本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及水稻雄性不育基因osfignl1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物雄性不育多表現(xiàn)為雌蕊發(fā)育正常，雄配子敗育不能行使正常功能。水稻雄性不育材料在水稻雜種優(yōu)勢(shì)的利用和雜交水稻的培育中具有重大的應(yīng)用價(jià)值，大部分的雄性不育材料是由隱性核基因的突變導(dǎo)致，其不育性不受環(huán)境影響，且遺傳穩(wěn)定；且其中絕大多數(shù)受單基因控制。水稻隱性核不育基因的克隆及其表達(dá)調(diào)控的功能研究有助于我們對(duì)水稻雄性生殖發(fā)育過(guò)程的深入理解，還可為新型不育系材料的培育、新型雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑的創(chuàng)制奠定理論基礎(chǔ)和提供基因資源。

水稻的雄性生殖器官包含6枚雄蕊及其支撐結(jié)構(gòu)－－花絲。水稻雄蕊的發(fā)育涉及減數(shù)分裂、有絲分裂、絨氈層的發(fā)育和降解以及花粉囊壁各類物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，需要大量特異基因和非特異基因協(xié)調(diào)參與調(diào)控。雄配子在雄性生殖器官－－花藥中發(fā)育成熟，而水稻花藥發(fā)育導(dǎo)致的敗育主要表現(xiàn)為絨氈層發(fā)育和降解異常，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程染色體分裂行為異常和小孢子發(fā)育過(guò)程中花粉囊壁的合成缺陷等。這些復(fù)雜而有序的生物學(xué)過(guò)程最終決定了高等開(kāi)花植物花粉的育性。水稻花藥的發(fā)育涉及眾多基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，任何關(guān)鍵基因的突變均可導(dǎo)致花粉敗育，從而導(dǎo)致植株不育。而水稻花藥發(fā)育相關(guān)突變體是研究細(xì)胞分裂、分化和不育分子機(jī)理較為理想的材料，對(duì)其進(jìn)行的相關(guān)發(fā)育過(guò)程的表型分析及其突變基因的圖位克隆有助于人們對(duì)花藥發(fā)育與雄性不育的分子機(jī)理進(jìn)一步深入研究，也可為未來(lái)新型雜種優(yōu)勢(shì)的利用途徑提供基因資源和理論依據(jù)。

水稻花藥發(fā)育過(guò)程中，雄配子的減數(shù)分裂在花藥發(fā)育的早期進(jìn)行。在花藥發(fā)育的減數(shù)分裂階段，dna復(fù)制一次，隨后細(xì)胞進(jìn)行兩次分裂，形成染色體數(shù)目減少一半的四分體小孢子；小孢子發(fā)育經(jīng)過(guò)兩次有絲分裂形成成熟花粉粒，成熟花粉粒的兩個(gè)精細(xì)胞通過(guò)受精作用產(chǎn)生二倍體的孢子，從而保持物種染色體數(shù)的恒定。減數(shù)分裂的同源染色體發(fā)生交換、重組，使配子的遺傳多樣化。這個(gè)過(guò)程如果出現(xiàn)缺陷，會(huì)使小孢子發(fā)育異常，最后影響植株的育性。

fidgetin是第一個(gè)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的aaa蛋白，從而使人們對(duì)aaa蛋白在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育中的作用有了新的認(rèn)識(shí)。小鼠fidgetin基因突變導(dǎo)致小鼠眼睛變小，細(xì)胞周期延遲，視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞發(fā)育緩慢等發(fā)育障礙。fidegtin編碼減數(shù)分裂家族aaa(atpasesassociatedwithdiversecellularactivities)蛋白。蛋白質(zhì)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，fidgetin屬于aaa蛋白的第七亞家族成員即aaa減數(shù)分裂家族成員。目前，對(duì)fidgetin以及直系蛋白的功能研究較少。fidgetin參與微管切割以及微管末端的解聚，在有絲分裂紡錘體的結(jié)構(gòu)中起作用。在小鼠中，根據(jù)序列同源性人們已經(jīng)鑒定了與fidgetin同源的兩個(gè)基因，fidgetin-like1(fignl1)和fidgetin-like2(fignl2)。fidgetin-like1抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化。研究表明小鼠fidgetin-like1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)，在減數(shù)分裂中起重要作用。對(duì)線蟲(chóng)fignl1的aaa結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲(chóng)fignl1的aaa結(jié)構(gòu)域可以形成六聚體的環(huán)形結(jié)構(gòu)并具有很高的atpase活性。線蟲(chóng)fidgetin-like1定位于細(xì)胞核，酵母雙雜和pulldown實(shí)驗(yàn)證明fidgetin-like1與ubiquitin-likemodifier(smo-1)相互作用。fidgetin-like1和smo-1的相互結(jié)合在線蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。fidgetin-like1和smo-1的單突變體都會(huì)導(dǎo)致線蟲(chóng)性腺形成缺陷和不育表型。擬南芥atfignl1基因的突變后導(dǎo)致在全基因組水平上染色體的交換頻率增加。研究報(bào)道人類fignl1基因是同源重組體細(xì)胞dna修復(fù)所必須。

