入。剪取鼠尾提取基因組dna，選用kpni、bglii酶分別消化基因組，轉(zhuǎn)膜，雜交。探針p1、p2分別位于3’同源臂外側(cè)及人源化片段上。探針合成引物分別為：p1-f(seqidno:31)，p1-r(seqidno:32)；p2-f(seqidno:33)，p2-r(seqidno:34)。制備成功的基因工程小鼠經(jīng)探針雜交分別產(chǎn)生2.7kb或3.7kb大小的條帶，而野生型的c56bl/6小鼠基因組只有7.3kb或3.7kb的條帶，不會(huì)有雜交條帶產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雜交條帶大小均與預(yù)期相符，證實(shí)有4只小鼠為陽性雜合小鼠且不存在隨機(jī)插入，編號(hào)分別為f1-1，f1-2，f1-3，f1-5；編號(hào)為f1-7和f1-8的2只小鼠通過southernblot顯示存在隨機(jī)插入。southernblot檢測(cè)結(jié)果見圖6。這表明使用本發(fā)明方法能構(gòu)建出可穩(wěn)定傳代，且無隨機(jī)插入的b-hpd-1人源化基因工程小鼠。3、人源化小鼠的表達(dá)情況分析取實(shí)施例8得到的f1代小鼠，取其t淋巴細(xì)胞(cd3+)，分別用anti-mousepd-1和anti-humanpd-1抗體進(jìn)行流式分析。從流式分析結(jié)果(見圖7)看，anti-humanpd-1與anti-mousecd3兩個(gè)抗體染色得到的雙陽性細(xì)胞比例在92％，表明本方法制備得到的pd-1基因修飾人源化小鼠可以表達(dá)人pd-1蛋白。進(jìn)一步的，將實(shí)施例8得到的f1代小鼠互相交配，得到f2代pd-1基因人源化純合子。選取1只pd-1基因人源化純合子小鼠(8周齡)，另取1只野生型c57bl/6小鼠作為對(duì)照，給小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗體，24h后脫頸安樂死后取脾臟，研磨后過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)，將過濾好的細(xì)胞懸液離心棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反應(yīng)，離心棄上清后用pbs清洗細(xì)胞1次，分別進(jìn)行facs檢測(cè)和rt-pcr檢測(cè)。facs檢測(cè)：用鼠源pd-1抗體mpd-1pe和鼠源t細(xì)胞表面抗體mtcrβ及人源pd-1抗體hpd-1fitc和鼠源t細(xì)胞表面抗體mtcrβ對(duì)t細(xì)胞胞外蛋白同時(shí)進(jìn)行染色，用pbs清洗細(xì)胞后，進(jìn)行流式檢測(cè)蛋白表達(dá)。流式分析結(jié)果(如圖8)顯示，與未經(jīng)刺激和經(jīng)過鼠cd3抗體刺激脾臟中t細(xì)胞激活后的c57bl/6小鼠相比，人源pd-1抗體可以檢測(cè)到人源化小鼠脾臟內(nèi)表達(dá)人pd-1蛋白的細(xì)胞；而在c57bl/6對(duì)照鼠的脾臟內(nèi)未檢測(cè)到表達(dá)人pd-1蛋白的細(xì)胞。rt-pcr檢測(cè)：提取野生型c57bl/6小鼠和b-hpd-1純合子小鼠脾臟細(xì)胞總rna，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cdna，利用引物：mpd-1rt-pcrf3：(seqidno:35)，和mpd-1rt-pcrr3：(seqidno:36)擴(kuò)增大小為297bp的鼠pd-1片段；利用引物hpd-1rt-pcrf3(seqidno:37)，和hpd-1rt-pcrr3(seqidno:38)擴(kuò)增大小為297bp的人pd-1片段。pcr反應(yīng)體系20μl，反應(yīng)條件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35個(gè)循環(huán))；72℃，10min；4℃保溫。使用gapdh作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖9)，野生型c57bl/6小鼠活化細(xì)胞中可檢測(cè)到鼠pd-1的mrna表達(dá)，b-hpd-1純合子小鼠活化細(xì)胞中可檢測(cè)到人pd-1的mrna表達(dá)。實(shí)施例10b-hpd-1基因人源化動(dòng)物模型體內(nèi)藥效驗(yàn)證本實(shí)施例選擇已經(jīng)被廣泛驗(yàn)證的2種針對(duì)人pd-1/pd-l1信號(hào)通路的已上市藥品進(jìn)行人源化動(dòng)物模型的體內(nèi)藥效驗(yàn)證，分別是默沙東(merck&co)的keytruda(pembrolizumab，人源化單克隆抗體)和羅氏旗下基因泰克(genentech)的tecentriq(atezolizumab，全人源化單克隆抗體)。取b-hpd-1純合小鼠(4-6周)，皮下接種小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38或mc38-hpdl1(即pd-l1基因人源化mc38細(xì)胞)，待腫瘤體積約100mm3后隨機(jī)分為對(duì)照組或治療組。治療組隨機(jī)選擇上述2種抗體中的1種以及不同的給藥劑量(0.3-25mg/kg)，對(duì)照組注射等體積的空白溶劑。