本發(fā)明涉及細菌檢測領域，具體涉及一種艾伯特埃希菌的檢測方法。

背景技術：

艾伯特埃希菌(escherichiaalbertii)是近年來發(fā)現(xiàn)和命名的一個新種，為與人散發(fā)腸道感染及突發(fā)食源性腹瀉事件有關的腸道致病菌。由于食品或人的糞便樣品中含有的細菌種類多樣，其中大腸桿菌無處不在，艾伯特埃希菌與大腸桿菌同屬于埃希氏菌屬，在生化和菌株培養(yǎng)特性上有很多相似性，在37℃培養(yǎng)時以大腸桿菌生長最為旺盛，抑制了艾伯特埃希菌的生長，使得艾伯特埃希菌的檢出率大大降低。目前國外有12個國家開展了此菌的研究，而國內(nèi)只有自貢市疾病預防控制中心開展了此菌的研究。

目前現(xiàn)有技術中有兩種艾伯特埃希菌的培養(yǎng)方法，1)含有艾伯特埃希菌的動物樣品(雞肉與內(nèi)臟、野生家養(yǎng)鳥腸內(nèi)容物或糞便)在bpw或mac培養(yǎng)基或者ec肉湯中35℃或42℃培養(yǎng)18h或24h，進行一次增菌；2)含有艾伯特埃希菌的病人樣品(糞便)在tsb或dhl培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18h～24h進行一次增菌。但上述兩種方法在實驗過程中以發(fā)酵乳糖的優(yōu)勢大腸桿菌增菌為主，mac平板上不發(fā)酵乳糖的無色菌落很少(95％以上的艾伯特埃希菌株不發(fā)酵乳糖)，這說明在35℃～42℃增菌液中以大腸桿菌生長最為旺盛。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種艾伯特埃希菌的培養(yǎng)方法。

為了達成上述的目的，本發(fā)明提供了艾伯特埃希菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)按照1:10的重量百分比采集25g食品+225mlec肉湯增菌液；3ml腦心-甘油肉湯保存液+2ml稀大便或2g干糞便的混合液+9mlec肉湯增菌液，于20℃培養(yǎng)18-36h；

2)取1ml上述ec肉湯增菌液，8000rpm離心3min集菌，棄上清；用150μl裂解液懸菌，振蕩使沉淀充分混勻，水煮10min；12000rpm離心5min，取上清即為pcr反應模板；eae基因pcr初篩引物為eae-f:caggatcgccttttttatacg和eae-r:ctctgcagattaacctctgc進行pcr初篩；pcr反應體系為：在20μl體系中，2×taqmastermix10μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，純水7μl；pcr反應條件：預變性94℃2min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循環(huán)，最后延伸72℃5min，每次實驗均設有陰、陽性對照；pcr產(chǎn)物以1.5wt％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；

3)用接種環(huán)挑取3環(huán)上述初篩eae陽性增菌保存液，分離劃線于3個麥康凱平板上，36℃，24h；可疑菌落為在平板上呈凸起、邊緣整齊、無色的較大菌落；然后挑出不少于30個的可疑無色菌落，每一個單個可疑無色菌落的二分之一作為pcr反應模板檢測eae基因；且每一個單個可疑無色菌落的另二分之一用于后續(xù)純培養(yǎng)；

4)接種eae陽性單菌落于營養(yǎng)瓊脂平板36℃純培養(yǎng)24h，純培養(yǎng)物分別接種于木糖和乳糖發(fā)酵管，并用軟瓊脂檢測動力，36℃培養(yǎng)，24h后觀察結果；

5)將上述eae基因陽性、不發(fā)酵乳糖、不發(fā)酵木糖、動力陰性的菌落作為疑似艾伯特埃希菌；無菌接種環(huán)挑取少量純培養(yǎng)物菌苔于含有500μl去離子水的1.5ml離心管中重懸，煮沸10min，12000rpm離心3min，取上清液做pcr模板，用于后續(xù)的診斷性三重pcr鑒定、16srdna序列分析及mlst分析。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟1)中，所述食品選自生牛肉、生豬肉、生羊肉、生雞肉、生鴨肉、新鮮雞腸或新鮮鴨腸；所述家禽家畜選自雞、鴨或家養(yǎng)鴿子；所述野生鳥類選自白鷺、麻雀或燕子；所述2ml稀大便或2g干糞便來自腹瀉患者、家禽家畜、野生鳥類糞便標本。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟2)中，所述裂解液的配方為：100mmnacl，10mmtris-hcl[ph8.3]，1mmedta[ph9.0]，1wt％tritonx-100。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟5)中，用10μl一次性無菌接種環(huán)挑取15mm純培養(yǎng)物菌苔于含有500μl去離子水的1.5ml離心管中重懸，煮沸10min，12000rpm離心3min。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟5)中，所述診斷性三重pcr鑒定具體為：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysp和mdh建立的三重pcr檢測方法，如3個基因均陽性，可初步確認為艾伯特埃希菌；其中診斷性三重pcr所用的引物見下表1：

