本發(fā)明屬分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種線粒體耳聾t12201c突變的熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耳聾是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，其中超過50％的耳聾患者由遺傳因素導(dǎo)致。在遺傳性耳聾中，30％為綜合征耳聾，70％為非綜合征耳聾。耳聾的遺傳方式可表現(xiàn)常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、x連鎖遺傳和母系遺傳，線粒體dna(mtdna)突變是母系遺傳性耳聾發(fā)生的重要原因之一，在遺傳性耳聾中的發(fā)病率約為1％～2％。

耳聾相關(guān)的mtdnatrna基因突變共涉及16種trna，t12201c突變位于其中的trna^his上。該突變首先發(fā)現(xiàn)于中國的一個非綜合征耳聾大家系中，所有患者表現(xiàn)為遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾，雙側(cè)對稱，進(jìn)行性加重。焦磷酸測序顯示，該家系母系成員的t12201c突變呈高度異質(zhì)性，且異質(zhì)性水平與非綜合征耳聾的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡存在相關(guān)性。t12201c突變的主要致聾機(jī)制為，突變破壞了trna^his受體臂上高度保守的5a-68u堿基配對，從而改變了trna^his的構(gòu)象，降低了其穩(wěn)態(tài)水平。在攜帶t12201c突變的細(xì)胞中，線粒體dna編碼的多肽合成、線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的atp均出現(xiàn)不同程度的下降。由t12201c突變引起的trna^his代謝紊亂，造成線粒體翻譯缺陷，嚴(yán)重影響了線粒體呼吸和氧化磷酸化產(chǎn)能。

目前，mtdna突變的常見檢測方法主要有直接測序法、微陣列芯片法、pcr-rflp法、熒光定量pcr法等。直接測序法的優(yōu)點是準(zhǔn)確性高，但檢測周期較長，且需要專業(yè)的測序儀和結(jié)果判讀人員，不適合臨床推廣應(yīng)用。微陣列芯片法具有高通量的優(yōu)點，但存在檢測成本高、操作繁瑣、易交叉污染等缺點，不適用于大樣本篩查的需求。pcr-rflp法由于在pcr擴(kuò)增結(jié)束后需開蓋進(jìn)行后續(xù)的酶切和電泳，同樣存在操作繁瑣、容易污染等問題。熒光定量pcr技術(shù)近年來在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，其基本原理是利用taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通pcr基礎(chǔ)上設(shè)計熒光雙標(biāo)記探針，兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)(r)和淬滅基團(tuán)(q)；探針保持完整時r基團(tuán)的熒光信號被q基團(tuán)抑制，一旦探針被切斷，q基團(tuán)的抑制作用消失，r基團(tuán)的熒光信號就可被檢測到。該技術(shù)通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)對pcr過程中產(chǎn)物量的實時監(jiān)測，除具有定量準(zhǔn)確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對pcr產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。而且，隨著材料和儀器的進(jìn)一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標(biāo)記不同的熒光染料(fam、hex、rox等)及多通道熒光定量pcr儀，可以實現(xiàn)基因分型、基因突變檢測、snp分析等研究。

針對熒光定量pcr傳統(tǒng)taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，美國abi公司于2000年推出一種新的taqman探針——mgb探針，其3’端采用非熒光性的淬滅基團(tuán)，在吸收報告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，mgb探針的3’端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可極大提高探針與模板雜交的穩(wěn)定性，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的tm值。而短探針的主要優(yōu)點在于熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，信噪比更高；同時，短探針也簡化了設(shè)計和降低了成本。有實驗表明mgb探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種線粒體耳聾常見突變t12201c的熒光定量pcr檢測試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液、第一陽性對照品、第二陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴(kuò)增引物序列為：5’-attgtgaatctgacaacagaggcttac-3’

下游擴(kuò)增引物序列為：5’-catgagttagcagttcttgtgagctt-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-accccttacttaccg-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-accccttatttaccg-mgb-3’

第一陽性對照品為線粒體第12201位點為t堿基的dna樣品，第二陽性對照品為線粒體第12201位點為c堿基的dna樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒在相關(guān)性耳聾線粒體t12201c突變檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明試劑盒使用方法：

每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。

⑴人外周血細(xì)胞mtdna的提取：嚴(yán)格按照美國bibvision公司商品化的線粒體dna提取試劑盒操作，從臨床外周血標(biāo)本中提取mtdna。

