本發(fā)明涉及生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒、方法及二者的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人是2倍體生物(diploidgenome)，大多數(shù)的基因只有兩個拷貝，但是也有一些基因具有多個拷貝。多拷貝的基因在不同的人身上具有拷貝數(shù)的變異，如defb1-3基因，在高加索人身上其拷貝數(shù)的變異在2-12之間，方向明課題組發(fā)現(xiàn)中國人defa1-3基因拷貝數(shù)的變異在2-16之間。目前研究發(fā)現(xiàn)defa1-3基因拷貝數(shù)的變異與人疾病發(fā)展預(yù)后可能相關(guān)，尤其是感染性疾病。目前經(jīng)常用到的測量基因拷貝數(shù)的方法有三種即qpcr，paralogratiotest(prt)和multiplexligation-dependentprobeamplification(mlpa)。它們在具體設(shè)計上有所不同，但是都用到的一個原理就是把defa1-3測得的基因數(shù)量與一個或者多個拷貝數(shù)沒有變異的基因數(shù)量做比較，以此推斷defa1-3拷貝數(shù)。前期有學(xué)者的研究比較上述三種方法，發(fā)現(xiàn)mlpa是這三種方法里最準確，最可靠的方法，但是它的缺點就是方法復(fù)雜，耗時長，測量一個標本的費用比較高。mlpa的原理是利用雜交探針的方法擴增defa1-3以及其他30基因片段，然后通過比較defa1-3片段與其他基因片段在擴增后產(chǎn)物的量來計算defa1-3拷貝數(shù)。因此，開發(fā)一種方法簡便、耗時短、成本低，并且準確可靠的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的方法尤為重要。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，本發(fā)明的第二個目的在于提供上述試劑盒在測定defa1-3基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個目的在于提供一種defa1-3基因拷貝數(shù)的測定方法，本發(fā)明的第四個目的在于提供上述測定方法在測定defa1-3基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的測定defa1-3拷貝數(shù)方法復(fù)雜，耗時長，費用高的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，所述試劑盒包括：微滴數(shù)字pcr檢測試劑以及微滴發(fā)生卡；所述微滴數(shù)字pcr檢測試劑包括預(yù)混液，所述預(yù)混液包括特異性檢測defa1-3基因的引物及探針；所述特異性檢測defa1-3基因的上下游引物分別為：defa1-3-f：5'-ccgtccttccctctagacttagc-3'(seqidno.1)；defa1-3-r：5'-gagcagattgcagcggacat-3'(seqidno.2)；所述特異性檢測defa1-3基因的探針為：fam-actgctaactccatactc-mgb(seqidno.3)。進一步地，所述預(yù)混液還包括2×ddpcrsupermixforprobes和rnasefreedh2o。進一步地，所述預(yù)混液中2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探針和rnasefreedh2o的體積比為55-65：10-20：10-20：1-10：20-30。進一步地，所述微滴數(shù)字pcr檢測試劑還包括rnasefreedh2o、微滴發(fā)生油、2×質(zhì)控液、陽性對照、陰性對照、10×cutsmartbuffer以及限制性內(nèi)切酶。進一步地，所述陽性對照包括已知拷貝數(shù)為2，4，6，8，10，12，14，16的樣品。進一步地，所述微滴數(shù)字pcr檢測試劑中rnasefreedh2o、預(yù)混液、微滴發(fā)生油、2×質(zhì)控液、陽性對照、陰性對照、10×cutsmartbuffer以及限制性內(nèi)切酶的體積比為250-350：200-250：800-1200：500-700：80-120：8-16：250-350：0.5-2。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在測定defa1-3基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種defa1-3基因拷貝數(shù)的測定方法，應(yīng)用上述的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒。