本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：弓形蟲(toxoplasmagondii)是一種細胞內(nèi)寄生的原蟲，最終的宿主是貓科動物，但是可以在任何一種溫血動物體內(nèi)進行繁殖。該蟲呈世界性分布，寄生于人和哺乳動物組織細胞內(nèi)，可以引起嚴(yán)重的人畜共患病。弓形蟲病可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、早產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)和畸胎，甚至死產(chǎn)。即使受染成活，嬰兒中85％在成年以前會出現(xiàn)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，極大影響優(yōu)生優(yōu)育，所以弓形蟲病診斷是優(yōu)生優(yōu)育檢查項目里很重要的一項。弓形蟲病對免疫力低下和免疫缺陷的人群危害極大，不僅可引起弓形蟲性腦炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、腹膜炎等，甚至?xí)?dǎo)致死亡。隨著生活水平的提高，居民養(yǎng)殖寵物貓和攝入肉食的機會增多，人感染弓形蟲的危險性越來越大。弓形蟲病缺少特異性的臨床癥狀和體征，增加診斷難度，如果再區(qū)分急性感染和慢性感染就難上加難。目前抗弓形蟲抗體檢測用抗原多為弓形蟲蟲體提取物、sag1重組全長等，但是弓形蟲蟲體分為5種不同形態(tài)的階段，即滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊，僅僅是某一種重組蛋白很可能會出現(xiàn)漏檢，而且弓形蟲蟲體的粗提物由于成分多而且復(fù)雜也會導(dǎo)致假陽性，因此針對臨床病原體檢測方法檢出率低，免疫學(xué)診斷方法也會存在敏感性和特異性的局限，篩選高敏感性和特異性的抗原是研制弓形蟲病診斷試劑盒的關(guān)鍵。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具有高敏感性和特異性，可避免假陽性，而且檢出率高的用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物，所述重組抗原組合物包含弓形蟲sag1特異表位重組抗原、弓形蟲sag3特異表位重組抗原、弓形蟲gra3特異表位重組抗原和弓形蟲mic3特異表位重組抗原。作為一種改進的技術(shù)方案，所述sag1特異表位重組抗原、sag3特異表位重組抗原、gra3特異表位重組抗原和mic3特異表位重組抗原在所述重組抗原組合物中按照1-5:1-5:1-5:1-5的比例組合。作為一種改進的技術(shù)方案，所述sag1特異表位重組抗原的特異表位為sag1蛋白n端第48個氨基酸到第316個氨基酸；sag3特異表位重組抗原的特異表位為sag3蛋白n端第41個氨基酸到382個氨基酸；gra3特異表位重組抗原的特異表位為gra3蛋白n端第44個氨基酸到第160個氨基酸；mic3特異表位重組抗原的特異表位為mic3蛋白n端第38個氨基酸到第383個氨基酸。本發(fā)明的另一個目的在于：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物的制備方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括下列步驟：(1)抗原表位的篩選利用在線分析工具，分析弓形蟲sag1、sag3、gra3和mic3的氨基酸序列全長，篩選出弓形蟲sag1蛋白特異性抗原位于第48個氨基酸到第316個氨基酸；弓形蟲sag3蛋白特異性抗原位于第41個氨基酸到第382個氨基酸；弓形蟲gra3蛋白特異性抗原位于第44個氨基酸到第160個氨基酸；弓形蟲mic3蛋白特異性抗原位于第38個氨基酸到第383個氨基酸；(2)弓形蟲sag1、sag3、gra3和mic3蛋白抗原表位的基因克隆分別設(shè)計sag1、sag3、gra3和mic3的上、下游引物，以弓形蟲dna為模板，分別用設(shè)計的上、下游引物擴增弓形蟲sag1、sag3、gra3和mic3蛋白抗原表位的基因片段，電泳膠回收目的片段，置-20℃凍存?zhèn)溆茫?3)分別構(gòu)建sag1、sag3、gra3和mic3蛋白表達載體提取pgex-6p-1和prset-b質(zhì)粒，將pgex-6p-1、prset-b分別經(jīng)過雙酶切，電泳后分別膠回收pgex-6p-1、prset-b雙酶切的質(zhì)粒片段；sag1蛋白、sag3蛋白、gra3蛋白和mic3蛋白分別經(jīng)過雙酶切，電泳后膠回收雙酶切目的片段，-20℃?zhèn)溆?；將雙酶切質(zhì)粒和雙酶切目的片段按1:3-10比例，用t4連接酶16℃過夜連接，分別得到重組質(zhì)粒。