在水稻中，osfignl1基因的相關(guān)研究迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。分離克隆水稻osfignl1基因，探討osfignl1基因突變導(dǎo)致水稻雄性不育的原因，闡明水稻雄性不育突變體雄配子敗育的分子機(jī)制，將進(jìn)一步深化人們對(duì)雄性不育分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，將雄性不育基因應(yīng)用于水稻品種的改良，對(duì)育種工作者具有重要的實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供水稻雄性不育基因osfignl1及其編碼的蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供水稻雄性不育基因osfignl1在水稻品種改良中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明在通過(guò)⁶⁰co-γ誘變獲得的遺傳穩(wěn)定的雄性不育突變體(水稻雄性不育突變體fignl1)中，圖位克隆獲得一個(gè)水稻雄性不育基因osfignl1，基因osfignl1為：

i)seqidno：1所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno：1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

iii)在嚴(yán)格條件下與seqidno：1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴(yán)格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

基因osfignl1的cdna序列如seqidno：2所示。

本發(fā)明的基因osfignl1及其cdna序列亦可通過(guò)人工合成的方式得到。

當(dāng)seqidno：1所示序列的第2467位堿基為a，或seqidno：2所示序列的第515位堿基為a時(shí)，基因osfignl1編碼的蛋白的氨基酸序列如seqidno：3所示。

當(dāng)seqidno：1所示序列的第2467位堿基缺失，或seqidno：2所示序列的第515位堿基缺失時(shí)，基因osfignl1編碼的蛋白的氨基酸序列如seqidno：4所示。

本發(fā)明還提供表達(dá)盒、表達(dá)載體或克隆載體，其包括包含所述基因osfignl1的核酸序列。

本發(fā)明還提供含有所述基因osfignl1、或者所述表達(dá)盒、表達(dá)載體或克隆載體的工程菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

攜帶有所述目的基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463頁(yè)；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本發(fā)明還提供所述基因osfignl1在水稻品種改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述基因osfignl1在水稻雜種優(yōu)勢(shì)培育新品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述基因osfignl1在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增所述基因osfignl1的特異性pcr引物對(duì)，所述引物對(duì)的上、下游引物序列分別如seqidno：5、6所示。

本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增所述基因osfignl1cdna序列的特異性pcr引物對(duì)，所述引物對(duì)的上、下游引物序列分別如seqidno：7、8所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提供可用于包括啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子以及終止子的osfignl1全長(zhǎng)基因組dnapcr擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建的引物對(duì)，所述引物對(duì)的上、下游引物序列分別如seqidno：9、10所示。

