本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)：

風(fēng)疹病毒(rubellavirus，rv)是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，唯一的自然宿主是人，但實(shí)驗(yàn)室可以感染猴、鼠等野生和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。風(fēng)疹是一種非常溫和的疾病，通常只引起皮疹、頜下淋巴結(jié)腫大和其他輕微的體征。但對(duì)兒童和孕婦，風(fēng)疹的后果很嚴(yán)重。孕期前12周感染可導(dǎo)致胎兒先天風(fēng)疹感染和80-90％的患者孕婦流產(chǎn)。胎兒的先天性感染會(huì)導(dǎo)致先天性風(fēng)疹綜合征，累及多器官多系統(tǒng)，并存在長期的活性感染。

風(fēng)疹病毒基因組為單股正鏈rna，風(fēng)疹病毒有3中結(jié)構(gòu)蛋白，分別是胞膜糖蛋白e1、e2和核殼蛋白c。c蛋白富含脯氨酸和精氨酸，與病毒rna結(jié)合構(gòu)成核衣殼，在病毒從一個(gè)宿主細(xì)胞感染另一個(gè)宿主細(xì)胞的過程中對(duì)病毒基因組起保護(hù)作用。e1和e2存在于病毒包膜表面，含有能刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的抗原表位。e1是風(fēng)疹病毒的重要抗原，雖然整個(gè)氨基酸序列在不同毒株之間存在一定差異，但是在抗原決定簇集中區(qū)域卻是保守一致的。e2蛋白的生物學(xué)性至今尚未明確，在e1-e2復(fù)合物中，e2表位可能被e1遮蓋，所以在風(fēng)疹病毒感染中誘導(dǎo)低水平的免疫反應(yīng)。

風(fēng)疹病毒感染臨床癥狀和其他病毒感染癥狀有一定的相似性，所以臨床診斷準(zhǔn)確性增加了一些難度。風(fēng)疹病毒感染診斷主要以血清學(xué)診斷為主，細(xì)胞培養(yǎng)抗原的純化難以排除細(xì)胞蛋白成分，抗原純度不高導(dǎo)致診斷靈敏度和特異性較差，所以篩選高敏感性和特異性的重組抗原是研制風(fēng)疹病毒診斷的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種高敏感性、高特異性、可提高檢測率的檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白，所述融合蛋白為包含風(fēng)疹病毒e1蛋白片段i、風(fēng)疹病毒e1蛋白片段ii和風(fēng)疹病毒c蛋白片段的融合蛋白，所述e1蛋白片段i分布在融合蛋白的n端，所述e1蛋白片段ii分布在中間，所述c蛋白片段分布在融合蛋白的c端，且所述e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段之間通過甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接。

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述e1蛋白片段i為e1蛋白片段中第9個(gè)氨基酸至第116個(gè)氨基酸，所述e1蛋白片段ii為e1蛋白片段中第208個(gè)氨基酸至第293個(gè)氨基酸，所述c蛋白片段為c蛋白片段中第212個(gè)氨基酸至第243個(gè)氨基酸。

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述e1蛋白片段i具有seqidno:1所示的氨基酸序列，所述e1蛋白片段ii具有seqidno:2所示的氨基酸序列，所述c蛋白片段具有seqidno:3所示的氨基酸序列。

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述融合蛋白具有seqidno:4所示的氨基酸序列。

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述融合蛋白的基因序列如seqidno:5所示，所述基因序列前后兩端分別有ncoi和ndei兩種限制性內(nèi)切酶。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白的制備方法，其特征在于所述制備方法包括下列步驟：

(1)抗原表位的篩選及基因片段的化學(xué)合成

利用在線分析工具分析，篩選出風(fēng)疹病毒e1蛋白的第9個(gè)氨基酸至第116個(gè)氨基酸、e1蛋白的第208個(gè)氨基酸至293個(gè)氨基酸及風(fēng)疹病毒c蛋白的第212個(gè)氨基酸至第243個(gè)氨基酸；化學(xué)合成風(fēng)疹病毒e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段串聯(lián)的基因序列；

(2)表達(dá)e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取pgem-5zf，用ncol和ndel雙酶切，電泳后膠回收雙酶切的質(zhì)粒片段；用ncol和ndel雙酶切化學(xué)合成的風(fēng)疹病毒融合蛋白基因片段，電泳回收雙酶切的基因片段，-20℃?zhèn)溆?；將雙酶切的質(zhì)粒片段和雙酶切的基因片段按1:3-10比例，用t4連接酶16℃過夜連接，連接后的重組質(zhì)粒為pgem-5zf-e1+eii+c；