每周測(cè)量腫瘤體積2次并稱量小鼠的體重，接種后單只小鼠腫瘤體積達(dá)到3000mm3時(shí)執(zhí)行安樂死結(jié)束試驗(yàn)。具體的實(shí)驗(yàn)方案如下：實(shí)驗(yàn)1keytruda抗體藥效預(yù)實(shí)驗(yàn)(n＝6/組)：小鼠皮下接種mc38細(xì)胞(5×105/100μlpbs)后，治療組腹腔注射25mg/kg的抗人pd-1抗體keytruda，對(duì)照組注射相同體積的空白溶劑；給藥頻率為每3天給藥1次，共給藥6次；實(shí)驗(yàn)2keytruda抗體不同劑量藥效實(shí)驗(yàn)：小鼠皮下接種mc38細(xì)胞(5×105/100μlpbs)，治療組(n＝6/組)腹腔注射不同劑量的抗人pd-1抗體keytruda(0.3-10mg/kg)，對(duì)照組(n＝10/組)注射相同體積的空白溶劑；給藥頻率為每3天給藥1次，共給藥6次；實(shí)驗(yàn)3tecentriq抗體藥效預(yù)實(shí)驗(yàn)(n＝7/組)：皮下接種mc38-pdl1(5×105/100μlpbs)，治療組腹腔注射3mg/kg的抗人pd-l1抗體tecentriq，對(duì)照組注射相同體積的空白溶劑；給藥頻率為每周給藥3次，共給藥2周；實(shí)驗(yàn)4tecentriq抗體不同劑量藥效實(shí)驗(yàn)(n＝5/組)：皮下接種mc38-pdl1(2×105/100μlpbs)，治療組腹腔注射1-10mg/kg的抗人pd-l1抗體tecentriq，對(duì)照組注射相同體積的空白溶劑；給藥頻率為每2天給藥1次，共給藥8次；表5、6、7、8中列出了各個(gè)實(shí)驗(yàn)的主要數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，具體包括分組時(shí)和分組后10-25天時(shí)的腫瘤體積、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤體積、小鼠存活情況、無腫瘤小鼠(tumorfree)的情況、腫瘤(體積)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治療組與對(duì)照組的小鼠體重、腫瘤體積之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值)。整體來看，各組實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物健康狀態(tài)良好。在各實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，各組動(dòng)物體重均出現(xiàn)增長(zhǎng)。所有實(shí)驗(yàn)治療組和對(duì)照組小鼠體重(圖10、12、14、16)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均無明顯區(qū)別，但從量瘤結(jié)果上看(圖11、13、15、17)，所有對(duì)照組小鼠腫瘤在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均持續(xù)生長(zhǎng)，而所有治療組小鼠與其對(duì)照組相比，腫瘤體積均出現(xiàn)不同程度的縮小和/或消失，可見在使用2種針對(duì)人pd-1/pd-l1信號(hào)通路的已上市藥品中任何一種治療后，明顯的抑制了小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。具體對(duì)每項(xiàng)試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估分析。實(shí)驗(yàn)1(見表5)中對(duì)照組和治療組的所有小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(第26天)時(shí)均存活且體重增長(zhǎng)良好，治療組與對(duì)照組相比，動(dòng)物體重?zé)o明顯差異，表明動(dòng)物對(duì)keytruda耐受良好。對(duì)照組所有小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，而在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，治療組6只小鼠中有2只小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)腫瘤消失。對(duì)照組平均腫瘤體積為3168±606mm3，而治療組平均腫瘤體積為111±77mm3，所有治療組小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，且與對(duì)照組的腫瘤體積相比具有顯著差異(p＜0.05)，tgitv為102％。由此證明按照所述的給藥方式，抗人pd-1抗體keytruda在b-hpd-1小鼠體內(nèi)對(duì)腫瘤具有明顯的抑制作用(tgitv＞60％)，具有較好的治療和抑制腫瘤生長(zhǎng)能力，且未對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生明顯毒性作用，安全性較好。