本發(fā)明首次成功克隆出一個(gè)水稻雄性不育基因osfignl1。通過(guò)⁶⁰co-γ誘變獲得一個(gè)osfignl1功能缺失突變體，該突變體在大田種植環(huán)境中表現(xiàn)出植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)正常，植株雄性不育，花粉100％碘敗，雌配子發(fā)育不受影響。減數(shù)分裂壓片顯示，由于osfignl1功能缺失嚴(yán)重影響了減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的行為，最終導(dǎo)致小孢子發(fā)育缺陷。該突變體可應(yīng)用于水稻雜種優(yōu)勢(shì)新品種的培育?；騩sfignl1今后可作為一個(gè)水稻減數(shù)分裂調(diào)控的功能基因應(yīng)用于水稻雜種優(yōu)勢(shì)創(chuàng)制工作中，具有巨大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中野生型中恢8015和突變體fignl1主要表型鑒定結(jié)果；其中，a為抽穗后的野生型中恢8015植株和突變體fignl1植株，b為成熟期，野生型中恢8015的稻穗和突變體fignl1稻穗，c為去掉內(nèi)外稃，野生型中恢8015的小花，d為去掉內(nèi)外稃，突變體fignl1的小花，e為野生型中恢8015的成熟花粉，f為突變體fignl1的成熟花粉。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中野生型中恢8015和突變體fignl1花藥發(fā)育過(guò)程半薄切片觀察結(jié)果；其中，中恢8015：a、b、c、d、i、j、k，fignl1突變體：e、f、g、h、l、m、n。a、e：小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，b、f：四分體時(shí)期，c、g：?jiǎn)魏似?，d、h：小孢子液泡化時(shí)期，i、l：二孢花粉時(shí)期，j、m：成熟花粉時(shí)期，k、n：花藥開(kāi)裂時(shí)期。e：表皮，en：內(nèi)壁，t：絨氈層，msp：小孢子，ms：小孢子母細(xì)胞，st：藥隔，mp：成熟花粉，dp：缺陷花粉。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中野生型中恢8015和突變體fignl1成熟花藥掃描電鏡觀察結(jié)果；其中，a為野生型成熟花藥，b為野生型中恢8015成熟花藥粒，c為野生型中恢8015花藥表皮，d為野生型中恢8015花藥內(nèi)壁，e為野生型中恢8015花粉外壁，f為突變體fignl1成熟花藥，g為突變體fignl1成熟花粉粒，h為突變體fignl1花藥表皮，i為突變體fignl1花藥內(nèi)壁，j為突變體fignl1花粉外壁。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中野生型中恢8015雄配子減數(shù)分裂染色體觀察結(jié)果；其中，a為細(xì)線期，b為偶線期，c為粗線期，d為雙線期，e為終變期，f為中期i，g為后期i，h為二分體，i為末期ii，j為四分體。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中fignl1突變體雄配子減數(shù)分裂染色體觀察結(jié)果；其中，a為細(xì)線期，b為偶線期，c為粗線期，d、e為雙線期，可見(jiàn)染色體橋，箭頭所示，f、g為終變期，可見(jiàn)纏繞的染色體和染色體橋，箭頭所示，h、i為中期i，可見(jiàn)染色體橋，箭頭所示染色體不能排列在赤道板，j、k為后期i，箭頭所示黏著染色體和染色體碎片，l為中期ii，m為后期ii，n為末期ii，o為四分體時(shí)期，中期ii(l)到四分體(o)，可見(jiàn)落后染色體，箭頭所示。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中野生型中恢8015及突變體osfignl1基因序列比對(duì)結(jié)果。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例6中轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)材料表型鑒定結(jié)果；其中，a為野生型中恢8015成熟穗子(左)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株的成熟穗子(右)，b為去掉內(nèi)外稃，野生型中恢8015植株小花(左)、互補(bǔ)植株小花(中)和突變體fignl1植株小花(右)，c為野生型中恢8015花粉粒，d為互補(bǔ)植株花粉粒，e為突變體fignl1植株花粉粒。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

以下實(shí)施例中所用方法為常規(guī)方法；所用引物均由invitrogen公司合成；測(cè)序由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行；各種dna限制性內(nèi)切酶購(gòu)于thermoscientific公司；dna純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)于promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司，使用方法參照說(shuō)明書(shū)。

本發(fā)明中涉及的水稻雄性不育突變體fignl1現(xiàn)已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)cctccno：p201710，保藏日期2017年5月17日。

實(shí)施例1水稻雄性不育突變體fignl1表型鑒定

水稻雄性不育突變體fignl1是經(jīng)⁶⁰co-γ輻射秈稻品種中恢8015(zh8015)得到不育突變體。fignl1突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段與野生型無(wú)明顯差異，在株高、分蘗等株型性狀均無(wú)任何異常。在生殖生長(zhǎng)階段，野生型小花和突變體小花的內(nèi)外稃、雌蕊、槳片并無(wú)明顯差異。然而，野生型中恢8015成熟花藥肥大，花藥呈黃色、飽滿充實(shí)，與野生型相比，突變體fignl1的花藥瘦小，略黃、抽穗后用1％i2-ki對(duì)成熟花粉進(jìn)行染色，可觀察到突變體的花粉未染上顏色，形態(tài)不規(guī)則，觀察不同視野的花粉粒，發(fā)現(xiàn)突變體花粉呈現(xiàn)完全碘敗，而野生型花粉染色正常。至水稻成熟期，野生型植株正常結(jié)籽，而突變體植株不結(jié)實(shí)(圖1a～f)。