⑵pcr擴(kuò)增檢測：在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進(jìn)行，每個pcr反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包括20μlpcr反應(yīng)液和5μl模板(提取的mtdna、陽性對照、陰性對照)。探針檢測模式為：fam、hex通道分別用于檢測12201位點的c堿基和t堿基。pcr反應(yīng)條件：94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運行程序。

⑶熒光定量結(jié)果報告：①檢測樣品c堿基探針ct值≤35且擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)增長期，同一反應(yīng)體系中t堿基探針ct值大于c堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測樣品12201位點為c堿基；②檢測樣品t堿基探針ct值≤35且擴(kuò)增曲線有明顯對數(shù)增長期，同一反應(yīng)體系中c堿基探針ct值大于t堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測樣品12201位點為t堿基；③當(dāng)兩探針ct值均大于35或兩探針ct值的差值小于5時，需對樣品重新進(jìn)行mtdna提取和pcr檢測。

本發(fā)明針對mtdna第12201位點的t>c單堿基突變設(shè)計兩條mgb探針，開發(fā)該位點突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，旨在準(zhǔn)確、快速、簡便地檢測mtdnat12201c突變，從而應(yīng)用于該突變相關(guān)性耳聾的臨床診斷、預(yù)防和治療。本發(fā)明采用實時熒光定量pcr技術(shù)和雙色熒光探針，開發(fā)研制了用于線粒體耳聾常見突變t12201c的檢測試劑盒。該試劑盒能通過一步法檢測mtdna第12201位點是否發(fā)生t>c突變，可滿足臨床準(zhǔn)確、快速、簡便地診斷該突變相關(guān)性耳聾的需要，同時為t12201c突變導(dǎo)致的線粒體耳聾的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為第一陽性對照品檢測結(jié)果12201位點為t的擴(kuò)增曲線。

圖3為第二陽性對照品檢測結(jié)果12201位點為c堿基的擴(kuò)增曲線。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合實施例和附圖作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

參見圖1，本發(fā)明提供的線粒體耳聾t12201c突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液1、第一陽性對照品2、第二陽性對照品3、陰性對照品4、說明書5和盒體6組成，其中定量pcr反應(yīng)液1含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴(kuò)增引物、下游擴(kuò)增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴(kuò)增引物序列為：5’-attgtgaatctgacaacagaggcttac-3’

下游擴(kuò)增引物序列為：5’-catgagttagcagttcttgtgagctt-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-accccttacttaccg-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-accccttatttaccg-mgb-3’

第一陽性對照品2為線粒體第12201位點為t堿基的dna樣品，第二陽性對照品3為線粒體第12201位點為c堿基的dna樣品，陰性對照品4為無菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

實施例2線粒體耳聾t12201c突變熒光定量pcr檢測試劑盒的應(yīng)用

(一)檢測樣品：

在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院確診為感音神經(jīng)性耳聾患兒48例，所有病例均采用美國biovision公司的線粒體dna提取試劑盒，從其外周血標(biāo)本中提取線粒體dna作為檢測樣品。

(二)熒光定量pcr檢測

在定量pcr反應(yīng)液管中分別加入檢測樣品、陽性對照品或陰性對照品5μl，在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr擴(kuò)增，fam、hex通道分別用于檢測12201位點的c堿基和t堿基。pcr反應(yīng)條件為94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個循環(huán)。

(三)檢測結(jié)果

第一陽性對照品檢測結(jié)果12201位點為t堿基(圖2)，第二陽性對照品檢測結(jié)果12201位點為c堿基(圖3)。臨床檢測樣品中12201位點為t堿基的有47例，占97.9％；12201位點為c堿基的有1例，占2.1％。所有檢測樣品的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)直接測序，發(fā)現(xiàn)12201位點的堿基均與熒光定量pcr檢測結(jié)果相符，表明該試劑盒檢測t12201c突變具有很好的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限度的范圍。

<110>浙江大學(xué)

<120>線粒體耳聾t12201c突變的熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

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<223>擴(kuò)增人線粒體trna的上游引物序列

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attgtgaatctgacaacagaggcttac27

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>擴(kuò)增人線粒體trna的下游引物序列

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catgagttagcagttcttgtgagctt26

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>人線粒體第12201位點為c堿基的熒光探針序列

<400>3

accccttacttaccg15

<210>4

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人線粒體第12201位點為t堿基的熒光探針序列

<400>4

accccttatttaccg15