(一)
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組α-半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用，該菌株或產(chǎn)生的酶可以應(yīng)用于飼料、食品中的抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解，應(yīng)用于造紙工業(yè)中的紙漿預(yù)處理、臨床醫(yī)療中的器官移植或血型改造等。(二)
背景技術(shù)：
：：大豆是重要的食品原料，可以加工成豆奶等營養(yǎng)豐富的食品。豆粕是大豆工業(yè)的主要固態(tài)副產(chǎn)物，是我國非常重要的飼料原料之一。但是，大豆中含有大量的難以消化的不良寡糖，如棉子糖、水蘇糖等α-半乳寡糖。這些不良寡糖是抗?fàn)I養(yǎng)因子，不能很好地被人或動物吸收利用，而在腸道中經(jīng)過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生大量氣體，引起腹脹、腹瀉、胃腸痛等現(xiàn)象。甘蔗糖蜜是蔗糖生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物，其中含有大量的糖分，常被用作工業(yè)微生物發(fā)酵的培養(yǎng)基碳源。利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)有用的物質(zhì)不僅可以解決蔗糖生產(chǎn)污染環(huán)境問題，而且能夠?qū)崿F(xiàn)資源化利用，具有重要的意義。但是，甘蔗糖蜜還含有一部分不能被釀酒酵母等食品級生物安全微生物利用的糖分，主要由蜜二糖、棉子糖、水蘇糖等構(gòu)成，通常占甘蔗糖蜜總重量的5％。α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.22)，是一種可以催化α-半乳糖苷鍵的水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原d-半乳糖，水解棉籽糖、水蘇糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂等。因此，該酶可以消除豆粕、糖蜜中的棉籽糖和水蘇糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子，可以作為添加劑應(yīng)用于食品、飼料工業(yè)，提高食品或飼料的消化吸收率和營養(yǎng)價值。此外，α-半乳糖苷酶還可以用在醫(yī)療、造紙業(yè)中。細(xì)胞溶酶體內(nèi)α-半乳糖苷酶酶活降低可以引起一種的罕見的遺傳性疾病fabry病。目前，對該病進(jìn)行α-半乳糖苷酶替代療法療效可以得到增強(qiáng)。α-半乳糖苷酶還可以用來水解抗原、改造血型，從而降低異種器官移植、輸血過程中的免疫排斥反應(yīng)。而在造紙工業(yè)中，α-半乳糖苷酶可以水解軟木中的半纖維成分半乳葡聚甘露聚糖，分離出其中的α-半乳糖，對紙漿預(yù)處理有一定的作用。α-半乳糖苷酶在植物(水稻、豆芽、咖啡豆、葡萄等)、細(xì)菌(鏈霉菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、雙歧桿菌和巨大芽孢桿菌)中、真菌(根霉、青霉、黑曲霉、米曲霉)等生物中存在。但是，在釀酒酵母、乳酸菌等常用的食品安全級的微生物中，酶活很低，甚至沒有該酶。因此，將其他生物來源的α-半乳糖苷酶基因克隆，利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入酵母菌等，然后進(jìn)行食品、豆粕的發(fā)酵加工，不僅可以去除不良寡糖抗?fàn)I養(yǎng)因子，還可以提高益生菌的數(shù)量，提高食品、飼料品質(zhì)。此外，轉(zhuǎn)α-半乳糖苷酶基因的酵母菌在培養(yǎng)的時候，可以充分利用糖蜜中的難發(fā)酵糖，提高資源利用率。雖有將α-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)入畢赤酵母的報道(cn105219791a)，但是畢赤酵母不是飼料、食品等加工的生物安全菌(見《飼料添加劑品種目錄(2013)》)，而釀酒酵母是啤酒發(fā)酵、釀造、豆粕類加工的可食用生物安全菌。此外，普通的α-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性差，不便于食品、飼料加工。因此，需要構(gòu)建轉(zhuǎn)α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母，還需要克隆熱穩(wěn)定性好、耐高溫的α-半乳糖苷酶基因并轉(zhuǎn)入釀酒酵母。(三)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種重組α-半乳糖苷酶基因及其重組基因工程菌釀酒酵母，該工程菌可以產(chǎn)生α-半乳糖苷酶并應(yīng)用于食品、飼料加工、生產(chǎn)α-半乳糖苷酶等，可以去除不良寡糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子。