(3)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),涂布含氨芐青霉素的lb平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和對(duì)照菌落，分別提取質(zhì)粒，分別用ndel和ncol雙酶切，酶切后跑電泳，均能看見相應(yīng)的目的片段和載體，構(gòu)建表達(dá)載體成功，即為陽性表達(dá)菌；

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述制備方法還包括下列步驟：

重組蛋白工程菌高效表達(dá)：

將陽性表達(dá)菌接種至含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩4h，加終濃度為0.5-1.5mmol/liptg，37℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)3-4h，離心收集沉淀菌體，將沉淀菌體進(jìn)行破碎，取上清和沉淀分別進(jìn)行sds-page檢測，上清中得到表達(dá)的目的蛋白；

表達(dá)蛋白的純化：

將重組蛋白工程菌在4℃條件下以8000-12000rpm的轉(zhuǎn)速離心8-12min，將沉淀的菌體重懸于原離心體積的1/10裂解液內(nèi)，冰浴超聲菌體，在4℃條件下以10000-13000rpm的轉(zhuǎn)速離心25-35min，收集菌液上清；用平衡液沖洗平衡鎳離子親和層析柱后，將超聲收集的菌液上清直接上柱，上樣結(jié)束后用平衡液洗滌柱子，依次用洗脫液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，sds-page電泳檢測各峰蛋白。

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，表達(dá)蛋白的純化步驟中的裂解液由50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt組成。

作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，表達(dá)蛋白的純化步驟中的洗脫液為濃度20-500mm的咪唑洗脫液。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)分析e1蛋白和c蛋白氨基酸序列，挑選抗原性比較強(qiáng)的部分片斷，大大提高了表達(dá)的產(chǎn)量和特異性，大大提高了臨床漏檢率；

(2)表達(dá)e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白用作檢測抗原，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中分別重組e1部分蛋白和c蛋白的檢測用抗原，生產(chǎn)時(shí)要同時(shí)制備幾個(gè)表達(dá)蛋白所存在的耗費(fèi)時(shí)間和成本的問題；

(3)表達(dá)風(fēng)疹病毒e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白以可溶形式存在，易于純化。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白，融合蛋白為包含風(fēng)疹病毒e1蛋白片段i、風(fēng)疹病毒e1蛋白片段ii和風(fēng)疹病毒c蛋白片段的融合蛋白。其中e1蛋白片段i分布在融合蛋白的氨基端，e1蛋白片段ii分布在中間，c蛋白片段分布在融合蛋白的c端，且e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段之間通過甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接。其中e1蛋白片段i為e1蛋白片段中第9個(gè)氨基酸至第116個(gè)氨基酸，e1蛋白片段ii為e1蛋白片段中第208個(gè)氨基酸至第293個(gè)氨基酸，c蛋白片段為c蛋白片段中第212個(gè)氨基酸至第243個(gè)氨基酸。

實(shí)施例2

一種檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)抗原表位的篩選及基因片段的化學(xué)合成

利用expasy、tmhmm、signalip4.1等在線分析工具分析，篩選出風(fēng)疹病毒e1蛋白和c蛋白氨基酸序列全長，篩選出風(fēng)疹病毒e1蛋白片段i(e1蛋白中含有較強(qiáng)抗原決定簇的第9個(gè)氨基酸至第116個(gè)氨基酸)、e1蛋白片段ii(e1蛋白中含有較強(qiáng)抗原決定簇的第208個(gè)氨基酸至293個(gè)氨基酸)及風(fēng)疹病毒c蛋白片段(c蛋白中含有較強(qiáng)抗原決定簇的第212個(gè)氨基酸至第243個(gè)氨基酸)；化學(xué)合成風(fēng)疹病毒e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段串聯(lián)的基因序列；

(2)表達(dá)e1蛋白片段i、e1蛋白片段ii和c蛋白片段的融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取pgem-5zf，用ncol和ndel雙酶切，電泳后膠回收雙酶切的質(zhì)粒片段；用ncol和ndel雙酶切化學(xué)合成的風(fēng)疹病毒融合蛋白基因片段，電泳回收雙酶切的基因片段，-20℃?zhèn)溆茫粚㈦p酶切的質(zhì)粒片段和雙酶切的基因片段按1:3-10比例，用t4連接酶16℃過夜連接，連接后的重組質(zhì)粒為pgem-5zf-e1+eii+c；

(3)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),涂布含氨芐青霉素(60ug/ml)的lb平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和對(duì)照菌落(質(zhì)粒pgem-5zf轉(zhuǎn)化菌)，分別提取質(zhì)粒，分別用ndel和ncol雙酶切，酶切后跑電泳，均能看見相應(yīng)的目的片段和載體，構(gòu)建表達(dá)載體成功，即為陽性表達(dá)菌；