表5實(shí)驗(yàn)2(見表6)中對(duì)照組和治療組的所有小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(第32天，為分組后第24天)時(shí)均存活且體重增長(zhǎng)良好，治療組與對(duì)照組相比，動(dòng)物體重?zé)o顯著性差異(p＞0.05)，表明動(dòng)物對(duì)keytruda耐受良好。與實(shí)驗(yàn)1類似，對(duì)照組所有小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，而所有治療組24只小鼠中，有7只小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)腫瘤消失。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組平均腫瘤體積為1589±652mm3，治療組在10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg劑量水平下的平均腫瘤體積分別為223±270mm3、277±397mm3、201±186mm3、437±515mm3，所有治療組小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，且與對(duì)照組的腫瘤體積相比均具有顯著差異(p＜0.05)。整體上看給藥3周后得到最佳的治療效果，停藥后低劑量的治療組出現(xiàn)明顯的腫瘤生長(zhǎng)。tgitv分別為92.4％、89.0％、94.0％、78.2％，表明不同劑量的抗人pd-1抗體keytruda對(duì)腫瘤具有明顯的抑制作用(tgitv＞60％)且在b-hpd-1小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出不同療效。表6實(shí)驗(yàn)3(見表7)中對(duì)照組和治療組的所有小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(第20天)時(shí)均存活且體重增長(zhǎng)良好，治療組與對(duì)照組相比，動(dòng)物體重?zé)o顯著性差異(p＞0.05)，表明動(dòng)物對(duì)tecentriq耐受良好。對(duì)照組所有小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，但在該劑量下治療組并未出現(xiàn)治愈小鼠(即未出現(xiàn)腫瘤消失小鼠)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組平均腫瘤體積為824±315mm3，治療組平均腫瘤體積為237±89mm3，所有治療組小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，tgitv為79.7％。由此證明按照所述的給藥方式，抗人pd-l1抗體tecentriq在b-hpd-1小鼠體內(nèi)對(duì)腫瘤具有明顯的抑制作用(tgitv＞60％)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)能力，且未對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生明顯毒性作用，安全性較好。表7實(shí)驗(yàn)4(見表8)中對(duì)照組和治療組的所有小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(第33天，即，分組后第24天)時(shí)均存活且體重出現(xiàn)增長(zhǎng)，治療組與對(duì)照組相比，動(dòng)物體重?zé)o顯著性差異(p＞0.05)，表明動(dòng)物對(duì)tecentriq耐受良好。與實(shí)驗(yàn)3類似，對(duì)照組所有小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)，而所有治療組15只小鼠中，有3只小鼠在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)腫瘤消失。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組平均腫瘤體積為2464±1914mm3，治療組在10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg劑量水平下的平均腫瘤體積分別為219±326mm3、1028±963mm3、1044±432mm3，所有治療組小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。tgitv分別為97.2％、93.7％、61.2％，表明不同劑量的抗人pd-l1抗體tecentriq對(duì)腫瘤具有明顯的抑制作用(tgitv＞60％)，劑量高的治療效果越好。由此證明抗人pd-l1抗體tecentriq在b-hpd-1小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出的療效不同。表8上述研究結(jié)果表明廣泛使用的2種人pd-1/pd-l1抗體對(duì)b-hpd-1小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制和/或消除作用，由此證明人源化pd-1動(dòng)物模型可被用于體內(nèi)評(píng)估靶向pd-1/pd-l1藥物的有效性，以及評(píng)估靶向pd-1/pd-l1的治療效果。