實(shí)施例2fignl1突變體花藥發(fā)育過(guò)程半薄切片觀察

取大田生長(zhǎng)的水稻fignl1突變體及野生型不同發(fā)育時(shí)期的穗子，較大的穗子用剪刀剪開(kāi)一個(gè)小口，有利于滲透液的滲入。樣品于50％faa固定液(50％乙醇∶甲醛∶冰乙酸＝90∶5∶5)中固定，用真空泵緩慢抽氣30分鐘，樣品沉到瓶底，更換新配置的50％faa固定液，室溫放置16-24小時(shí)。在faa固定液中，樣品可以保存三個(gè)月之久。若要長(zhǎng)期保存，可將固定液換成70％乙醇室溫保存。根據(jù)穎花長(zhǎng)度，將材料分別保存。在70％酒精中用鑷子去掉穎花的內(nèi)外稃，存放于青霉素小瓶中。酒精梯度脫水：50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇，室溫下每級(jí)60分鐘。100％飽和番紅中浸泡2個(gè)小時(shí)。經(jīng)梯度酒精脫水后放入樹(shù)脂滲透液中室溫1-2小時(shí)，之后于樹(shù)脂滲透液中4℃過(guò)夜?jié)B透。將樣品放入包埋板中，花藥一端朝向包埋盒兩端，在包埋板中加入聚合液，要求5分鐘之內(nèi)操作完成，以免聚合液凝固。放入65℃烤片機(jī)中2小時(shí)，稍微凝固后放入37℃烘箱中，聚合3-4天，直到包埋塊變硬。用刀片將含有花藥的包埋塊修塊，修塊盡量小，用leicarm2265全自動(dòng)超薄切片機(jī)橫切花藥，切片厚度2m。在載玻片上滴加少許蒸餾水，將切片材料在蒸餾水中展片，等完全展片后，吸走蒸餾水，將載玻片放到烤片機(jī)上烘干。在烘干的載玻片上加入甲苯胺藍(lán)染色30分鐘，在載玻片樣品的背面水洗晾干，即可用普通顯微鏡拍照觀察。野生型中恢8015和fignl1突變體不同發(fā)育時(shí)期花藥半薄切片分析表明：在小孢子母細(xì)胞時(shí)期，在形態(tài)上，野生型中恢8015和fignl1突變體的花藥壁從外到內(nèi)，依次為外層、內(nèi)層、中間層、絨氈層無(wú)明顯差異，囊腔充滿處于減數(shù)分裂的花粉母細(xì)胞也無(wú)明顯差異。fignl1突變體絨氈層在小孢子大液泡后期發(fā)育不正常，降解速度緩慢。小孢子在大液泡時(shí)期形態(tài)開(kāi)始發(fā)生異常，在成熟花藥中，花藥的內(nèi)壁殘存一層沒(méi)有任何填充物絨氈層細(xì)胞，絨氈層并沒(méi)有完全降解，在藥室內(nèi)出現(xiàn)畸形和嚴(yán)重變形的小孢子(圖2a～n)。

實(shí)施例3fignl1突變體成熟花藥掃描電鏡觀察

將野生型中恢8015和fignl1突變體成熟花藥放置于2.5％的戊二醛中，緩慢抽真空，直到樣品沉入管底，4℃冰箱固定過(guò)夜，第二天早晨如下步驟操作：將固定液倒掉，花藥樣品用磷酸緩沖液(0.1m，ph7.0)洗滌三次，每次20分鐘；用1％餓酸溶液固定樣品1.5小時(shí)，花藥樣品染成黑色；倒掉餓酸廢液，花藥樣品用磷酸緩沖液(0.1m，ph7.0)洗滌三次，每次20分鐘；對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，經(jīng)過(guò)梯度30％、50％、70％、80％、90％和95％酒精分別脫水10-15分鐘后，再用100％乙醇處理2次，每次20分鐘；用乙酸異戊酯處理樣品過(guò)夜，c02臨界點(diǎn)干燥，鍍膜后，樣品在(tm-1000hitachi)型掃描電鏡下觀察、照相并記錄結(jié)果。掃描電鏡結(jié)果顯示：野生型中恢8015花藥能夠形成正常的圓形花粉粒，可見(jiàn)萌發(fā)孔，與野生型中恢8015成熟花粉相比，fignl1突變體的花粉呈現(xiàn)皺縮、塌陷的形態(tài)，突變體花藥外壁更致密。野生型中恢8015花藥內(nèi)壁覆蓋著大量烏氏體，而fignl1突變體花藥內(nèi)壁結(jié)構(gòu)凌亂，不能觀察到有規(guī)則排列的烏氏體，明顯呈現(xiàn)出異常形態(tài)。野生型中恢8015花粉外壁覆蓋一層孢粉素，花粉外壁呈現(xiàn)環(huán)狀突起，而突變體fignl1花粉外壁雜亂無(wú)章，無(wú)明顯類似野生型的環(huán)狀突起。與野生型中恢8015相比，fignl1突變體花粉粒不規(guī)則，花粉內(nèi)部無(wú)淀粉粒、精細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞；fignl1突變體花粉內(nèi)外壁發(fā)育異常，基足層和覆蓋層更肥厚(圖3a～j)。

