本發(fā)明是關(guān)于一種規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)重組人干擾素β1b蛋白的方法，更具體地說，是關(guān)于一種穩(wěn)定、高效表達重組人干擾素β1b蛋白的規(guī)?；l(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

人β干擾素具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，其基因位于人第9號染色體上，天然人β干擾素是一種由166個氨基酸組成的分子量為20kd的糖蛋白。基因工程β干擾素已經(jīng)fda審批，用于治療多發(fā)性硬化癥(ms)，該癥是與免疫應(yīng)答相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，β干擾素的治療基于其免疫應(yīng)答作用。此外β干擾素還有很強的抗病毒感染與抗腫瘤作用，臨床上對乙型肝炎、丙型肝炎及其它病毒性疾病都有明顯的療效。

β干擾素類藥物作為基因工程蛋白藥物，其產(chǎn)業(yè)化需首先解決大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)問題，但現(xiàn)有技術(shù)中對β干擾素蛋白的發(fā)酵研究最大只達到中試水平，規(guī)?；緸槭褂?0l發(fā)酵罐完成30l培養(yǎng)物的發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物收獲量低，無法應(yīng)用于β干擾素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組人干擾素β1b蛋白的方法。

為達上述目的，本發(fā)明提供了一種大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組人干擾素β1b蛋白的方法，該方法包括：

在發(fā)酵罐中配制2yt培養(yǎng)基，滅菌后降溫至35～40℃；

接種含有重組人干擾素β1b基因質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌至發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度為35～40℃、轉(zhuǎn)速200～500r/min、通氣量200～500l/min、ph5.0～8.0；

發(fā)酵培養(yǎng)過程中監(jiān)測菌液的菌體密度od600值；待培養(yǎng)至菌體密度od600達到2～8左右后，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.2～1.5mm，或分批加入乳糖至終濃度為1～10g/升進行誘導(dǎo)；

誘導(dǎo)后每個小時按照補加原培養(yǎng)基體積1～10％的速率進行流加補料(補加原培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)2～8h停止發(fā)酵收獲菌體。

本發(fā)明的生產(chǎn)重組人干擾素β1b蛋白的方法，可利于提高重組β干擾素表達水平。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法可規(guī)?；?，所述發(fā)酵罐體積大于等于200l，可達1000l以上。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，所述2yt培養(yǎng)基的滅菌條件為：121℃滅菌。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，含有重組人干擾素β1b基因質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌的接種量為5～15％。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明的方法中，收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白含量占菌體總蛋白量的20％以上，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量達到250至705g甚至更高。

本發(fā)明的方法，是一種穩(wěn)定、高效表達重組人干擾素β1b蛋白的規(guī)模化發(fā)酵方法，其中采用流加補料的發(fā)酵方式，通過添加一定濃度的補料培養(yǎng)基，保證干擾素β1b蛋白在工程菌內(nèi)高效表達，提高了菌體收獲量和β干擾素蛋白的菌體表達量，實現(xiàn)了含有人β干擾素基因質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌在200l以上的發(fā)酵罐中的規(guī)模化發(fā)酵培養(yǎng)，對β干擾素發(fā)酵工藝進行了放大，提高了發(fā)酵產(chǎn)量，為β干擾素類藥物產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。

具體實施方式

以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施過程和產(chǎn)生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)和特點，不作為對本案可實施范圍的限定。各實施例中未詳細注明的實驗方法，按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)操作進行。實施例中所用含有重組人干擾素β1b基因質(zhì)粒的大腸桿菌為北京北生研生物制品有限公司按照現(xiàn)有技術(shù)自行構(gòu)建，成熟重組大腸桿菌種子液的培養(yǎng)參照現(xiàn)有技術(shù)進行。

實施例1

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至35℃。

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液15l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為35±1℃、轉(zhuǎn)速200r/min、通氣量200l/min、ph為5.0條件下進行培養(yǎng)。

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到2，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.2mm進行誘導(dǎo)。

4、誘導(dǎo)后開始補料，補料培養(yǎng)基同樣為2yt培養(yǎng)基。補料速率按每小時補加原培養(yǎng)基體積的5％的速率進行流加補料。繼續(xù)培養(yǎng)4小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為30％，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為385g。

實施例2

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至37℃。

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液30l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為37±1℃、轉(zhuǎn)速300r/min、通氣量300l/min、ph為8.0條件下進行培養(yǎng)。