實(shí)施例11b-hpd-1基因人源化動(dòng)物模型用于聯(lián)合用藥的藥效檢測(cè)臨床研究證明，化療藥物對(duì)人體多種實(shí)體瘤有明顯的效果，具有抗瘤譜廣、作用強(qiáng)、與多種抗腫瘤藥協(xié)同作用且無交叉耐藥等特點(diǎn)。單克隆抗體聯(lián)合化療藥在腫瘤治療中是臨床廣泛應(yīng)用的方法。本實(shí)施例選擇有代表性的人pd-1抗體keytruda和人pd-l1抗體tecentriq與一線化療藥cisplatin聯(lián)用，以驗(yàn)證b-hpd-1小鼠可用于針對(duì)人pd-1/pd-l1信號(hào)通路的抑制劑與其它藥物的聯(lián)合用藥方面的研究。取b-hpd-1純合小鼠(4-6周齡)，右側(cè)皮下接種5×105小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1(同實(shí)施例10)后，待腫瘤體積約100mm3后隨機(jī)分為6個(gè)對(duì)照組或治療組(n＝7/組)。治療組隨機(jī)選擇注射上述3種藥物中的1種或2種，給藥劑量為0.1-10mg/kg，對(duì)照組注射空白溶劑。每周測(cè)量腫瘤體積2次并稱量小鼠的體重，接種后單只小鼠腫瘤體積達(dá)到3000mm3時(shí)執(zhí)行安樂死結(jié)束實(shí)驗(yàn)。具體的給藥或給藥組合、劑量、給藥方式和頻率如表9所示。表9從測(cè)試結(jié)果上看，6組小鼠的體重變化(圖18)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均無明顯區(qū)別，但從量瘤結(jié)果上看(圖19、20)，對(duì)照組(g1)小鼠的腫瘤在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)持續(xù)生長(zhǎng)，5個(gè)治療組(g2至g6)小鼠與對(duì)照組相比，腫瘤體積均出現(xiàn)不同程度的縮小，表明經(jīng)過不同藥物或藥物聯(lián)用治療后，小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制。具體對(duì)每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估分析。表10中列出了主要數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，具體包括分組時(shí)(接種后第8天)和分組10天后的腫瘤體積、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(接種后第25天)的腫瘤體積、小鼠存活情況、無腫瘤小鼠(tumorfree)的情況、腫瘤(體積)抑制率(tgitv)以及治療組與對(duì)照組的小鼠體重、腫瘤體積之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值)。其中，使用cisplatin(g2)單獨(dú)治療小鼠的存活情況最差，死亡2只小鼠；其次是cisplatin與keytruda聯(lián)用治療組(g4)或與tecentriq聯(lián)用治療組(g6)，均死亡1只小鼠。而對(duì)照組(g1)或使用抗體的治療組(g3、g5)在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)均存活。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組(g1)平均腫瘤體積為1716±789mm3，單獨(dú)使用cisplatin治療組(g2)平均腫瘤體積為612±510mm3，單獨(dú)使用keytruda治療組(g3)平均腫瘤體積為1267±619mm3，cisplatin與keytruda聯(lián)用治療組(g4)平均腫瘤體積為496±160mm3，單獨(dú)使用tecentriq治療組(g5)平均腫瘤體積為1234±977mm3，cisplatin與tecentriq聯(lián)用治療組(g6)平均腫瘤體積為427±148mm3。可見cisplatin與keytruda聯(lián)用治療組(g4)的小鼠荷瘤體積明顯小于單獨(dú)使用cisplatin(g2)或keytruda(g3)；cisplatin與tecentriq聯(lián)用治療組(g6)的小鼠荷瘤體積明顯小于單獨(dú)使用cisplatin(g2)或tecentriq(g5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化療藥cisplatin雖然具有一定的腫瘤抑制作用，但具有一定毒性，可導(dǎo)致小鼠死亡。此外，tgitv值也表明上述兩種單克隆抗體和化療藥cisplatin聯(lián)用的療效優(yōu)于單克隆抗體或化療藥單獨(dú)使用的療效。同時(shí)使用抗人pd-1抗體藥keytruda或抗人pd-l1抗體藥tecentriq，可以更高效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。表10以上實(shí)施例已證實(shí)b-hpd-1小鼠模型對(duì)現(xiàn)有的多種抗人pd-1/pd-l1抑制劑和化療藥物或聯(lián)合用藥，均有響應(yīng)并表現(xiàn)出腫瘤生長(zhǎng)抑制的劑量相關(guān)性。