表1診斷性三重pcr所用的引物

pcr反應體系為：在50μl體系中，2×taqmastermix25μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，純水18μl；反應條件：預變性94℃5min，變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，35次循環(huán)，最后72℃延伸5min，每次擴增均設有陰、陽性對照；取上述pcr產(chǎn)物5μl，以1.5wt％瓊脂糖凝膠進行電泳。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟5)中，所述16srdna序列分析具體為：

擴增艾伯特埃希菌16srdna的引物為ea16s-f:ggatccagactttgatymtggctcag和ea16s-r:ccgtcaattcctttragttt；其中pcr反應體系為：在50μl體系中，2×taqmastermix25μl，10μm上、下游引物各2μl，dna模板2μl，純水19μl；pcr反應條件：預變性94℃，5min，變性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，45s，30次循環(huán)，最后72℃延伸7min，每次擴增均設有陽性和空白對照；

取pcr產(chǎn)物5μl以1.5wt％瓊脂糖凝進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否擴增出目的大小片段，pcr產(chǎn)物均純化后進行測序；利用seqman軟件對測序結果進行峰圖查看，并在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行比對檢索，初步判斷結果；利用mega6.0軟件，以ncbi上公布的大腸埃希菌、志賀氏菌、費格森埃希菌的16srdna序列為參考，采用neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹，進行分類位置分析。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，在步驟5)中，所述mlst分析具體為：參照數(shù)據(jù)庫http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/ecoli/documents/primerscoli_html提供的大腸埃希菌mlst分型方案，選擇7個管家基因adk、fumc、gyrb、icd、mdh、pura、reca，pcr引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表2：

表27個管家基因的擴增引物序列及產(chǎn)物大小

pcr反應體系為：在50μl體系中，2×taqmastermix25μl，10μm上、下游引物各2μl，dna模板2μl，純水19μl；pcr反應條件：預變性94℃，5min，變性94℃，30s，各管家基因退火溫度30s，延伸72℃，45s，30次循環(huán)，最后延伸7min，每次擴增均設空白和陽性對照；

取pcr產(chǎn)物5μl以1.5wt％瓊脂糖凝膠進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察其大小片段，pcr產(chǎn)物均純化后進行測序；

利用seqman軟件對pcr產(chǎn)物序列與數(shù)據(jù)庫中的標準序列進行拼接和校正，校正后的序列上傳至e.colimlst數(shù)據(jù)庫中，確定菌株的等位基因型和序列型；利用mega6.0軟件neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹，與國際數(shù)據(jù)庫中已收錄的大腸埃希菌、志賀菌、艾伯特埃希菌和傷寒沙門菌進行聚類分析，確定艾伯特埃希菌種的鑒定。

本發(fā)明具有以下有效效果：

本發(fā)明人在總結歸納國外研究者艾伯特埃希菌的鑒定程序的基礎上，經(jīng)過反復實驗驗證，建立了艾伯特埃希菌的鑒定程序，包括基于eae基因pcr初篩、乳糖不發(fā)酵等特點的艾伯特埃希菌分離培養(yǎng)初篩程序；診斷性三重pcr、基于16srdna序列分析、mlst分析的艾伯特埃希菌的鑒定程序以及毒力基因、pfge和藥物敏感性實驗的生物學特性的研究分析程序。本發(fā)明利用了艾伯特埃希菌在低溫時仍能生長的特性，通過降低一次增菌的溫度至20℃，抑制了大腸桿菌的生長，此時艾伯特埃希菌成為該溫度下生長的優(yōu)勢菌，進而使得艾伯特埃希菌一次增菌中的菌體濃度提高6個滴度(10⁶)，以大大提高艾伯特埃希氏菌一次增菌的效率以及艾伯特埃希菌的檢出率，這為艾伯特埃希菌鑒定程序的建立打下基礎。

附圖說明

圖1顯示了不同溫度和不同稀釋倍數(shù)下艾伯特埃希菌pcr(eae基因)檢測結果，其中a:菌液生理鹽水；b:42℃培養(yǎng)24h；c:37℃培養(yǎng)24h；d:25℃培養(yǎng)24h；e:20℃培養(yǎng)24h；f:18℃培養(yǎng)24h；line1：原液；line2～line11：10^-1～10^-10稀釋濃度；陽性：艾伯特埃希菌陽性對照；陰性：不加dna模板對照；

