本發(fā)明屬分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及線粒體耳聾a7445g突變的熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耳聾是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起，其中超過50％的耳聾患者由遺傳因素導(dǎo)致。在遺傳性耳聾中，30％為綜合征耳聾，70％為非綜合征耳聾。耳聾的遺傳方式可表現(xiàn)常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、x連鎖遺傳和母系遺傳，線粒體dna(mtdna)突變是母系遺傳性耳聾發(fā)生的重要原因之一，在遺傳性耳聾中的發(fā)病率約為1％～2％。

耳聾相關(guān)的mtdnatrna基因突變共涉及16種trna，其中trna^ser(ucn)基因是耳聾相關(guān)突變的熱點區(qū)域。a7445g突變位于trna^ser(ucn)前體3’端核酸外切酶的作用位點附近，突變發(fā)生時可影響核酸外切酶的識別，導(dǎo)致trna^ser(ucn)前體加工缺陷，進而影響trna^ser(ucn)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和線粒體自身蛋白的翻譯，使細胞氧化磷酸化過程受損。同時，由于該突變處在trna^ser(ucn)/co1的基因連接處，可引起co1多肽mrna終止密碼子的改變，并通過在co1多肽的c末端增加3個氨基酸殘基(絲氨酸-谷氨酰胺-賴氨酸)改變了co1多肽原有的形態(tài)，影響了細胞色素c氧化酶的空間結(jié)構(gòu)和生理功能，阻礙了呼吸鏈上的電子傳遞過程，最終導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。

目前，mtdna突變的常見檢測方法主要有直接測序法、微陣列芯片法、pcr-rflp法、熒光定量pcr法等。直接測序法的優(yōu)點是準確性高，但檢測周期較長，且需要專業(yè)的測序儀和結(jié)果判讀人員，不適合臨床推廣應(yīng)用。微陣列芯片法具有高通量的優(yōu)點，但存在檢測成本高、操作繁瑣、易交叉污染等缺點，不適用于大樣本篩查的需求。pcr-rflp法由于在pcr擴增結(jié)束后需開蓋進行后續(xù)的酶切和電泳，同樣存在操作繁瑣、容易污染等問題。熒光定量pcr技術(shù)近年來在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，其基本原理是利用taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通pcr基礎(chǔ)上設(shè)計熒光雙標記探針，兩端分別標記熒光報告基團(r)和淬滅基團(q)；探針保持完整時r基團的熒光信號被q基團抑制，一旦探針被切斷，q基團的抑制作用消失，r基團的熒光信號就可被檢測到。該技術(shù)通過對熒光信號的檢測實現(xiàn)對pcr過程中產(chǎn)物量的實時監(jiān)測，除具有定量準確、檢測快速等優(yōu)點外，最大的優(yōu)勢是采用完全閉管檢測，省去了對pcr產(chǎn)物的后處理，避免了交叉污染。而且，隨著材料和儀器的進一步發(fā)展，通過在熒光探針的5’端標記不同的熒光染料(fam、hex、rox等)及多通道熒光定量pcr儀，可以實現(xiàn)基因分型、基因突變檢測、snp分析等研究。

針對熒光定量pcr傳統(tǒng)taqman探針熒光淬滅不徹底的問題，美國abi公司于2000年推出一種新的taqman探針——mgb探針，其3’端采用非熒光性的淬滅基團，在吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。此外，mgb探針的3’端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可極大提高探針與模板雜交的穩(wěn)定性，使較短的探針同樣能達到較高的tm值。而短探針的主要優(yōu)點在于熒光報告基團與淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低，信噪比更高；同時，短探針也簡化了設(shè)計和降低了成本。有實驗表明mgb探針對于等位基因的區(qū)分比較理想，甚至可以檢測單堿基突變。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種線粒體耳聾常見突變a7445g的熒光定量pcr檢測試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液、第一陽性對照品、第二陽性對照品、陰性對照品、說明書和盒體組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴增引物序列為：5’-caccctaccacacattcgaaga-3’

下游擴增引物序列為：5’-tggcttgaaaccagctttgg-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-ccgtatacataaaatctaggca-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex-ccgtatacataaaatctagacaa-mgb-3’

第一陽性對照品為線粒體第7445位點為a堿基的dna樣品，第二陽性對照品為線粒體第7445位點為g堿基的dna樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述的試劑盒在相關(guān)性耳聾線粒體a7445g突變檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明試劑盒使用方法：