以下實(shí)施例將選擇多個(gè)抗人pd-1/pd-l1抑制劑，以進(jìn)一步的驗(yàn)證b-hpd-1小鼠可作為體內(nèi)研究的活體替代模型，用于人pd-1/pd-l1信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑的篩選、評(píng)估和治療。實(shí)施例12b-hpd-1基因人源化動(dòng)物模型用于抗人pd-1/pd-l1調(diào)節(jié)劑的篩選試驗(yàn)1：取b-hpd-1純合小鼠(4-6周齡)，右側(cè)皮下種5×105小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38-hpdl1(同實(shí)施例10)后，待腫瘤體積約100mm3后隨機(jī)分為對(duì)照組或治療組(n＝5/組)。治療組隨機(jī)選擇陽性對(duì)照藥tecentriq或兩種抗人pd-l1抗體中的1種，給藥劑量均為3mg/kg，對(duì)照組注射空白溶劑。給藥方式：腹腔注射，每2天給藥1次，共給藥8次。每周測(cè)量腫瘤體積2次，接種后單只小鼠腫瘤體積達(dá)到3000mm3時(shí)執(zhí)行安樂死結(jié)束實(shí)驗(yàn)。表11中列出了各個(gè)實(shí)驗(yàn)的主要數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，具體包括分組時(shí)和分組后10天時(shí)的腫瘤體積、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤體積、小鼠存活情況、無腫瘤小鼠(tumorfree)的情況、腫瘤(體積)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治療組與對(duì)照組的小鼠體重、腫瘤體積之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值)。表11整體來看，各組實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物健康狀態(tài)良好。在各實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，各組動(dòng)物體重增長(zhǎng)良好，所有治療組與對(duì)照組相比，動(dòng)物體重?zé)o顯著性差異(p＞0.05)，表明動(dòng)物對(duì)所述3種抗體耐受良好。所有實(shí)驗(yàn)治療組和對(duì)照組小鼠體重(圖21)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均無明顯區(qū)別，但從量瘤結(jié)果上看(圖22)，所有對(duì)照組小鼠腫瘤在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均持續(xù)生長(zhǎng)，而所有治療組小鼠與對(duì)照組相比，腫瘤體積呈現(xiàn)不同程度的縮小和/或消失，表明兩種抗人pd-l1單抗具有不同的抑瘤作用，且未對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生明顯毒性作用，安全性較好。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組(g1)平均腫瘤體積為409±131mm3，tecentriq治療組(g2)為75±113mm3，pdl1-ab1抗體治療組(g3)為101±128mm3，pdl1-ab2抗體治療組(g4)為232±88mm3，使用pdl1-ab1抗體治療(g3)與tecentriq治療組(g2)小鼠腫瘤體積大小差別不大，且g2、g3組與對(duì)照組(g1)的瘤體積相比均具有顯著的差異(p＜0.05)，tgitv分別為112.2％、103.3％，而使用pdl1-ab2抗體治療(g4)的小鼠腫瘤體積明顯大于tecentriq治療組(g2)及pdl1-ab1抗體治療(g3)，表明在相同的給藥劑量和頻次下，抗人pdl1-ab1抗體與陽性對(duì)照品tecentriq藥效相似，在抑制腫瘤生長(zhǎng)上效果相當(dāng)，而抗人pdl1-ab2抗體藥效不如tecentriq或pdl1-ab1抗體。本實(shí)驗(yàn)證明了b-hpd-1小鼠可用于篩選靶向人pd-l1的藥物(如，抗體)及體內(nèi)藥效檢測(cè)。試驗(yàn)2：取b-hpd-1純合小鼠(4-6周齡)，皮下接種小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞mc38(5×105)，待腫瘤體積約100mm3后隨機(jī)分為對(duì)照組或治療組(n＝6/組)。治療組隨機(jī)選擇5種抗人pd-1抗體中的1種，給藥劑量均為10mg/kg，對(duì)照組注射空白溶劑。給藥方式：腹腔注射，每3天給藥1次，共給藥6次。每周測(cè)量腫瘤體積2次，接種后單只小鼠腫瘤體積達(dá)到3000mm3時(shí)執(zhí)行安樂死。表12中列出了各個(gè)實(shí)驗(yàn)的主要數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，具體包括分組時(shí)和分組后10天時(shí)的腫瘤體積、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤體積、小鼠存活情況、無腫瘤小鼠(tumorfree)的情況、腫瘤(體積)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治療組與對(duì)照組的小鼠體重、腫瘤體積之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值)。