圖2為艾伯特埃希菌的檢測流程圖；

圖3顯示了不同培養(yǎng)溫度下艾伯特埃希菌各稀釋度生長情況。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明人在總結歸納國外研究者艾伯特埃希菌的鑒定程序的基礎上，經(jīng)過反

復實驗驗證，建立了如下的艾伯特埃希菌的鑒定程序。

采集不同種類食品(生牛肉、生豬肉、生羊肉、生雞肉、生鴨肉、新鮮雞腸或新鮮鴨腸)25g+225mlec肉湯增菌液(按照1:10的重量百分比)；腹瀉患者、家禽家畜(雞、鴨、家養(yǎng)鴿子)、野生鳥類(白鷺、麻雀、燕子)糞便標本(3ml腦心-甘油肉湯保存液+2ml稀大便或2g干糞便混合)以上混合液+9mlec肉湯增菌液，于20℃培養(yǎng)18-26h。

取1ml上述ec肉湯增菌液，8000rpm離心3min集菌，棄上清；用150μl裂解液(100mmnacl，10mmtris-hcl[ph8.3]，1mmedta[ph9.0]，1％tritonx-100)懸菌，振蕩使沉淀充分混勻，水煮10min；12000rpm離心5min，取上清即為pcr反應模板。其中eae基因pcr初篩引物為eae-f:caggatcgccttttttatacg和eae-r:ctctgcagattaacctctgc進行pcr初篩；pcr反應體系為：在20μl體系中，2×taqmastermix10μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，純水7μl；pcr反應條件：預變性94℃2min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循環(huán)，最后延伸72℃5min，每次實驗均設有陰、陽性對照。利用pcr技術檢測各樣品增菌液pcr反應模板中是否具有艾伯特埃希菌已知毒力基因eae(479bp)，pcr產(chǎn)物以1.5wt％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果如圖1所示。從圖1中可以看出，42℃，24h培養(yǎng)條件下，pcr檢測陽性的最高稀釋度是10^-3，37℃，24h培養(yǎng)條件下陽性檢出的最高稀釋度為10^-5，25℃，24h培養(yǎng)條件下陽性檢出的最高稀釋度為10^-4，18℃，24h培養(yǎng)條件下陽性檢出的最高稀釋度為10^-5，20℃，24h培養(yǎng)條件下陽性檢出的最高稀釋度為10^-6。這說明20℃培養(yǎng)24h是艾伯特埃希菌的最佳一次增菌培養(yǎng)條件。且eae基因為陽性的樣品，表明其樣品增菌液中可能含有艾伯特埃希菌，吸取對應的ec肉湯增菌液2ml于2ml腦心-甘油肉湯保存液中，-80℃保存，以備后續(xù)進行菌株分離。

用接種環(huán)挑取3環(huán)上述初篩eae陽性增菌保存液，分離劃線于3個麥康凱平板上，36℃，24h；可疑菌落為在平板上呈凸起、邊緣整齊、無色(不發(fā)酵乳糖)的較大菌落。然后挑出不少于30個的可疑無色菌落，一部分作為pcr反應模板檢測eae基因；另一部分用于后續(xù)純培養(yǎng)。

接種eae陽性單菌落于營養(yǎng)瓊脂平板36℃純培養(yǎng)24h，純培養(yǎng)物分別接種于木糖和乳糖發(fā)酵管，并用軟瓊脂檢測動力，36℃培養(yǎng)，24h后觀察結果。

上述eae基因陽性、不發(fā)酵乳糖、不發(fā)酵木糖、動力陰性的菌落(eae基因陽性，是通過pcr檢測的，就是看1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳有沒有479bp那條帶，如圖1所示。不發(fā)酵乳糖、不發(fā)酵木糖就是接種了反應管不變色，由深紫色變成黃色。不發(fā)酵乳糖、不發(fā)酵木糖。動力陰性就是穿刺軟瓊脂沒有往外發(fā)散)可作為疑似艾伯特埃希菌。用10μl一次性無菌接種環(huán)挑取15mm純培養(yǎng)物菌苔于含有500μl去離子水的1.5ml離心管中重懸，煮沸10min，12000rpm離心3min，取上清液做pcr模板，用于后續(xù)分子生物學鑒定(診斷性三重pcr、mlst、16srdna)以及毒力基因、pfge和藥物敏感性實驗的生物學特性的研究分析程序。如圖2所示。