作為一種改進的技術(shù)方案，所述制備方法還包括下列步驟：重組質(zhì)粒的篩選和鑒定：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),涂布含氨芐青霉素lb平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和對照菌落，分別提取質(zhì)粒，將分別提取的質(zhì)粒雙酶切，跑電泳，均能看見相應(yīng)的目的片段和載體，構(gòu)建表達載體成功，即為陽性表達菌；蛋白工程菌高效表達：將鑒定陽性表達菌接種至含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床振蕩4h，加終濃度為0.5-1.5mmol/liptg，25℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)過夜,離心收集沉淀的菌體，再將菌體進行破碎，破碎后收集的上清和沉淀分別進行sds-page檢測；上清中含有pgex-6p-1-gra3和pgex-6p-1-sag1表達的目的蛋白，prset-b-sag3和prset-b-mic3以包涵體形式表達存在于沉淀中；表達蛋白的純化：將重組蛋白工程菌液離心，收集的沉淀菌體重懸于原離心體積1/10的裂解液內(nèi)，冰浴超聲菌體10-30min后，離心，分別收集菌液上清和沉淀的包涵體；取菌液上清與50％谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，離心，棄上清，沉淀中加入10倍標(biāo)準(zhǔn)體積的pbs，混勻，再經(jīng)過離心、棄上清，收集沉淀，向沉淀中加入1-3倍體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，攪動，離心后將收集的上清移至新管中，在pbs中透析24-48h，離心取上清，-20℃?zhèn)溆?；取沉淀的包涵體，并用含0.5％skl緩沖體系溶解，室溫裂解包涵體、離心，收集上清，將上清經(jīng)過透析過夜，再離心過濾膜后上鎳柱純化。作為一種改進的技術(shù)條件，步驟(2)中的擴增條件為：階段1：94℃預(yù)變性3min；階段2：94℃30s、58℃30s、72℃1min，共30個循環(huán)；階段3：72℃5min。作為一種改進的技術(shù)方案，步驟(3)中的重組質(zhì)粒分別是pgex-6p-1-sag1、prset-b-mic3、pgex-6p-1-gra3和prset-b-sag3。作為一種改進的技術(shù)方案，所述sag1的上游引物sag1p1包含以下序列：5’-tcgaacccaccacttgt-3’，所述sag1的下游引物sag1p2包含以下序列：5’-actggctgctcacgt-3’；上游引物5’端添加ndel酶切位點(catatg)，下游引物5’端添加xhoⅰ酶切位點(ctcgag)；所述sag3的上游引物sag3p1具有以下序列：5’-gagcatggtctgttcat-3’，所述sag3的下游引物sag3p2具有以下序列:5’-atgcacaaggagaccgaga-3’；上游引物5’端添加bamhⅰ酶切位點(ggatcc)，下游引物5’端添加ncol酶切位點(ccatgg)；所述gra3的上游引物gra3p1具有以下序列：5’-ccttacgtccctttttta-3’，所述gra3的下游引物gra3p2具有以下序列:5’-ataacgacaacgccact-3’；上游引物5’端添加bamhⅰ酶切位點(ggatcc)，下游引物5’端添加xhoⅰ酶切位點(ctcgag)；所述mic3的上游引物mic3p1具有以下序列：5’-aggtatgaaacgagccga-3’，所述mic3的下游引物mic3p2具有以下序列:5’-atcttgtttttcacaccga-3’；上游引物5’端添加xhoⅰ酶切位點(ctcgag)，下游引物5’端添加ncol酶切位點(ccatgg)。本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：本發(fā)明選擇sag1、sag3、gra3和mic3四個代表性的抗原蛋白，分析四種蛋白氨基酸序列，挑選抗原性比較強的部分片斷，作為重組抗原的對象，大大提高了表達的產(chǎn)量和特異性，將四種重組抗原復(fù)配得到的抗原組合物具有較好的特異性和敏感性，將其用于診斷弓形蟲抗體，大大提高了臨床檢出率，有效解決了檢測時所存在的假陽性及漏檢問題。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物，重組抗原組合物包含弓形蟲sag1特異表位重組抗原、弓形蟲sag3特異表位重組抗原、弓形蟲gra3特異表位重組抗原和弓形蟲mic3特異表位重組抗原。其中sag1特異表位重組抗原、sag3特異表位重組抗原、gra3特異表位重組抗原和mic3特異表位重組抗原在所述重組抗原組合物中按照1-5:1-5:1-5:1-5的比例組合。其中sag1特異表位重組抗原的特異表位為sag1蛋白n端第48個氨基酸到第316個氨基酸；sag3特異表位重組抗原的特異表位為sag3蛋白n端第41個氨基酸到382個氨基酸；gra3特異表位重組抗原的特異表位為gra3蛋白n端第44個氨基酸到第160個氨基酸；mic3特異表位重組抗原的特異表位為mic3蛋白n端第38個氨基酸到第383個氨基酸。