表12整體來看，各組實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物健康狀態(tài)良好。在各實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，各組動(dòng)物體重增長(zhǎng)良好，且所有治療組與對(duì)照組相比，動(dòng)物體重?zé)o明顯差異，表明動(dòng)物對(duì)所述5種抗體耐受良好。所有實(shí)驗(yàn)治療組和對(duì)照組小鼠體重(圖23)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均無明顯區(qū)別，但從量瘤結(jié)果上看(圖24)，對(duì)照組小鼠腫瘤在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均持續(xù)生長(zhǎng)，而所有治療組小鼠與對(duì)照組相比，腫瘤體積呈現(xiàn)不同程度的縮小和/或消失，表明5種抗人pd-1單抗具有不同的抑瘤作用，且未對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生明顯毒性作用，安全性較好。證明了b-hpd-1小鼠可用于篩選靶向人pd-1的藥物(如，抗體)及體內(nèi)藥效檢測(cè)。實(shí)施例13雙重人源化或多重人源化小鼠的制備及鑒定利用本方法或制得的b-hpd-1小鼠還可以制備雙人源化或多人源化小鼠模型。如，前述實(shí)施例8中，顯微注射及胚胎移植過程使用的受精卵細(xì)胞選擇來源于其它基因修飾小鼠的受精卵細(xì)胞，可選擇b-hpd-1小鼠的受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，可以進(jìn)一步得到pd-1人源化與其它基因修飾的雙基因或多基因修飾的小鼠模型。也可將本方法得到的b-hpd-1小鼠純合或雜合子與其它基因修飾純合或雜合小鼠交配，對(duì)其后代進(jìn)行篩選，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，可有一定幾率得到pd-1人源化與其它基因修飾的雙基因或多基因修飾的雜合小鼠，再將雜合子相互交配可以得到雙基因或多基因修飾的純合子。以雙重人源化ctla-4/pd-1小鼠的生成為例。由于小鼠ctla-4與pd-1基因位于同一條染色體上(1條染色體)，在實(shí)施例8顯微注射時(shí)，選擇b-hctla-4小鼠的受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，通過陽性子代小鼠的篩選，最終得到雙重人源化ctla-4/pd-1小鼠。選取1只雙重人源化ctla-4/pd-1雜合子(6周齡)，另選2只野生型c57bl/6小鼠作為對(duì)照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗體，28h后脫頸安樂死后取脾臟，研磨后過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)，將過濾好的細(xì)胞懸液離心棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反應(yīng)，離心棄上清后用pbs清洗細(xì)胞1次，然后用鼠源ctla-4抗體mctla-4apc(圖25a、25b、25c)或人源ctla-4抗體hctla-4pe(圖25d、25e、25f)，或鼠源pd-1抗體mpd-1pe(圖25g、25h、25i)或人源pd-1抗體hpd-1fitc(圖25j、25k、25l)，和鼠源t細(xì)胞表面抗體mtcrβ對(duì)t細(xì)胞胞外蛋白同時(shí)進(jìn)行染色，用pbs清洗細(xì)胞后，進(jìn)行流式檢測(cè)蛋白表達(dá)。流式分析結(jié)果如圖25顯示，與未經(jīng)刺激和經(jīng)過鼠cd3抗體刺激脾臟中t細(xì)胞激活后的c57bl/6小鼠相比，人源ctla-4抗體和人源pd-1抗體可以檢測(cè)到人源化ctla-4/pd-1雜合子小鼠脾臟內(nèi)表達(dá)人ctla-4和pd-1蛋白的細(xì)胞；而在c57bl/6對(duì)照鼠的脾臟內(nèi)未檢測(cè)到表達(dá)人ctla-4或pd-1蛋白的細(xì)胞。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。