(4)重組蛋白工程菌高效表達(dá)

將陽性表達(dá)菌接種至2mllb培養(yǎng)基(60ug/ml氨芐青霉素)的試管中，37℃恒溫?fù)u床振蕩4h，加終濃度為0.5mmol/liptg，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)6h，離心收集沉淀菌體，將沉淀菌體進(jìn)行破碎，取上清和沉淀分別進(jìn)行sds-page檢測，上清中得到表達(dá)的目的蛋白；

(5)表達(dá)蛋白的純化

挑選高效表達(dá)的重組蛋白工程菌單菌落，接種到含100mllb液體培養(yǎng)基的三角瓶中，加氨芐青霉素至終濃度60ug/ml，置37℃搖床內(nèi)過夜。次日按菌液和lb培養(yǎng)基1:10接種至1000mllb(氨芐青霉素60ug/ml)培養(yǎng)液的三角瓶中，培養(yǎng)4h，加iptg(終濃度為0.5mmol/l)，37℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)6h，將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的1000ml工程菌離心，高速(10000rpm)低溫(4℃)離心10min，將沉淀的菌體重懸于原離心體積的1/10裂解液(50mmtris-hcl、10mmedta、15mmnacl、10mmdtt)內(nèi)，冰浴超聲菌體，高速(12000rpm)低溫(4℃)離心30min，收集菌液上清。

用平衡液(20mmpbph7.4)沖洗平衡鎳離子親和層析柱后，將超聲收集的菌液上清直接上柱，上樣流速1.5ml/min，上樣結(jié)束后用平衡液洗滌柱子，依次用含20、50、100、200、500mm濃度咪唑的洗脫液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，sds-page電泳檢測各峰蛋白。

實(shí)施例3

純化的重組蛋白在檢測風(fēng)疹病毒抗體中的應(yīng)用

將純化的重組蛋白，用碳酸鹽緩沖液(50mm，ph9.6)稀釋后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶聯(lián)板，4℃過夜。洗滌后加200ul/孔10％小牛血清的pbs37℃水浴封閉2h，洗滌后4℃?zhèn)溆谩?/p>

間接酶聯(lián)免疫法檢測抗風(fēng)疹病毒陽性血清及正常人血清，結(jié)果顯示融合蛋白能與抗風(fēng)疹病毒陽性血清反應(yīng)，不與正常人血清反應(yīng)，說明該融合蛋白有較好的抗原性和特異性。

實(shí)施例4

風(fēng)疹病毒融合蛋白的多抗血清的制備

將純化的重組風(fēng)疹病毒融合蛋白作抗原制備多抗血清，用抗原和佐劑聯(lián)合免疫新西蘭大耳白兔的方式，制備并純化獲得的兔抗血清，間接elisa法檢測抗風(fēng)疹病毒抗體滴度。

(1)主要試劑：完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑為sigma公司產(chǎn)品。其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

(2)免疫程序

融合蛋白作為免疫原，免疫5只新西蘭大耳兔，每只免疫200ug抗原，免疫方式為背部多點(diǎn)免疫。第一次免疫使用完全弗氏佐劑與融合蛋白混合乳化；兩周后第二次免疫，用不完全弗氏佐劑和融合蛋白混合乳化，免疫方式為背部多點(diǎn)免疫；三天后第三次免疫，用100ug的融合蛋白和相同體積的0.01mpbs(ph7.4)混合，免疫方式腹腔免疫；三天后同樣免疫程序免疫一次。

(3)間接elisa測兔抗血清效價(jià)

最后一次免疫后三天，兔耳緣靜脈取血，4000rpm離心10min獲取兔抗血清。取融合蛋白用碳酸鹽緩沖液(50mm，ph9.6)稀釋后100ul/孔、100ng/孔的蛋白量包被酶聯(lián)板，4℃過夜。次日20％小牛血清封閉，37℃水浴封閉2h，將兔抗血清梯度稀釋作為一抗，37℃水浴孵育1h后，加1:5000二抗羊抗兔，加顯色液顯色。效價(jià)高至1:10000以上，說明融合蛋白有較好的抗原性和特異性。

本專利不局限于上述具體的實(shí)施方式，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從上述構(gòu)思出發(fā)，不經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)，所作出的種種變換，均落在本專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>濰坊漢唐生物工程有限公司

<120>一種檢測風(fēng)疹病毒抗體的融合蛋白及其制備方法

<130>1

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