實施例2一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物的制備方法，包括下列步驟：(1)抗原表位的篩選利用在線分析工具，分析弓形蟲sag1、sag3、gra3和mic3的氨基酸序列全長，篩選出弓形蟲sag1蛋白特異性抗原位于第48個氨基酸到第316個氨基酸；弓形蟲sag3蛋白特異性抗原位于第41個氨基酸到第382個氨基酸；弓形蟲gra3蛋白特異性抗原位于第44個氨基酸到第160個氨基酸；弓形蟲mic3蛋白特異性抗原位于第38個氨基酸到第383個氨基酸；(2)弓形蟲sag1、sag3、gra3和mic3蛋白抗原表位的基因克隆sag1抗原表位dna序列兩側(cè)設(shè)計引物；上游引物sag1p1：5’-tcgaacccaccacttgt-3’；下游引物sag1p2：5’-actggctgctcacgt-3’，上游引物5’端添加ndel酶切位點(catatg)，下游引物5’端添加xhoⅰ酶切位點(ctcgag)；sag3抗原表位dna序列兩側(cè)設(shè)計引物；上游引物sag3p1：5’-gagcatggtctgttcat-3’；下游引物sag3p2:5’-atgcacaaggagaccgaga-3’；上游引物5’端添加bamhⅰ酶切位點(ggatcc)，下游引物5’端添加ncol酶切位點(ccatgg)；gra3抗原表位dna序列兩側(cè)設(shè)計引物；上游引物gra3p1：5’-ccttacgtccctttttta-3’；下游引物gra3p2:5’-ataacgacaacgccact-3’；上游引物5’端添加bamhⅰ酶切位點(ggatcc)，下游引物5’端添加xhoⅰ酶切位點(ctcgag)；mic3抗原表位dna序列兩側(cè)設(shè)計引物；上游引物mic3p1：5’-aggtatgaaacgagccga-3’；下游引物mic3p2:5’-atcttgtttttcacaccga-3’，上游引物5’端添加xhoⅰ酶切位點(ctcgag)，下游引物5’端添加ncol酶切位點(ccatgg)；以弓形蟲dna為模板，用引物sag1p1和sag1p2擴增弓形蟲sag1蛋白抗原表位的基因片段；用引物sag3p1和sag3p2擴增弓形蟲sag3蛋白抗原表位的基因片段；用gra3p1和gra3p2擴增弓形蟲gra3蛋白抗原表位的基因片段；用mic3p1和mic3p2擴增弓形蟲mic3蛋白抗原表位的基因片段，階段1：94℃預(yù)變性3min；階段2：94℃30s、58℃30s、72℃1min，共30個循環(huán)；階段3：72℃；電泳膠回收目的片段，sag1目的片段為819bp，sag3目的片段為1038bp，gra3目的片段為363bp，mic3目的片段為1050bp，置-20℃凍存?zhèn)溆茫?3)分別構(gòu)建sag1、sag3、gra3和mic3蛋白表達載體提取pgex-6p-1和prset-b質(zhì)粒，pgex-6p-1分別用ndel和xhoⅰ、bamh和xhoⅰ雙酶切，prset-b分別用bamhⅰ和ncol、xhoⅰ和ncol雙酶切，電泳后膠回收雙酶切的質(zhì)粒片段；ndel和xhoⅰ雙酶切sag1蛋白，bamhⅰ和ncol雙酶切sag3蛋白，bamh和xhoⅰ雙酶切g(shù)ra3蛋白，xhoⅰ和ncol雙酶切mic3蛋白，電泳后膠回收雙酶切目的片段，-20℃?zhèn)溆?；將雙酶切質(zhì)粒和雙酶切目的片段按1:3-10比例，用t4連接酶16℃過夜連接，連接后的重組質(zhì)粒分別是pgex-6p-1-sag1、prset-b-mic3、pgex-6p-1-gra3和prset-b-sag3；(4)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),涂布含氨芐青霉素(60ug/ml)lb平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和對照菌落，分別提取質(zhì)粒；pgex-6p-1-sag1、prset-b-sag3、pgex-6p-1-gra3和prset-b-mic3分別用ndel和xhoⅰ、bamhⅰ和ncol、xhoⅰ和ncol、bamh和xhoⅰ雙酶切，酶切后跑電泳，均能看見相應(yīng)的目的片段和載體，構(gòu)建表達載體成功，即為陽性表達菌；(5)蛋白工程菌高效表達將鑒定陽性表達菌接種至含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床振蕩4h，加終濃度為1mmol/liptg，25℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)過夜,離心收集沉淀的菌體，再將菌體進行破碎，破碎后收集的上清和沉淀分別進行sds-page檢測；上清中含有pgex-6p-1-gra3和pgex-6p-1-sag1表達的目的蛋白，而prset-b-sag3和prset-b-mic3以包涵體形式在沉淀中；對照菌中無目的蛋白條帶，說明分別獲得了高表達的sag1、sag3、gra3和mic3抗原性片段蛋白的工程菌；(6)表達蛋白的純化高效表達的重組蛋白工程菌高速(10000rpm)低溫(4℃)離心10min，將沉淀的菌體重懸于原離心體積的1/10裂解液(50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)內(nèi)，冰浴超聲菌體20min，高速(12000rpm)低溫(4℃)離心30min，分別收集菌液上清和沉淀的包涵