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到8，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.8mm進行誘導(dǎo)。

4、誘導(dǎo)后開始補料，補料培養(yǎng)基同樣為2yt培養(yǎng)基。補料速率按每小時補加原培養(yǎng)基體積的10％的速率進行流加補料。繼續(xù)培養(yǎng)2小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為35％，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為525g

實施例3

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至40℃；

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液45l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為40±1℃、轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量500l/min、ph為7.0條件下進行培養(yǎng)；

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到5，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為1.5mm進行誘導(dǎo)。

4、誘導(dǎo)后開始補料，補料培養(yǎng)基同樣為2yt培養(yǎng)基。補料速率按每小時補加原培養(yǎng)基體積的1％的速率進行流加補料。繼續(xù)培養(yǎng)8小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為30％，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為475g。

實施例4

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至35℃；

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液30l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為35±1℃、轉(zhuǎn)速250r/min、通氣量250l/min、ph為7.0條件下進行培養(yǎng)；

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到4，按小時分批加入乳糖至終濃度為2g/l進行誘導(dǎo)。

4、誘導(dǎo)后開始補料，補料培養(yǎng)基同樣為2yt培養(yǎng)基。補料速率按每小時補加原培養(yǎng)基體積的2％的速率進行流加補料。繼續(xù)培養(yǎng)6小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為22％，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為258g。

實施例5

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至38℃；

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液15l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為38±1℃、轉(zhuǎn)速350r/min、通氣量350l/min、ph為7.5條件下進行培養(yǎng)；

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到4，按小時分批加入乳糖至終濃度為10g/l進行誘導(dǎo)。

4、誘導(dǎo)后開始補料，補料培養(yǎng)基同樣為2yt培養(yǎng)基。補料速率按每小時補加原培養(yǎng)基體積的5％的速率進行流加補料。繼續(xù)培養(yǎng)4小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為30％，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為325g。

實施例6

1、在1000l發(fā)酵罐中配制600l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至37℃。

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液50l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為37±1℃、轉(zhuǎn)速270r/min、通氣量270l/min、ph為7.4條件下進行培養(yǎng)。

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到4，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.8mm進行誘導(dǎo)。

4、誘導(dǎo)后開始補料，補料培養(yǎng)基同樣為2yt培養(yǎng)基。補料速率按每小時補加原培養(yǎng)基體積的3％的速率進行流加補料。繼續(xù)培養(yǎng)4小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為32％，質(zhì)粒保有率為100％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為705g。

對照例1

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至37℃；

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液20l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為37±1℃、轉(zhuǎn)速250r/min、通氣量250l/min、ph為7.5條件下進行培養(yǎng)；

3、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到4，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.8mm進行誘導(dǎo)。繼續(xù)培養(yǎng)5小時發(fā)酵結(jié)束。

4、誘導(dǎo)后開始補加20％葡萄糖溶液，補料速率為每小時補加原培養(yǎng)基體積5％的上述葡萄糖溶液，補料至發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為15％，質(zhì)粒保有率為85％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為135g。

對照例2

1、在500l發(fā)酵罐中配制300l2yt培養(yǎng)基，121℃滅菌后降溫至37℃；

2、接種成熟重組大腸桿菌種子液10l進行培養(yǎng)，整個發(fā)酵培養(yǎng)階段均維持溫度為37±1℃、轉(zhuǎn)速270r/min、通氣量270l/min、ph為7.5條件下進行培養(yǎng)；

3、接種后1h開始補加20％葡萄糖溶液，補料速率為每小時補加原培養(yǎng)基體積5％的上述葡萄糖溶液，直至發(fā)酵結(jié)束。

4、發(fā)酵培養(yǎng)過程中定時取樣測定菌液的菌體密度od600值；培養(yǎng)至菌體密度od600達到8，加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.5mm進行誘導(dǎo)。繼續(xù)培養(yǎng)3小時發(fā)酵結(jié)束。

5、取樣用sds-page電泳法測定菌體表達量，參考2015版《藥典》ⅲ部通則3406測定質(zhì)粒丟失率。最終收獲發(fā)酵菌體中β干擾素蛋白表達量為10％，質(zhì)粒保有率為50％，發(fā)酵產(chǎn)物破碎后包涵體產(chǎn)量為105g。

最后說明的是：以上實施例僅用于說明本發(fā)明的實施過程和特點，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍當中。