釀酒酵母被用于豆類食品加工、豆粕飼料加工等，但是釀酒酵母幾乎沒有α-半乳糖苷酶活性，不能去除豆類中的不良寡糖。本發(fā)明構(gòu)建的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌具有α-半乳糖苷酶活性，可以去除不良寡糖。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種重組α-半乳糖苷酶基因，所述基因的核苷酸序列為seqidno.1所示。本發(fā)明還提供一種所述重組α-半乳糖苷酶基因編碼的重組α-半乳糖苷酶，所述酶的氨基酸序列為seqidno.2所示。本發(fā)明還涉及一種由所述重組α-半乳糖苷酶基因構(gòu)建的重組載體。本發(fā)明提供一種由所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組α-半乳糖苷酶基因工程菌，所述重組α-半乳糖苷酶基因工程菌以釀酒酵母為宿主菌構(gòu)建而成。本發(fā)明涉及一種所述重組α-半乳糖苷酶在降解含α-半乳糖苷鍵底物中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是將重組α-半乳糖苷酶基因工程菌接種至添加有含α-半乳糖苷鍵的底物和誘導(dǎo)物iptg的ynb篩選培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)底物的降解，獲得降解產(chǎn)物。進(jìn)一步，所述的底物為標(biāo)準(zhǔn)檢驗底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-半乳糖苷(x-α-gal))、含有棉子糖(棉籽糖是一種三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖組成，降解后可能變成二塘、單糖的混合物，徹底降解后變成單糖)、水蘇糖的豆粕、糖蜜、食品原料、紙漿等。進(jìn)一步，當(dāng)所述的底物為5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-半乳糖苷，所述的應(yīng)用為：將重組α-半乳糖苷酶基因工程菌接種至添加有含α-半乳糖苷鍵的底物和誘導(dǎo)物iptg的ynb篩選培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)底物的降解，獲得降解產(chǎn)物5-氯-4-溴-3-吲哚；所述底物以4mg/ml二甲基甲酰胺溶液的形式加入，所述底物溶液與iptg體積比為1.5:1，所述ynb篩選培養(yǎng)基中，底物終濃度為0.2mg/ml，iptg終濃度1mmol/l；ynb(ura-)篩選培養(yǎng)基終濃度組成：葡萄糖20g/l、酵母氮堿(ynb)6.7g/l、腺嘌呤0.04g/l、l-色氨酸0.02g/l、l-亮氨酸0.1g/l、瓊脂粉15g/l，溶劑為蒸餾水，ph自然。當(dāng)所述的底物為棉子糖，所述的應(yīng)用為：將重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌接種至ynb篩選培養(yǎng)基，在30℃、180rpm條件下培養(yǎng)到對數(shù)期，然后以體積濃度10％的接種量轉(zhuǎn)接入ypgr誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)，30℃培養(yǎng)12h后，將發(fā)酵液離心收集細(xì)胞后，超聲波破碎(美國sonics公司vcx500超聲波破碎儀，破碎參數(shù)：在輸出功率/頻率130w/20khz，時間為10min，工作3s停3s)后，取破碎混合液與棉子糖溶液以體積比1:1混合，60℃水解反應(yīng)完全，實(shí)現(xiàn)對棉子糖的降解；所述棉子糖溶液是以ph5.5、50mm的mes緩沖液為溶劑配制成0.01g/ml；所述ypgr誘導(dǎo)培養(yǎng)基終濃度組成：蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，棉籽糖20g/l，半乳糖20g/l，溶劑為水，ph自然。本發(fā)明根據(jù)報道的源于嗜熱真菌米赫根毛霉(rhizomucormiehei)的耐熱α-半乳糖苷酶基因序列，再加上酵母的分泌信號肽序列，組成重組的分泌型α-半乳糖苷酶全基因。根據(jù)全基因序列進(jìn)行化學(xué)合成，克隆到釀酒酵母表達(dá)載體，利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入酵母菌，然后進(jìn)行豆類、糖蜜的發(fā)酵加工，可以去除發(fā)酵原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子不良寡糖，提高食品、飼料的營養(yǎng)價值和消化吸收率，提高資源的利用率。α-半乳糖苷酶是可以催化α-半乳糖苷鍵水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原d-半乳糖，水解棉籽糖家族低聚糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂。α-半乳糖苷酶在含上述α-半乳糖苷鍵的底物上反應(yīng)，可以降解底物。x-α-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d-半乳糖苷)是一種半乳糖苷酶的顯色底物，轉(zhuǎn)α半乳糖苷酶基因的酵母菌落產(chǎn)生分泌型的α-半乳糖苷酶，在含該酶底物x-α-gal的平板上降解底物分解成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。藍(lán)色物質(zhì)可以使整個培養(yǎng)菌落顯藍(lán)色，從而說明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母，該工程菌可以應(yīng)用于底物的水解。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：1)釀酒酵母是食品安全菌，構(gòu)建的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶，可以進(jìn)行豆類、糖蜜的發(fā)酵加工，可以去除發(fā)酵原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子不良寡糖，提高食品、飼料的營養(yǎng)價值和消化吸收率，提高資源的利用率。2)α-半乳糖苷酶可以用于醫(yī)療、造紙工業(yè)。醫(yī)療上可以用于抗原、血型改造，降低器官移植、輸血等臨床醫(yī)療中的免疫排斥反應(yīng)。在造紙工業(yè)中α-半乳糖苷酶的酶解作用可以增強(qiáng)紙漿預(yù)處理效果。3)釀酒酵母中轉(zhuǎn)入的α-半乳糖苷酶源于嗜熱真菌米赫根毛霉(r.miehei)，有一定的熱穩(wěn)定性。在釀酒酵母進(jìn)行飼料添加劑發(fā)酵豆粕的加工、食品加工、紙漿處理等過程中，會通過發(fā)酵等產(chǎn)生一定的熱量導(dǎo)致體系升溫，現(xiàn)有的釀酒酵母α-半乳糖苷酶活性很低，幾乎檢測不到。雖有報道的重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母，但是轉(zhuǎn)入的是普通的α-半乳糖苷酶，熱穩(wěn)定性差，在工業(yè)化加工應(yīng)用的過程中不耐高溫，很容易失活。普通的微生物或酶不能正常發(fā)揮催化作用，本發(fā)明的工程菌產(chǎn)生的重組α-半乳糖苷酶則有一定的熱穩(wěn)定性，其最適溫度在60℃，在60℃水浴80min后還可以保持80％的活性。(四)附圖說明圖1釀酒酵母表達(dá)載體pyes2圖譜。圖2為轉(zhuǎn)重組α半乳糖苷酶基因的釀酒酵母。有顏色反應(yīng)的菌落為轉(zhuǎn)化子，在圖中顏色較深(a)，無色菌落為對照酵母菌株(b)，在圖中顏色很淺。圖3粗酶液酶活差異，野生代表表野生型菌株，2、4、11、14分別代轉(zhuǎn)α-半乳糖苷酶基因的不同重組工程菌株。圖4酶的熱穩(wěn)定性曲線圖。圖5薄層色譜(tlc)法測棉籽糖的降解圖。圖6酶活測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。(五)具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：實(shí)施例11、化學(xué)合成重組α-半乳糖苷酶基因序列α-半乳糖苷酶基因開放閱讀框(orf)序列，見ncbi網(wǎng)站genbank登錄號kc357714.1。對α-半乳糖苷酶基因orf序列根據(jù)釀酒酵母的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，在前面加上分泌信號肽的基因序列，信號肽序列源于產(chǎn)朊假絲酵母分泌性酶(見ncbi網(wǎng)站genbank登錄號y12659.1，位置766-843)，組成新的α-半乳糖苷酶重組表達(dá)基因序列(下劃線為信號肽序列)seqidno.1所示，即重組α-半乳糖苷酶基因：atgtcgttgacaaaagatgcctcagaggaccaagaagacatcaagagtctcacgatgaacactagtttagttgattccaggttgttgttgatcaccgctatttcctcttccttgttgctattggtcttgttgccttgtgcttatgctgcagcaggattgttatcaacaggcattcataagcacccagatttggatacttggttcttggttaccgagagatctacttacgttgtaggagctacagacgacggttatttgttgaacttgcattggggcgatagattgaacgaattggacaacgacttgaacgctactagaatcttcaccaccactactttcaacccaccaattacctacgctcaagaagaattgccagcttttggaggcttgagatacagagaattggctttgaaggttgaattgccaaacggagttagggaattgaacttgttgtactccggtagatctaacatgacaggcgattcattgttggacttggaattggaagcaggaaactataccggtttgacagttaccttgcactacgaattggacgttgataacgacatcatcaggagatcctacactatcagaaacggcttgaagaagggtaacgttaacttgtctaaggctttgtcagcagcttggcatccaccatcagctatgggtttagacgaagaaagagaattgttgaccttgtcaggcgattgggctcacgaagctattactcaaagaaccagattgagaccaggagtttcacatacagtccaatctccaagaggttttccatctcatcaatcctacccatacttcgctttgagacaagttccaacaggagaaacttctccaggaacttctaacgaagtctactttggagctttggcttggtcaggatcttgggaaattacagttgacaccaccatatatggttactcaagaattaccggaggtattcatcatcaagattttggttggaccttggaaccaggcgaatcttttactactccagttttcgcagcaggttatactaatgaaggtttaccaggagctagaaaaagaatgccaagacacgttaggaagtaccagttgaagaacgttaagacccagcaaaagaaggaagacatgtacaacccagtcctatacaactcttgggaagctttgactttcaacatcacctacgacaagcaaatcgctttagcagataaagcagcagctatgggcattgaattatttgccgttgacgacggttggtttggagctagagataacgattcagcaggtttaggagattggttcgttaacaagagaaagttcccacacggaatgaaaccattggcagatcacgttcataacttgggaatgaagttcggtctttggttcgaaccagaatctttcaacccaaactccgacttgtataggaagcatccagattgggctttttactacgacggtattccaagatacgaagctagaaaccagttgttgatgaacttgggtttgccagaagtcagagaatacttgtacaacaggatctccaccttggttaaggaaattggcatcgacttcatcaagtgggatatgaacagaccattcgcagaagttaccatgcacaactacaaggacagaaaccctagagaagcttgggtattagcagttgaaggcttttactccatcatcgataagttgaagcaggaatttccagacttgatgattgaaacttgcgcttcaggtggaggtagaatggatattggcattttgcaaaaggtcgatcaagcttggacttcagataacactagaccagacgctagattgttcatccaatacggagcttctatgttcttgccacctagaattatgtacggttgggttacagattctccatacgattcccagatcgaaattccattgtccttcaggttccacgtttcctttatgggcggtttaggcgttggttctaatttgaataacatggaggaatccgatatcaaagaagccgcaggttggatcgaattgtacaagcaaatcagacacgtcatacaaaacggcgatttggattggcttgttcaaccatcttgcgttggagatttggttgccgtttctcaaactacttcccaagatagatcagaggcagttgttttggcttacagattcaactccgttttctccgatcagttgaacccattgagattgagatacttagatccaaagcacacctacagagttagagtttaccaggatgatccatctactccatcagacgaatacgaaatgtcaggagctttgttgttgtccagaggtattgttttgccaggcttgaacaacatcatgttcagaagcgcagttgtttgggttcaacaaaaatga。將上述重組序列交商業(yè)公司通過化學(xué)合成法合成dna。2、重組基因的表達(dá)載體構(gòu)建2.1基因擴(kuò)增、酶切和表達(dá)載體連接以重組α-半乳糖苷酶基因dna(seqidno.1所示)為模板進(jìn)行pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增(反應(yīng)體系和程序見表1、表2)，兩條引物外側(cè)分別設(shè)計酶切位點(diǎn)(bamhi/xbai)，pcr產(chǎn)物經(jīng)過純化后進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物回收后和用同樣雙酶切開的酵母表達(dá)載體pyes2(圖1，購自invitrogen公司)進(jìn)行連接反應(yīng)(表3，takara公司ligation試劑盒)。