體；pgex-6p-1-gra3和pgex-6p-1-sag1表達的蛋白在上清中，上清與50％谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，于室溫下輕搖30min，混合物于4℃離心機中2100rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清；沉淀中加入10倍標(biāo)準(zhǔn)體積的pbs，顛倒數(shù)次混勻，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白，將混合物于4℃離心機中2100rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清，收集沉淀，并向沉淀中加入1倍體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min，洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白，并4℃2100rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min，上清移至新管中，重復(fù)2次，合并3次上清，在pbs(10mm，ph7.4)中透析48h，離心取上清即分別獲得sag1和gra3抗原性目的蛋白，-20℃?zhèn)溆?；prset-b-sag3和prset-b-mic3表達蛋白以包涵體形式存在，包涵體用0.5％skl的緩沖體系溶解(緩沖體系為50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)，室溫裂解包涵體1h，4℃12000rpm/min離心20min，收集上清4℃透析過夜(透析液為50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)，透析后離心過0.22um的濾膜后上鎳柱純化；按0.5ml/min的流速使上述表達蛋白樣品緩緩流過鎳柱，用5倍柱床體積的bindingbuffer洗滌層析柱，再按照0.5ml/min的流速用elutingbuffer洗脫目的蛋白。實施例3陽性表達菌重組質(zhì)粒測序?qū)⑸鲜鲫栃员磉_菌用治理提取試劑盒提取質(zhì)粒送于上海生工測序。重組質(zhì)粒內(nèi)的sag1基因片段的dna序列完全正確，結(jié)果如下：tcggatccccctcttgttgccaatcaagttgtcacctgcccagataaaaaatcgacagccgcggtcattctcacaccgacggagaaccacttcactctcaagtgccctaaaacagcgctcacagagcctcccactcttgcgtactcacccaacaggcaaatctgcccagcgggtactacaagtagctgtacatcaaaggctgtaacattgagctccttgattcctgaagcagaagatagctggtggacgggggattctgctagtctcgacacggcaggcatcaaactcacagttccaatcgagaagttccccgtgacaacgcagacgtttgtggtcggttgcatcaagggagacgacgcacagagttgtatggtcacagtgacagtacaagccagagcctcatcggtcgtcaataatgtcgcaaggtgctcctacggtgcagacagcactcttggtcctgtcaagttgtctgcggaaggacccactacaatgaccctcgtgtgcgggaaagatggagtcaaagttcctcaagacaacaatcagtactgttccgggacgacgctgactggttgcaacgagaaatcgttcaaagatattttgccaaaattaactgagaacccgtggcagggtaacgcttcgagtgataagggtgccacgctaacgatcaagaaggaagcatttccagccgagtcaaaaagcgtcattattggatgcacagggggatcgcctgagaagcatcactgtaccgtgaaactggagtttgccggggctgcagggtcagcaaaatcggctgcgggaacagccagt重組質(zhì)粒內(nèi)的sag3基因片段的dna序列完全正確，結(jié)果如下：gagcacggactgttcgtcgccgcagggaaatcgagaagtaagataacctattttggcacgctcactcagaaggctccgaactggtaccgctgctcttcaacgagggcgaatgaagaggtcgtaggacatgtgacgctgaacaaagagcaccctgatatgacaattgaatgcgtcgacgacggcttgggcggagagtttttgccgctcgaaggcgcgacgtcgtcgtacccgcgagtatgtcacattgatgccaaggacaagggcgactgcgagcgcaacaagggctttctgaccgactacataccgggcgcgaagcagtactggtacaagatagaaaaggtggagaacaacggcgagcaatccgttctgtacaaattcacagttccttggatattccttccgcccgccaagcagcgatacaaggttggatgccgatacccgaaccacgagtattgctttgttgaggtcaccgtcgaacccacgccgccaatggtcgaaggcaagagagtgacctgcgggtaccccgagtccggccccgtgaatctcgaggtggacttgtcaaaggacgcgaactttatcgagattcggtgcggcgaacagcaccacccgcagccgtcgacctacacgctgcagtactgctcaggtgactcggtggacccgcagaagtgttcgccgcagtccctgacgaacattttttatgactacagctcttcgtggtggaaggggaaactgaacgggcctgacggggcaactctcaccattccacccggcgggttccccgaagaagacaaatcttttcttgtcgggtgttcactcactgtggacgggccgcccttctgcaacgtcaaagtgagagttgccgggaaccccagaaagtgggggagaggcggaggcggccatccaggaagcggaggattgcagccgggaactgaaggggaaagtcaagctggaacagaaagttcagccggcgcgagttcgcgaatggcttccgttgccctggcgttccttctcggtctccttgtgcat重組質(zhì)粒內(nèi)的gra3基因片段的dna序列完全正確，結(jié)果如下：ccatatgtcccttttttatacagagtttcacaatgtcaactgctttgaagcggctcattccatttctagttccctttgtggttttcctggtcgctgctgccttgggaggccttgcggcggatcagcctgaaaatcatcaggctcttgcagaaccagttacgggtgtgggggaagcaggagtgtcccccgtcaacgaagctggtgagtcatacagttctgcaacttcgggtgtccaagaagctaccgccccaggtgcagtgctcctggacgcaatcgatgccgagtcggataaggtggacaatcaggcggagggaggtgagcgtatgaagaaggtcgaagaggagttgtcgt重組質(zhì)粒內(nèi)的mic3基因片段的dna序列完全正確，結(jié)果如下：tttgacaaagttgtgccgagccgcgaagtcgtctctgagagtcttgctccgtctttcgcggtgactgagactcactcgtctgtgcaatcccccagcaagcaggagacgcaactctgtgctatctcgagtgaaggcaagccatgtcgaaaccgtcagttgcacactgacaacgggtacttcatcggggccagttgccccaagagcgcttgctgcagcaagaccatgtgcggccccggcggctgcggagaattctgctccagcaactggattttttgcagcagttcgctcatctaccatcctgacaaaagctatggaggagactgcagctgtgaaaagcagggccatcggtgcgacaaaaacgcagaatgcgtcgaaaacttggacgcgggtgggggtgtgcactgcaagtgcaaagacggcttcgtcggcactgggttgacttgctccgaggatccttgttcaaaaagagggaacgcgaagtgcggacccaacgggacgtgcatcgtcgtcgattcagtcagctacacatgcacctgcggcgacggcgaaactctagtgaacctcccggaagggggacaaggatgcaagaggactggatgtcatgccttcagggagaactgcagccctggtagatgtattgatgacgcctcgcatgagaatggctacacctgcgagtgccccacagggtactcacgtgaggtgacttccaaggcggaggagtcgtgtgtggaaggagtcgaagtcacgctggctgagaaatgcgagaaggaattcggcatcagcgcgtcatcctgcaaatgcgataacggatactccggatctgcttccgcaacctcccaccatgggaaaggagaatcgggatccgaggggagcttgagtgaaaaaatgaatattgtcttcaagtgccccagtggctaccatccaagataccatgcccacaccgtgacgtgtgagaaaattaagcactttgcccttgacggggccggcaaccacgacacgactacgtatgtcgcaagacgaaggtacccagcgagtctc實施例4用純化的重組蛋白檢測弓形蟲抗體將純化的4種重組蛋白同等濃度下混合，用碳酸鹽緩沖液(50mm，ph9.6)稀釋后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶聯(lián)板，4℃過夜；洗滌后加200ul/孔10％小牛血清的pbs37℃水浴封閉2h，洗滌后4℃?zhèn)溆?。