進一步地，所述測定方法包括如下步驟：步驟(a)：處理樣本dna；步驟(b)：制備微滴數(shù)字pcr反應(yīng)液，所述微滴數(shù)字pcr反應(yīng)液包括待測樣本反應(yīng)液和空白對照反應(yīng)液，所述待測樣本反應(yīng)液包括所述步驟(a)中處理后的樣本dna；步驟(c)：將所述步驟(b)中的待測樣本反應(yīng)液和空白對照反應(yīng)液分別加入所述微滴發(fā)生卡中間的孔內(nèi)；步驟(d)：在所述微滴發(fā)生卡下部的孔內(nèi)加入微滴發(fā)生油，并密封；步驟(e)：將所述微滴發(fā)生卡置于微滴生成儀中生成微滴，所述微滴生成于所述微滴發(fā)生卡上部的孔內(nèi)；步驟(f)：取所述微滴，并進行pcr反應(yīng)；步驟(g)：對完成所述pcr反應(yīng)的微滴進行檢測分析，得到所述基因拷貝數(shù)。另外，本發(fā)明還提供了上述的測定方法在測定defa1-3基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，包括微滴數(shù)字pcr檢測試劑以及微滴發(fā)生卡，其中，微滴數(shù)字pcr檢測試劑包括預(yù)混液，預(yù)混液包括特異性檢測defa1-3基因的引物及探針。本發(fā)明提供的試劑盒具有高靈敏度、高準確度、高精確性、高可重復(fù)性的優(yōu)點。本發(fā)明提供的defa1-3基因拷貝數(shù)的測定方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，具有操作方法簡便，快速、敏感、準確的優(yōu)點。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。目前，經(jīng)常用到的測量基因拷貝數(shù)的方法有三種即qpcr，prt和mlpa，其中，mlpa是這三種方法里最準確，最可靠的方法，但是它的缺點就是方法復(fù)雜，耗時長，測量一個標本的費用比較高。因此，針對上述問題，本發(fā)明提供了一種測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，包括：微滴數(shù)字pcr檢測試劑以及微滴發(fā)生卡；微滴數(shù)字pcr檢測試劑包括預(yù)混液，預(yù)混液包括特異性檢測defa1-3基因的引物及探針；其中，特異性檢測defa1-3基因的上下游引物分別為：defa1-3-f：5'-ccgtccttccctctagacttagc-3'(seqidno.1)；defa1-3-r：5'-gagcagattgcagcggacat-3'(seqidno.2)；特異性檢測defa1-3基因的探針為：fam-actgctaactccatactc-mgb(seqidno.3)。微滴數(shù)字pcr(dropletdigitalpcr)，這種方法是將配好的pcr反應(yīng)液用與油通過高壓的方法變成上萬滴的微小水油混合滴，pcr反應(yīng)在此微小滴里發(fā)生，反應(yīng)結(jié)束以后機器會讀取熒光陽性滴的多少，然后程序里的泊松分布方法可以被用以測量核酸序列的濃度。應(yīng)用該方法測定基因拷貝數(shù)，能夠緩解依靠傳統(tǒng)定量pcr方法不能達到分辨效果的問題，對遺傳病、癌癥、感染性疾病的研究提供了一種全新的技術(shù)思路與手段。在本發(fā)明中，defa1-3基因為人defa1-3基因。在本發(fā)明中，預(yù)混液還包括2×ddpcrsupermixforprobes和rnasefreedh2o。在本發(fā)明中，預(yù)混液中2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探針和rnasefreedh2o的體積比為55-65：10-20：10-20：1-10：20-30。其中，2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探針和rnasefreedh2o的體積比例如可以為，但不限于55：10：10：1：20、60：15：15：5：25或者65：20：20：10：30。在一個優(yōu)選的實施方式中，2×ddpcrsupermixforprobes、defa1-3-f、defa1-3-r、探針和rnasefreedh2o的體積比為60：15：15：5：25。其中，defa1-3-f、defa1-3-r和探針的濃度均為10μm。在本發(fā)明中，微滴數(shù)字pcr檢測試劑還包括rnasefreedh2o、微滴發(fā)生油、2×質(zhì)控液、陽性對照、陰性對照、10×cutsmartbuffer以及限制性內(nèi)切酶。其中，微滴發(fā)生油為探針法ddpcr微滴發(fā)生油，2×質(zhì)控液為2×ddpcr探針法質(zhì)控液，陽性對照包括已知拷貝數(shù)為2，4，6，8，10，12，14，16的樣品，陰性對照為rnasefreedh2o，限制性內(nèi)切酶為msel酶。選擇已知拷貝數(shù)為2，4，6，8，10，12，14，16的陽性模板，使用0.01mph8.0的tris-edta緩沖液稀釋后冷凍保存，將檢驗合格的陽性對照制劑定量分裝。其中，檢驗陽性對照是否合格的方法為：采用實時熒光定量pcr，利用目的基因defa1-3和內(nèi)參基因alb的熒光定量pcr檢驗陽性對照的拷貝數(shù)為2，4，6，8，10，12，14，16，熒光定量pcr反應(yīng)條件為95℃，3min；95℃30s；54℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；72℃1min。在本發(fā)明中，微滴數(shù)字pcr檢測試劑中rnasefreedh2o、預(yù)混液、微滴發(fā)生油、2×質(zhì)控液、陽性對照、陰性對照、10×cutsmartbuffer以及限制性內(nèi)切酶的體積比為250-350：200-250：800-1200：500-700：80-120：8-16：250-350：0.5-2。其中，rnasefreedh2o、預(yù)混液、微滴發(fā)生油、2×質(zhì)控液、陽性對照、陰性對照、10×cutsmartbuffer以及限制性內(nèi)切酶的體積比例如可以為，但不限于250：200：800：500：80：8：250：0.5、300：225：1000：600：100：12：300：1或者350：250：1200：700：120：16：350：2。在一個優(yōu)選的實施方式中，rnasefreedh2o、預(yù)混液、微滴發(fā)生油、2×質(zhì)控液、陽性對照、陰性對照、10×cutsmartbuffer以及限制性內(nèi)切酶的體積比為300：225：1000：600：100：12：300：1。在本發(fā)明中，測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒中的各試劑用合適的外包裝盒包裝，貼標簽標示名稱、批號、生產(chǎn)日期、有效期。本發(fā)明提供的試劑盒具有高靈敏度、高準確度、高精確性、高可重復(fù)性的優(yōu)點。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在測定defa1-3基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種defa1-3基因拷貝數(shù)的測定方法，應(yīng)用上述的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒。在本發(fā)明中，測定方法包括如下步驟：步驟(a)：處理樣本dna；其中，單個dna樣本處理體系組成為：ddh2o20.3μl；10×cutsmartbuffer2.5μl；msel酶0.2μl；樣本dna2μl(50ng左右)。配置完成后，37℃，60min后，65℃，20minpcr儀器中進行酶切反應(yīng)。步驟(b)：制備微滴數(shù)字pcr反應(yīng)液，微滴數(shù)字pcr反應(yīng)液包括待測樣本反應(yīng)液和空白對照反應(yīng)液，待測樣本反應(yīng)液包括步驟(a)中處理后的樣本dna；其中，待測樣本反應(yīng)液和空白對照反應(yīng)液的體積分別為20μl，待測樣本反應(yīng)液包括18μl的預(yù)混液和處理后的樣本dna；步驟(c)：將步驟(b)中的待測樣本反應(yīng)液和空白對照反應(yīng)液分別加入微滴發(fā)生卡中間的8個孔內(nèi)，不足8個樣品時用20μl1×ddpcr探針法質(zhì)控液補足；步驟(d)：在微滴發(fā)生卡下部的8個孔內(nèi)各加入70μl微滴發(fā)生油，并蓋膠墊密封；步驟(e)：將微滴發(fā)生卡置于微滴生成儀中生成微滴，微滴生成于微滴發(fā)生卡上部的孔內(nèi)；步驟(f)：取40μl生成的微滴，加入96孔板中，封膜，并進行pcr反應(yīng)；其中，pcr反應(yīng)條件為：預(yù)變性：溫度96℃10min，1個循環(huán)；變性：溫度98℃30s，退火：溫度58℃45s，共40個循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)：溫度98℃10min，1個循環(huán)；其中，pcr反應(yīng)儀升降溫速度小于2.5℃/秒；步驟(g)：對完成pcr反應(yīng)的96孔板放入plateholder中組裝好，之后放入微滴讀取儀中，打開quantasoft軟件，對微滴進行檢測分析，得到待測基因拷貝數(shù)。本發(fā)明提供的defa1-3基因拷貝數(shù)的測定方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，具有操作方法簡便，快速、敏感、準確的優(yōu)點。另外，本發(fā)明還提供了上述的測定方法在測定defa1-3基因拷貝數(shù)中的應(yīng)用。為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實施例詳細介紹如下。實施例1引物及探針的設(shè)計與篩選根據(jù)genbank中目的基因defa1-3相應(yīng)序列(編號：mgi:mgi:99588)，選擇長度為50～150bp的保守片段、采用primerexpress2.0軟件設(shè)計特異性探針和引物，最終選擇靈敏度最高、特異性強的目的基因的探針和引物進行實驗。所得到的特異性檢測defa1-3基因的上下游引物分別為：defa1-3-f：5'-ccgtccttccctctagacttagc-3'(seqidno.1)；defa1-3-r：5'-gagcagattgcagcggacat-3'(seqidno.2)；特異性檢測defa1-3基因的探針為：fam-actgctaactccatactc-mgb(seqidno.3)。