每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。

⑴人外周血細胞mtdna的提?。簢栏癜凑彰绹鴅iovision公司商品化的線粒體dna提取試劑盒操作，從臨床外周血標本中提取mtdna。

⑵pcr擴增檢測：在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進行，每個pcr反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包括20μlpcr反應(yīng)液和5μl模板(提取的mtdna、陽性對照、陰性對照)。探針檢測模式為：fam、hex通道分別用于檢測7445位點的g堿基和a堿基。pcr反應(yīng)條件：94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運行程序。

⑶熒光定量結(jié)果報告：①檢測樣品g堿基探針ct值≤35且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，同一反應(yīng)體系中a堿基探針ct值大于g堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測樣品7445位點為g堿基；②檢測樣品a堿基探針ct值≤35且擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，同一反應(yīng)體系中g(shù)堿基探針ct值大于a堿基探針ct值，且兩者差值≥5，則該檢測樣品7445位點為a堿基；③當兩探針ct值均大于35或兩探針ct值的差值小于5時，需對樣品重新進行mtdna提取和pcr檢測。

本發(fā)明針對mtdna第7445位點的a>g單堿基突變設(shè)計兩條mgb探針，開發(fā)該位點突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，旨在準確、快速、簡便地檢測mtdnaa7445g突變，從而應(yīng)用于該突變相關(guān)性耳聾的臨床診斷、預(yù)防和治療。本發(fā)明采用實時熒光定量pcr技術(shù)和雙色熒光探針，開發(fā)研制了用于線粒體耳聾常見突變a7445g的檢測試劑盒。該發(fā)明試劑盒能通過一步法檢測mtdna第7445位點是否發(fā)生a>g突變，可滿足臨床準確、快速、簡便地診斷該突變相關(guān)性耳聾的需要，同時為a7445g突變導(dǎo)致的線粒體耳聾的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為第一陽性對照品檢測7445位點為a堿基的擴增曲線。

圖3為第二陽性對照品檢測7445位點為g堿基的擴增曲線。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合實施例和附圖作進一步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

參見圖1，本發(fā)明提供的線粒體耳聾a7445g突變的熒光定量pcr檢測試劑盒，由定量pcr反應(yīng)液(1)、第一陽性對照品(2)、第二陽性對照品(3)、陰性對照品(4)、說明書(5)和盒體(6)組成，其中定量pcr反應(yīng)液含有pcr緩沖液、mgcl2、dntps、耐熱dna聚合酶、上游擴增引物、下游擴增引物、第一熒光探針和第二熒光探針。

上游擴增引物序列為：5’-caccctaccacacattcgaaga-3’

下游擴增引物序列為：5’-tggcttgaaaccagctttgg-3’

第一熒光探針序列為：5’-fam-ccgtatacataaaatctaggca-mgb-3’

第二熒光探針序列為：5’-hex--mgb-3’

第一陽性對照品為線粒體第7445位點為a堿基的dna樣品，第二陽性對照品為線粒體第7445位點為g堿基的dna樣品，陰性對照品為無菌注射用水樣品。

本發(fā)明試劑盒應(yīng)保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。

實施例2線粒體耳聾a7445g突變熒光定量pcr檢測試劑盒的應(yīng)用

(一)檢測樣品：

在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院確診為感音神經(jīng)性耳聾患兒35例，所有病例均采用美國biovision公司的線粒體dna提取試劑盒，從其外周血標本中提取線粒體dna作為檢測樣品。

(二)熒光定量pcr檢測

在定量pcr反應(yīng)液管中分別加入檢測樣品、陽性對照品或陰性對照品5μl，在雙色(或以上)熒光定量pcr儀上進行pcr擴增，fam、hex通道分別用于檢測7445位點的g堿基和a堿基。pcr反應(yīng)條件為94℃5分鐘預(yù)變性，94℃20秒→60℃60秒，共40個循環(huán)。

(三)檢測結(jié)果

第一陽性對照品檢測結(jié)果7445位點為a堿基(圖2)，第二陽性對照品檢測結(jié)果7445位點為g堿基(圖3)。臨床檢測樣品中7445位點為a堿基的有33例，占94.3％；7445位點為g堿基的有2例，占5.7％。所有檢測樣品的pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)直接測序，發(fā)現(xiàn)7445位點的堿基均與熒光定量pcr檢測結(jié)果相符，表明該試劑盒檢測a7445g突變具有很好的準確性。

本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限度的范圍。

<110>浙江大學(xué)

<120>線粒體耳聾a7445g突變的熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<223>擴增人線粒體trna的上游引物序列

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caccctaccacacattcgaaga22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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<223>擴增人線粒體trna的下游引物序列

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tggcttgaaaccagctttgg20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<223>人線粒體第7445位點為g堿基的熒光探針序列

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ccgtatacataaaatctaggca22

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人線粒體第7445位點為a堿基的熒光探針序列

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ccgtatacataaaatctagacaa23