pcr引物：galb-f:cgggatcccgatgtcgttgacaaaagatgcct下劃線為酶切位點(diǎn)bamhi和保護(hù)堿基galb-r:gctctagagctcatttttgttgaacccaaaca下劃線為酶切位點(diǎn)xbai和保護(hù)堿基表1pcr反應(yīng)體系表2pcr反應(yīng)程序表3連接反應(yīng)體系：2.2連接的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌1)取50μl大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，放于冰上進(jìn)行融化10min。2)加入5μl連接產(chǎn)物并混勻。冰上放置30min。3)42℃熱激90s，立即冰上放置2min。4)加入450μllb培養(yǎng)基(1l：蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶劑為水，ph7.2)，使終體積為500μl。37℃，200rpm培養(yǎng)1h。5)取200μl步驟4)培養(yǎng)液涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的lb平板(1l：蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，瓊脂15g，溶劑為水，ph7.2)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。2.3表達(dá)載體正確構(gòu)建挑選步驟5)5個轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行質(zhì)粒測序，選擇序列和構(gòu)建正確的克隆進(jìn)行繁殖，提取質(zhì)粒后保存，進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。含α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pyes2-galb。3、釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化3.1釀酒酵母的接種、培養(yǎng)挑取ypd培養(yǎng)基(1l：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，瓊脂15g，溶劑為水，ph自然)上活化的釀酒酵母whu2a單菌落接種于5ml的ypd液體培養(yǎng)基(1l：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，溶劑為水，ph自然)中，28℃、200rpm過夜培養(yǎng)。3.2釀酒酵母擴(kuò)大培養(yǎng)取2.5ml過夜培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，接種于50mlypd液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm培養(yǎng)4h，od600達(dá)到0.7-0.9。3.3酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)將培養(yǎng)液裝到已滅菌的離心管中，6000rpm、4℃離心5min。(2)用20ml無菌水洗滌一次，離心去上清，收集細(xì)胞。(3)用1ml0.1mol/lliac充分懸浮細(xì)胞，并將懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，12000rpm、4℃離心1min，棄上清。(4)加入400μl0.1mol/lliac，上下震蕩細(xì)胞懸液，取50μl懸液于1.5ml離心管中，12000rpm、4℃離心1min，除去liac，即為感受態(tài)細(xì)胞，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。3.4酵母轉(zhuǎn)化體系(1)在冰上配制轉(zhuǎn)化混合液(見表4，按照順序依次加入)表4釀酒酵母轉(zhuǎn)化混合液(2)劇烈振蕩1min，將體系充分混合(3)28℃保溫30min(4)42℃水浴熱激25min(5)12000rpm離心1min，棄上清(6)加1ml無菌水到1.5mlep管中，用移液槍輕輕懸浮，盡量避免劇烈振蕩。5.涂布取200μl轉(zhuǎn)化菌液涂布ynb(ura-)篩選培養(yǎng)基，涂布的平板放置在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。表5ynb(ura-)篩選培養(yǎng)基(1l，溶劑為水，ph自然)4、轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定在上述篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，長出的菌落即為候選轉(zhuǎn)α-半乳糖苷酶基因的釀酒酵母克隆，這些克隆再經(jīng)過質(zhì)粒提取，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證后，獲得重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌。實(shí)施例2重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌降解含α-半乳糖苷鍵的底物將20μl誘導(dǎo)物iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)和50μlα-半乳糖苷酶顯色底物x-α-gal(4mg/ml，溶劑為二甲基甲酰胺)涂布于ynb(ura-)篩選培養(yǎng)基(表5)平板上，放置20min進(jìn)行充分吸收擴(kuò)散后，分別劃線接種實(shí)施例1制備的重組α半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌和未轉(zhuǎn)基因的對照菌株(釀酒酵母whu2a)，30℃培養(yǎng)48h后，進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示重組α半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌菌落為藍(lán)色，對照菌株則不顯藍(lán)色(圖2)，結(jié)果說明重組釀酒酵母工程菌能夠產(chǎn)生α-半乳糖苷酶。實(shí)施例3重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌的α-半乳糖苷酶酶活和熱穩(wěn)定性測定結(jié)果1)、酶活測定發(fā)酵方法是先將重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌接種至ynb(ura-)篩選培養(yǎng)基，在30℃、180rpm條件下培養(yǎng)到對數(shù)期，然后以體積濃度10％的接種量轉(zhuǎn)接入ypgr誘導(dǎo)培養(yǎng)基(蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，棉籽糖20g/l，半乳糖20g/l，溶劑為水，ph自然，115℃滅菌30min)中進(jìn)行表達(dá)，30℃培養(yǎng)12h后，將發(fā)酵液離心收集細(xì)胞后，通過超聲波破(美國sonics公司vcx500超聲波破碎儀，破碎參數(shù)：在輸出功率/頻率130w/20khz，時間為10min，工作3s停3s)碎后，取粗酶液進(jìn)行酶活測定，并以原始出發(fā)菌株為對照，酶活力的差別如圖3表示。α-半乳糖苷酶的酶活測定方法：酶活力測定采用pnpg法。其原理是α-半乳糖苷酶可與底物pnpg等摩爾反應(yīng)生成黃色的對硝基苯酚(pnp)，通過檢測pnp的生成量從而得出α-半乳糖苷酶的活性。具體操作方法如表6：表6酶活性測定方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算酶活，酶活(u/ml)的定義為：在測定條件下，每分鐘分解pnpg釋放1μmolpnp所需的酶量。由圖3比較可知，工程菌的酶活力在14.5u/ml左右，而出發(fā)菌株的酶活力幾乎檢測不到，差異顯著(p<0.05)。說明工程菌成功的表達(dá)了α-半乳糖苷酶。標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)制作：pnp用50mm的mes緩沖液(ph5.5，2-嗎啉代乙磺酸)配置成5mm的溶液，與50mm的mes緩沖液(ph5.5)混合反應(yīng)后，加入1m的na2co3終止反應(yīng)，測定od405的吸光度來確定濃度。pnp標(biāo)準(zhǔn)溶液配制如表7。表7pnp標(biāo)準(zhǔn)溶液配制table3-16pnpstandardsolutionprepare以od405的吸光值為橫坐標(biāo)，以pnp的量為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：酶活計算公式為：酶活(y)＝(0.1576x-0.0077)×f×100/tx：od405的光吸收值；f：酶液的稀釋倍數(shù)；100：反應(yīng)體系中10μl酶液換算成1ml的換算因子；t：反應(yīng)時間。2)酶的熱穩(wěn)定性測定將酶液與ph5.5、50mmmes(2-嗎啉代乙磺酸)緩沖液，以體積比1：3混合，然后在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的溫度梯度下分別放置0、20、40、60、80min，然后測定其酶活，從而得出其相對酶活力曲線。重組α-半乳糖苷酶的最適溫度在60℃，見圖4。該酶可以在在60℃水浴80min后還可以保持80％的活性。實(shí)施例4重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌降解棉籽糖重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵后，超聲波破碎后離心取上清液作為粗酶液，進(jìn)行棉籽糖降解能力分析。