實(shí)施例4fignl1突變體雄配子減數(shù)分裂染色體觀察

野生型中恢8015和突變體fignl1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期染色體制備；田間收集野生型中恢8015和突變體fignl1減數(shù)分裂時(shí)期適當(dāng)?shù)挠姿耄每ㄖZ固定液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸＝3∶1)進(jìn)行固定，用真空泵緩慢抽氣30分鐘，樣品沉到瓶底，更換新鮮的卡諾固定液室溫放置24小時(shí)；挑選時(shí)期適當(dāng)?shù)乃痉f花于載玻片上，用解刨針將花藥挑出，滴加一滴醋酸洋紅，用解剖針針尖迅速將花藥搗碎，從而釋放出花粉母細(xì)胞，將載玻片置于相差顯微鏡下觀察，以挑選處于減數(shù)分裂時(shí)期的花粉母細(xì)胞；選取花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂不同時(shí)期的花藥，再滴加適量的醋酸洋紅后，蓋上蓋玻片并用鑷子的另一端或者大拇指垂直方向輕壓蓋玻片；在酒精燈火焰上方瞬時(shí)烘烤載玻片后，在載玻片一測(cè)滴加適量45％醋酸，在載玻片的另一側(cè)放置一張吸水濾紙。通過(guò)濾紙吸水作用將醋酸洋紅吸干凈；將載玻片置于酒精燈火焰上方瞬時(shí)烘烤至燙手但未沸騰為止；將載玻片冷卻，在液氮浸泡中30秒，取出載玻片用刀片迅速揭去蓋玻片晾干，依次經(jīng)酒精梯度脫水(70％、90％、100％)，取出載玻片，晾干待用。每張載玻片滴加約10μl(工作液濃度為10μg/ml)dapi(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)細(xì)胞核染色液，蓋上蓋玻片，注意不能有氣泡，黑暗5分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。細(xì)胞學(xué)觀察表明：fignl1突變體在減數(shù)分裂粗線期出現(xiàn)細(xì)絲狀染色體，在終變期出現(xiàn)大量的相互纏繞的多價(jià)染色體、畸形染色體并且出現(xiàn)染色體橋。在減數(shù)分裂中期出現(xiàn)未配對(duì)的染色體和染色體橋。在第二次減數(shù)分裂過(guò)程中fignl1突變體的性母細(xì)胞中出現(xiàn)染色體碎片和落后的染色體，并且在四分體中能夠觀察到微核的存在，最終導(dǎo)致fignl1突變體不能形成有規(guī)則的四分體結(jié)構(gòu)(圖4a～j、圖5a～0)。