序　列　表<110>北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司<120>一種pd-1基因修飾人源化動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用<130>pb710044n<160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1agggacctccagggcccattggg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2cagaggtccccaatgggccctgg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3gtagaaggtgagggacctccagg23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4ccctcaccttctacccagcctgg23<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5gcaccccaaggcaaaaatcgagg23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6ggagcagagctcgtggtaacagg23<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7gttaccacgagctctgctccagg23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8gcaaaaatcgaggagagccctgg23<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9tagaaggtgagggacctcc19<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10ggaggtccctcaccttcta19<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11caaaaatcgaggagagccc19<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<400>12gggctctcctcgatttttg19<210>13<211>132<212>dna<213>人工序列<400>13gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaat60agcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct120tttaaaggatcc132<210>14<211>679<212>dna<213>人工序列<400>14atgctgaaggaagagccctgcttgttggaggttacttattcacaacctacaagaagctac60aagctcctaggtagggggaactgcttacgatattctgccctggaatgggtctgagagcac120attcctctccagggggttcagaaaagatgtcagaaagggtgtacaggctccttcctcaca180gctctttgttcttctgcatttcagaggtccccaatgggccctggaacccccccaccttct240ccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctcca300acacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggaca360agctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtca420cacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgaca480gcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcc540tgcgggcagagctcgtggtaacaggtgaggctagtagaacctacgtgggcaattccttcc600tgcccagagacctcttaggctctctgccatggctctgcctagagccttgacgacactgcc660cctctccctgtggaaatcc679<210>15<211>867<212>dna<213>人工序列<400>15atgtgggtccggcaggtaccctggtcattcacttgggctgtgctgcagttgagctggcaa60tcagggtggcttctagaggtccccaatgggccctggaacccccccaccttctccccagcc120ctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcg180gagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggcc240gccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactg300cccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacc360tacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggca420gagctcgtggtaacagagagaatcctggagacctcaacaagatatcccagcccctcgccc480aaaccagaaggccggtttcaaggcatggtcattggtatcatgagtgccctagtgggtatc540cctgtattgctgctgctggcctgggccctagctgtcttctgctcaacaagtatgtcagag600gccagaggagctggaagcaaggacgacactctgaaggaggagccttcagcagcacctgtc660cctagtgtggcctatgaggagctggacttccagggacgagagaagacaccagagctccct720accgcctgtgtgcacacagaatatgccaccattgtcttcactgaagggctgggtgcctcg780gccatgggacgtaggggctcagctgatggcctgcagggtcctcggcctccaagacatgag840gatggacattgttcttggcctctttga867<210>16<211>1972<212>dna<213>人工序列<400>16tgagcagcggggaggaggaagaggagactgctactgaaggcgacactgccaggggctctg60ggcatgtgggtccggcaggtaccctggtcattcacttgggctgtgctgcagttgagctgg120caatcagggtggcttctagaggtccccaatgggccctggaacccccccaccttctcccca180gccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacaca240tcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctg300gccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaa360ctgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggc420acctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgg480gcagagctcgtggtaacagagagaatcctggagacctcaacaagatatcccagcccctcg540cccaaaccagaaggccggtttcaaggcatggtcattggtatcatgagtgccctagtgggt600atccctgtattgctgctgctggcctgggccctagctgtcttctgctcaacaagtatgtca660gaggccagaggagctggaagcaaggacgacactctgaaggaggagccttcagcagcacct720gtccctagtgtggcctatgaggagctggacttccagggacgagagaagacaccagagctc780cctaccgcctgtgtgcacacagaatatgccaccattgtcttcactgaagggctgggtgcc840tcggccatgggacgtaggggctcagctgatggcctgcagggtcctcggcctccaagacat900gaggatggacattgttcttggcctctttgaccagattcttcagccattagcatgctgcag960accctccacagagagcaccggtccgtccctcagtcaagaggagcatgcaggctacagttc1020agccaaggctcccagggtctgagctagctggagtgacagcccagcgcctgcaccaattcc1080agcacatgcactgttgagtgagagctcacttcaggtttaccacaagctgggagcagcagg1140cttcccggtttcctattgtcacaaggtgcagagctggggcctaagcctatgtctcctgaa1200tcctactgttgggcacttctagggacttgagacactatagccaatggcctctgtgggttc1260tgtgcctggaaatggagagatctgagtacagcctgctttgaatggccctgtgaggcaacc1320ccaaagcaagggggtccaggtatactatgggcccagcacctaaagccacccttgggagat1380gatactcaggtgggaaattcgtagactgggggactgaaccaatcccaagatctggaaaag1440ttttgatgaagacttgaaaagctcctagcttcgggggtctgggaagcatgagcacttacc1500aggcaaaagctccgtgagcgtatctgctgtccttctgcatgcccaggtacctcagttttt1560ttcaacagcaaggaaactagggcaataaagggaaccagcagagctagagccacccacaca1620tccagggggcacttgactctccctactcctcctaggaaccaaaaggacaaagtccatgtt1680gacagcagggaaggaaagggggatataaccttgacgcaaaccaacactggggtgttagaa1740tctcctcattcactctgtcctggagttgggttctggctctccttcacacctaggactctg1800aaatgagcaagcacttcagacagtcagggtagcaagagtctagctgtctggtgggcaccc1860aaaatgaccagggcttaagtccctttcctttggtttaagcccgttataattaaatggtac1920caaaagctttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1972<210>17<211>288<212>prt<213>人工序列<400>17mettrpvalar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