間接酶聯(lián)免疫法檢測5份抗弓形蟲陽性血清及5份正常人血清，使用450nm波長測定od值。結(jié)果顯示(見表1)融合蛋白組合物能與5份抗弓形蟲陽性血清反應(yīng)，不與5份正常人血清反應(yīng)，說明該組合物有較好的抗原性和特異性。表1間接酶聯(lián)免疫法實驗結(jié)果(a450值)12345抗弓形蟲igm陽性血清1.1351.6841.3601.2111.308正常人血清0.0360.0250.0440.0310.019本專利不局限于上述具體的實施方式，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從上述構(gòu)思出發(fā)，不經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動，所作出的種種變換，均落在本專利的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>濰坊漢唐生物工程有限公司<120>一種用于診斷弓形蟲抗體的重組抗原組合物及其制備方法<130>1<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>17<212>dna<213>上游引物sag1p1<400>1tcgaacccaccacttgt17<210>2<211>15<212>dna<213>下游引物sag1p2<400>2actggctgctcacgt15<210>3<211>17<212>dna<213>上游引物sag3p1<400>3gagcatggtctgttcat17<210>4<211>19<212>dna<213>下游引物sag3p2<400>4atgcacaaggagaccgaga19<210>5<211>18<212>dna<213>上游引物gra3p1<400>5ccttacgtccctttttta18<210>6<211>17<212>dna<213>下游引物gra3p2<400>6ataacgacaacgccact17<210>7<211>18<212>dna<213>上游引物mic3p1<400>7aggtatgaaacgagccga18<210>8<211>19<212>dna<213>下游引物mic3p2<400>8atcttgtttttcacaccga19<210>9<211>807<212>dna<213>sagi特異表位的核苷酸序列<400>9tcggatccccctcttgttgccaatcaagttgtcacctgcccagataaaaaatcgacagcc60gcggtcattctcacaccgacggagaaccacttcactctcaagtgccctaaaacagcgctc120acagagcctcccactcttgcgtactcacccaacaggcaaatctgcccagcgggtactaca180agtagctgtacatcaaaggctgtaacattgagctccttgattcctgaagcagaagatagc240tggtggacgggggattctgctagtctcgacacggcaggcatcaaactcacagttccaatc300gagaagttccccgtgacaacgcagacgtttgtggtcggttgcatcaagggagacgacgca360cagagttgtatggtcacagtgacagtacaagccagagcctcatcggtcgtcaataatgtc420gcaaggtgctcctacggtgcagacagcactcttggtcctgtcaagttgtctgcggaagga480cccactacaatgaccctcgtgtgcgggaaagatggagtcaaagttcctcaagacaacaat540cagtactgttccgggacgacgctgactggttgcaacgagaaatcgttcaaagatattttg600ccaaaattaactgagaacccgtggcagggtaacgcttcgagtgataagggtgccacgcta660acgatcaagaaggaagcatttccagccgagtcaaaaagcgtcattattggatgcacaggg720ggatcgcctgagaagcatcactgtaccgtgaaactggagtttgccggggctgcagggtca780gcaaaatcggctgcgggaacagccagt807<210>10<211>1026<212>dna<213>sag3特異表位的核苷酸序列<400>10gagcacggactgttcgtcgccgcagggaaatcgagaagtaagataacctattttggcacg60ctcactcagaaggctccgaactggtaccgctgctcttcaacgagggcgaatgaagaggtc120gtaggacatgtgacgctgaacaaagagcaccctgatatgacaattgaatgcgtcgacgac180ggcttgggcggagagtttttgccgctcgaaggcgcgacgtcgtcgtacccgcgagtatgt240cacattgatgccaaggacaagggcgactgcgagcgcaacaagggctttctgaccgactac300ataccgggcgcgaagcagtactggtacaagatagaaaaggtggagaacaacggcgagcaa360tccgttctgtacaaattcacagttccttggatattccttccgcccgccaagcagcgatac420aaggttggatgccgatacccgaaccacgagtattgctttgttgaggtcaccgtcgaaccc480acgccgccaatggtcgaaggcaagagagtgacctgcgggtaccccgagtccggccccgtg540aatctcgaggtggacttgtcaaaggacgcgaactttatcgagattcggtgcggcgaacag600caccacccgcagccgtcgacctacacgctgcagtactgctcaggtgactcggtggacccg660cagaagtgttcgccgcagtccctgacgaacattttttatgactacagctcttcgtggtgg720aaggggaaactgaacgggcctgacggggcaactctcaccattccacccggcgggttcccc780gaagaagacaaatcttttcttgtcgggtgttcactcactgtggacgggccgcccttctgc840aacgtcaaagtgagagttgccgggaaccccagaaagtgggggagaggcggaggcggccat900ccaggaagcggaggattgcagccgggaactgaaggggaaagtcaagctggaacagaaagt960tcagccggcgcgagttcgcgaatggcttccgttgccctggcgttccttctcggtctcctt1020gtgcat1026<210>11<211>351<212>dna<213>gra3特異表位的核苷酸序列<400>11ccatatgtcccttttttatacagagtttcacaatgtcaactgctttgaagcggctcattc60catttctagttccctttgtggttttcctggtcgctgctgccttgggaggccttgcggcgg120atcagcctgaaaatcatcaggctcttgcagaaccagttacgggtgtgggggaagcaggag180tgtcccccgtcaacgaagctggtgagtcatacagttctgcaacttcgggtgtccaagaag240ctaccgccccaggtgcagtgctcctggacgcaatcgatgccgagtcggataaggtggaca300atcaggcggagggaggtgagcgtatgaagaaggtcgaagaggagttgtcgt351<210>12<211>1038<212>dna<213>mic3特異表位的核苷酸序列<400>12tttgacaaagttgtgccgagccgcgaagtcgtctctgagagtcttgctccgtctttcgcg60gtgactgagactcactcgtctgtgcaatcccccagcaagcaggagacgcaactctgtgct120atctcgagtgaaggcaagccatgtcgaaaccgtcagttgcacactgacaacgggtacttc180atcggggccagttgccccaagagcgcttgctgcagcaagaccatgtgcggccccggcggc240tgcggagaattctgctccagcaactggattttttgcagcagttcgctcatctaccatcct300gacaaaagctatggaggagactgcagctgtgaaaagcagggccatcggtgcgacaaaaac360gcagaatgcgtcgaaaacttggacgcgggtgggggtgtgcactgcaagtgcaaagacggc420ttcgtcggcactgggttgacttgctccgaggatccttgttcaaaaagagggaacgcgaag480tgcggacccaacgggacgtgcatcgtcgtcgattcagtcagctacacatgcacctgcggc540gacggcgaaactctagtgaacctcccggaagggggacaaggatgcaagaggactggatgt600catgccttcagggagaactgcagccctggtagatgtattgatgacgcctcgcatgagaat660ggctacacctgcgagtgccccacagggtactcacgtgaggtgacttccaaggcggaggag720tcgtgtgtggaaggagtcgaagtcacgctggctgagaaatgcgagaaggaattcggcatc780agcgcgtcatcctgcaaatgcgataacggatactccggatctgcttccgcaacctcccac840catgggaaaggagaatcgggatccgaggggagcttgagtgaaaaaatgaatattgtcttc900aagtgccccagtggctaccatccaagataccatgcccacaccgtgacgtgtgagaaaatt960aagcactttgcccttgacggggccggcaaccacgacacgactacgtatgtcgcaagacga1020aggtacccagcgagtctc1038當(dāng)前第1頁12