實(shí)施例5osfignl1基因的圖位克隆

中恢8015經(jīng)⁶⁰co-γ誘變得到穩(wěn)定的不育突變體fignl1為母本，以中花11為父本，進(jìn)行雜交得到f1代，f1代自交后產(chǎn)生的f2代中具有fignl1突變體表型的植株被用來(lái)定位基因。f2種植于中國(guó)水稻研究所試驗(yàn)田，抽穗后觀察f2群體分離出的隱性單株花藥表型，取花粉敗育植株的新鮮葉片，采用ctab法提取水稻總dna。用均勻分布于水稻12條染色體上的ssr引物和indel引物檢測(cè)中花11和中恢8015的多態(tài)性，中花11和中恢8015在水稻12條染色體上有多態(tài)的引物有97個(gè)，用這些有多態(tài)性引物分析兩個(gè)親本和f2群體中8個(gè)隱性突變體，發(fā)現(xiàn)位于第12號(hào)染色體上的rm27877和indel162分子標(biāo)記與不育表型存在較明顯的連鎖。利用f2群體中80個(gè)隱性單株，將osfignl1目的基因初步定位在水稻12號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，位于分子標(biāo)記rm27877和indell62之間，跨越著絲粒，物理距離約35.7mb。初定位之后擴(kuò)大遺傳群體，根據(jù)水稻不育基因的初步定位結(jié)果，同時(shí)利用數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的日本晴和9311的序列信息，繼續(xù)開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)新的多態(tài)性indel分子標(biāo)記，進(jìn)一步用f2、f3群體中2300個(gè)隱性單株進(jìn)行精細(xì)定位，最終將osfignl1定位在12染色體短臂新開(kāi)發(fā)的indel分子標(biāo)記s7和s8之間，兩個(gè)標(biāo)記間的物理距離約250kb，定位區(qū)間內(nèi)包含12個(gè)開(kāi)放閱讀框。應(yīng)用引物：rs6-f：cggcccatatagaaagccca，rs-r：tgtgcagacacaactacccc分別擴(kuò)增野生型中恢8015以及fignl1突變體中osfignl1dna序列，通過(guò)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)：與野生型中恢8015相比，fignl1突變體在os12g0443800.1的第三個(gè)外顯子存在一個(gè)單堿基a的缺失，導(dǎo)致所編碼蛋白在第187位氨基酸處發(fā)生翻譯提前終止。

野生型中恢8015及突變體osfignl1基因序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖6。

實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證osfignl1基因功能

以野生型中恢8015基因組為模板，以1300-osfignl1-f：ccatgattacgaattcagtgctagcgagggtcagat，1300-osfignl1-r：taccgagctcgaattccttctcactcaccgttgcct為引物，通過(guò)kod-fx酶擴(kuò)增出野生型中恢8015基因組dna片段，包括osfignl1完整的orf，起始密碼子上游2450bp和終止密碼子下游1200bp序列。基因osfignl1的核苷酸序列及其cdna序列分別如seqidno：1和2所示。

引物5’端含有pcambia1300載體ecori酶切位點(diǎn)附近的序列。應(yīng)用clontech公司in-fusionhdcloning試劑盒(貨號(hào)：pt5162-1)，將回收產(chǎn)物插入到經(jīng)過(guò)ecori消化后的線性化載體pcambia1300(具體使用參照說(shuō)明書(shū))。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a感受態(tài)，并涂布于含有50mg/l卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上，放置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長(zhǎng)出均勻分布的單菌落后，挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)菌液pcr擴(kuò)增、質(zhì)粒酶切鑒定、測(cè)序等檢測(cè)程序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pcambia1300-osfignl1。

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目標(biāo)載體轉(zhuǎn)入水稻突變型fignl1受體中。水稻突變型fignl1受體為誘導(dǎo)雜合基因型種子分離出fignl1純合基因型種子的愈傷，測(cè)序挑選出fignl1基因型的愈傷。通過(guò)pcr轉(zhuǎn)基因鑒定，總共得到3棵轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。表型鑒定結(jié)果顯示：在大田生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株正常狀態(tài)和野生型中恢8015無(wú)明顯差異。至水稻抽穗期時(shí)花藥成熟，取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株花藥，成熟花粉粒碘化鉀染色可以看出，花粉粒成功染色，說(shuō)明fignl1突變體的花粉育性得以恢復(fù)。由此表明，osfignl1基因控制水稻育性，突變體雄性不育表型是確系由osfignl1功能性缺失引起(圖7a～e)。

以上結(jié)果充分說(shuō)明osfignl1是一個(gè)水稻育性基因，在水稻減數(shù)分裂過(guò)程中起主要作用。通過(guò)誘變分離得到一個(gè)雄性不育性狀穩(wěn)定的fignl1突變體，該突變體的表型不同于以前報(bào)道的減數(shù)分裂突變體，為研究減數(shù)分裂同源重組機(jī)制提供了一種的優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)也為雜交育種工作提供了一種新的材料?；騩sfignl1今后可作為一個(gè)水稻減數(shù)分裂調(diào)控的功能基因應(yīng)用于水稻雜種優(yōu)勢(shì)創(chuàng)制工作中，具有巨大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國(guó)水稻研究所

<120>水稻雄性不育基因osfignl1及其應(yīng)用

<130>pi201710402

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>7632

<212>dna

<213>水稻

<220>

<221>misc_feature

<222>(2467)..(2467)

<223>n=a或堿基缺失

<400>1

atggcggagcagtctcacgccggcgacggcggcggcggcggcgcgggctccggggagccg60

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