用艾伯特埃希菌標準菌株lmg20976(購自日本)接種腦心浸液瓊脂平板(購自青島海博)37℃培養(yǎng)18h，挑取單個菌落用10mlec肉湯37℃培養(yǎng)18h作為原液。原液用生理鹽水經(jīng)10倍倍比稀釋(10^-1-10^-10)，原液和每個稀釋度菌液7ml+2.5g大便(檢測不含艾伯特埃希菌)+63mlec肉湯增菌液(每1000ml中含：胰蛋白胨20.0g、乳糖5.0g、氯化鈉5.0g、磷酸氫二鉀4.0g、磷酸二氫鉀1.5g、三號膽鹽1.5g、ph值6.9±0.1)，每個稀釋度的稀釋樣品分別取10ml制成5個10^-1-10^-11的系列，在同等營養(yǎng)條件下分別放置于42℃、37℃、25℃、20℃和18℃中培養(yǎng)24h，模擬培養(yǎng)標本。模擬標本的制備方法如表1所示，培養(yǎng)結果如圖3所示。

表1：模擬標本的制備

從圖3中可以看出，艾伯特埃希菌在同等營養(yǎng)條件不同溫度下培養(yǎng)24h后，42℃、37℃和25℃條件下能長出不發(fā)酵乳糖的艾伯特埃希菌(無色菌落)的最高滴度為10^-3，在10^-4這一滴度就以紅色菌落為優(yōu)勢菌。而在稍低溫度下，20℃條件下的滴度能達到10^-10，18℃的滴度在10^-8。挑取無色的菌落做后續(xù)的艾伯特埃希菌鑒定，鑒定結果為陽性。說明艾伯特埃希菌一次增菌的最適生長溫度為20℃。

以下對后續(xù)分子生物學鑒定(診斷性三重pcr、mlst、16srdna)進行了詳細說明。

診斷性三重pcr鑒定：采用艾伯特埃希菌管家基因clpx、lysp和mdh建立的三重pcr檢測方法，如3個基因均陽性，可初步確認為艾伯特埃希菌。引物見表1。

表1診斷性三重pcr引物

pcr反應體系為：在50μl體系中，2×taqmastermix25μl，10μm上、下游引物各1μl，dna模板1μl，純水18μl。反應條件：預變性94℃5min，變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，35次循環(huán)，最后72℃延伸5min，每次擴增均設有陰、陽性對照。取上述pcr產(chǎn)物5μl，以1.5％瓊脂糖凝膠(含萬分之一核酸染料)進行電泳。

16srdna序列分析：擴增艾伯特埃希菌16srdna的引物為ea16s-f:ggatccagactttgatymtggctcag和ea16s-r:ccgtcaattcctttragttt。pcr反應體系為：在50μl體系中，2×taqmastermix25μl，10μm上、下游引物各2μl，dna模板2μl，純水19μl。pcr反應條件：預變性94℃，5min，變性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，45s，30次循環(huán)，最后72℃延伸7min，每次擴增均設有陽性和空白對照。

取pcr產(chǎn)物5μl以1.5％瓊脂糖凝膠(含萬分之一核酸染料)進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察是否擴增出目的大小片段，pcr產(chǎn)物均純化后進行測序。利用seqman軟件對測序結果進行峰圖查看，并在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行比對檢索，初步判斷結果。利用mega6.0軟件，以ncbi上公布的大腸埃希菌、志賀氏菌、費格森埃希菌等的16srdna序列為參考，采用neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹，進行分類位置分析。

多位點序列分型(mlst)分析：參照數(shù)據(jù)庫http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/ecoli/documents/primerscoli_html提供的大腸埃希菌mlst分型方案，選擇7個管家基因adk、fumc、gyrb、icd、mdh、pura、reca，pcr引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表2。

表27個管家基因擴增引物序列及產(chǎn)物大小

pcr反應體系為：在50μl體系中，2×taqmastermix25μl，10μm上、下游引物各2μl，dna模板2μl，純水19μl。pcr反應條件：預變性94℃，5min，變性94℃，30s，各管家基因退火溫度30s，延伸72℃，45s，30次循環(huán)，最后延伸7min，每次擴增均設空白和陽性對照。

取pcr產(chǎn)物5μl以1.5wt％瓊脂糖凝膠(含萬分之一核酸染料)進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察其大小片段，pcr產(chǎn)物均純化后進行測序。

利用seqman軟件對pcr產(chǎn)物序列與數(shù)據(jù)庫中的標準序列進行拼接和校正，校正后的序列上傳至e.colimlst數(shù)據(jù)庫中，確定菌株的等位基因型和序列型。利用mega6.0軟件neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹，與國際數(shù)據(jù)庫中已收錄的大腸埃希菌、志賀菌、艾伯特埃希菌和傷寒沙門菌進行聚類分析，確定艾伯特埃希菌種的鑒定。

以上，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書的保護范圍為準。