實施例2試劑盒的選擇及試劑的預(yù)處理選擇本發(fā)明提供的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒，包括微滴數(shù)字pcr檢測試劑以及微滴發(fā)生卡。其中，微滴數(shù)字pcr檢測試劑包括rnasefreedh2o，1支，1.2ml；ddpcr探針法預(yù)混液，一支，1.1ml；探針法ddpcr微滴發(fā)生油，一支，4ml；2×ddpcr探針法質(zhì)控液，2.4ml；陽性對照，已知拷貝數(shù)為2，4，6，8，10，12，14，16的樣品各一支，每支40μl；陰性對照(rnasefreedh2o)，一支，48μl；10×cutsmartbuffer1.2ml；msel酶一支，40單位(4μl)。選擇已知拷貝數(shù)為2，4，6，8，10，12，14，16的陽性模板，使用0.01mph8.0的tris-edta緩沖液稀釋100倍后，于-80℃冷凍保存，將檢驗合格的陽性對照制劑按400μl定量分裝。ddpcr探針法預(yù)混液其1.1ml的組成為：600μl的2×ddpcrsupermixforprobes，上、下游引物分別為150μl，特異探針為50μl，引物和探針的濃度均為10μm，rnasefreedh2o250μl。實施例3待測樣本的提取和處理隨機選擇15例危重病人和5例健康人從外周靜脈中抽取2ml全血放入edta抗凝管中。使用dna提取試劑盒(qiagen，valencia，ca)提取樣品總dna，并編號。將提取的每個總dna配置為處理體系并反應(yīng)，其中，處理體系如下：樣品體積(μl)ddh2o20.310×cutsmartbuffer2.5msel酶0.2樣本dna2反應(yīng)條件如下：溫度(℃)時間(min)37606520實施例4待測樣本defa1-3基因拷貝數(shù)的測定利用本發(fā)明實施例2提供的測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒和本發(fā)明實施例3提供的待測樣本dna，進行defa1-3基因拷貝數(shù)的測定，步驟如下：步驟(a)：制備ddpcr反應(yīng)液，總體積20μl，向擴增管中加入下列反應(yīng)物：ddpcr探針法預(yù)混液18μl，本發(fā)明實施例3提供的處理過的dna模板2μl?？瞻讓φ眨阂詒nasefreedh2o代替dna模板，同樣條件下擴增；步驟(b)：取微滴發(fā)生卡置于卡托中固定，將20μl反應(yīng)液加入微滴發(fā)生卡中間一排的8個孔內(nèi)，不足8個樣品時用20μl1×ddpcr探針法質(zhì)控液補足；步驟(c)：在微滴發(fā)生卡最低下一排8個孔中各加入70μl微滴發(fā)生油，并蓋膠墊密封；步驟(d)：將以上卡托輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴；步驟(e)：微滴生成于微滴發(fā)生卡最上面一排孔內(nèi)，緩慢吸取40μl，再打入96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)；步驟(f)：封好膜之后在96孔pcr儀內(nèi)進行pcr反應(yīng)，升降溫速度小于2.5℃/秒；其中，pcr條件如下：步驟(g)：將完成pcr的96孔板放入plateholder中組裝好，之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中，順序吸取每個樣品的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器，有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性，打開quantasoft軟件進行檢測分析，軟件記錄每個樣品里陽性微滴的比例，并自動分析數(shù)據(jù)。擴增已知拷貝數(shù)為a(值為2，4，6，8，10，12，14，16)，陽性對照defa1-3信號為m，rpp30信號為n，樣品defa1-3的信號為m’，rpp30信號為n，則樣品的拷貝數(shù)為(m’/m)×a。根據(jù)病人攜帶的defa1-3拷貝數(shù)量，可以判斷該病人重癥膿毒癥發(fā)生的易感性。當defa1-3基因拷貝數(shù)大于8時，重癥膿毒癥易感性明顯增加。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>浙江大學(xué)<120>測定defa1-3基因拷貝數(shù)的試劑盒、方法及二者的應(yīng)用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccgtccttccctctagacttagc23<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gagcagattgcagcggacat20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3actgctaactccatactc18當前第1頁12