用薄層色譜(tlc)法測棉籽糖的降解情況。測定結(jié)果見圖5。從棉籽糖降解情況來看，在處理30min時棉籽糖已經(jīng)水解了一部分，且隨著時間的加長，降解得越來越多，到2h時已經(jīng)水解了大部分，說明重組的α-半乳糖苷酶是可以對降解棉籽糖。具體方法：1)重組α-半乳糖苷酶粗酶液的制備重組α-半乳糖苷酶基因釀酒酵母工程菌按照實(shí)施例3中的方法進(jìn)行發(fā)酵后，6000rpm離心10min去除上清液，并用ph5.5的mes緩沖液洗滌后重懸，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎處理，處理后的樣品6000rpm離心5min，取上清液4℃保存?zhèn)溆谩?)薄層色譜分析1)反應(yīng)原理：根據(jù)物質(zhì)與硅膠板吸附力與分配系數(shù)的差異，使樣品中的多種物質(zhì)得以分離。根據(jù)溶解度的不同，以及吸附力的差異，最終混合物將分離，在顯色劑作用下，形成一系列斑點(diǎn)。本次測定用g型硅膠板。2)試劑：展開劑及體積比：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水＝9:10:4:2顯色劑：1g尿素+4.5ml磷酸溶液+48ml水飽和正丁醇3)測定步驟①棉籽糖標(biāo)樣的配制稱取棉籽糖0.01g溶于1mlmes緩沖液(50mm，ph5.5)中，4℃保存?zhèn)溆谩＂跇悠返奶幚碛么置敢?0μl和棉籽糖10μl(0.01g/ml)混勻后，60℃進(jìn)行水解反應(yīng)30、60、90、120min后，tlc測定。③測定方法在硅膠板上1cm處用鉛筆畫一條直線，在直線上進(jìn)行點(diǎn)樣。待樣品干燥后，將硅膠板直立于層析缸中展開(注意展開劑要低于直線)，當(dāng)展開液跑至離頂部1cm處拿出。用吹風(fēng)機(jī)吹干后，將顯色液噴于硅膠板上，然后立即放入預(yù)先調(diào)好的溫度為140℃的烘箱中烘至顯色。sequencelisting<110>浙江工業(yè)大學(xué)<120>一種重組α-半乳糖苷酶基因、載體、工程菌及其應(yīng)用<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>2364<212>dna<213>unknown<220><223>人工序列<400>1atgtcgttgacaaaagatgcctcagaggaccaagaagacatcaagagtctcacgatgaac60actagtttagttgattccaggttgttgttgatcaccgctatttcctcttccttgttgcta120ttggtcttgttgccttgtgcttatgctgcagcaggattgttatcaacaggcattcataag180cacccagatttggatacttggttcttggttaccgagagatctacttacgttgtaggagct240acagacgacggttatttgttgaacttgcattggggcgatagattgaacgaattggacaac300gacttgaacgctactagaatcttcaccaccactactttcaacccaccaattacctacgct360caagaagaattgccagcttttggaggcttgagatacagagaattggctttgaaggttgaa420ttgccaaacggagttagggaattgaacttgttgtactccggtagatctaacatgacaggc480gattcattgttggacttggaattggaagcaggaaactataccggtttgacagttaccttg540cactacgaattggacgttgataacgacatcatcaggagatcctacactatcagaaacggc600ttgaagaagggtaacgttaacttgtctaaggctttgtcagcagcttggcatccaccatca660gctatgggtttagacgaagaaagagaattgttgaccttgtcaggcgattgggctcacgaa720gctattactcaaagaaccagattgagaccaggagtttcacatacagtccaatctccaaga780ggttttccatctcatcaatcctacccatacttcgctttgagacaagttccaacaggagaa840acttctccaggaacttctaacgaagtctactttggagctttggcttggtcaggatcttgg900gaaattacagttgacaccaccatatatggttactcaagaattaccggaggtattcatcat960caagattttggttggaccttggaaccaggcgaatcttttactactccagttttcgcagca1020ggttatactaatgaaggtttaccaggagctagaaaaagaatgccaagacacgttaggaag1080taccagttgaagaacgttaagacccagcaaaagaaggaagacatgtacaacccagtccta1140tacaactcttgggaagctttgactttcaacatcacctacgacaagcaaatcgctttagca1200gataaagcagcagctatgggcattgaattatttgccgttgacgacggttggtttggagct1260agagataacgattcagcaggtttaggagattggttcgttaacaagagaaagttcccacac1320ggaatgaaaccattggcagatcacgttcataacttgggaatgaagttcggtctttggttc1380gaaccagaatctttcaacccaaactccgacttgtataggaagcatccagattgggctttt1440tactacgacggtattccaagatacgaagctagaaaccagttgttgatgaacttgggtttg1500ccagaagtcagagaatacttgtacaacaggatctccaccttggttaaggaaattggcatc1560gacttcatcaagtgggatatgaacagaccattcgcagaagttaccatgcacaactacaag1620gacagaaaccctagagaagcttgggtattagcagttgaaggcttttactccatcatcgat1680aagttgaagcaggaatttccagacttgatgattgaaacttgcgcttcaggtggaggtaga1740atggatattggcattttgcaaaaggtcgatcaagcttggacttcagataacactagacca1800gacgctagattgttcatccaatacggagcttctatgttcttgccacctagaattatgtac1860ggttgggttacagattctccatacgattcccagatcgaaattccattgtccttcaggttc1920cacgtttcctttatgggcggtttaggcgttggttctaatttgaataacatggaggaatcc1980gatatcaaagaagccgcaggttggatcgaattgtacaagcaaatcagacacgtcatacaa2040aacggcgatttggattggcttgttcaaccatcttgcgttggagatttggttgccgtttct2100caaactacttcccaagatagatcagaggcagttgttttggcttacagattcaactccgtt2160ttctccgatcagttgaacccattgagattgagatacttagatccaaagcacacctacaga2220gttagagtttaccaggatgatccatctactccatcagacgaatacgaaatgtcaggagct2280ttgttgttgtccagaggtattgttttgccaggcttgaacaacatcatgttcagaagcgca2340gttgtttgggttcaacaaaaatga2364<210>2<211>787<212>prt<213>unknown<220><223>人工序列<400>2metserleuthrlysaspalasergluaspglngluaspilelysser151015leuthrmetasnthrserleuvalaspserargleuleuleuilethr202530alaileserserserleuleuleuleuvalleuleuprocysalatyr354045alaalaalaglyleuleuserthrglyilehislyshisproaspleu505560aspthrtrppheleuvalthrgluargserthrtyrvalvalglyala65707580thraspaspglytyrleuleuasnleuhistrpglyaspargleuasn859095gluleuaspasnaspleuasnalathrargilephethrthrthrthr100105110pheasnproproilethrtyralaglnglugluleuproalaphegly115120125glyleuargtyrarggluleualaleulysvalgluleuproasngly130135140valarggluleuasnleuleutyrserglyargserasnmetthrgly145150155160aspserleuleuaspleugluleuglualaglyasntyrthrglyleu165170175thrvalthrleuhistyrgluleuaspvalaspasnaspileilearg180185190argsertyrthrileargasnglyleulyslysglyasnvalasnleu195200205serlysalaleuseralaalatrphisproproseralametglyleu210215220aspglugluarggluleuleuthrleuserglyasptrpalahisglu225230235240alailethrglnargthrargleuargproglyvalserhisthrval245250255glnserproargglypheproserhisglnsertyrprotyrpheala260265270leuargglnvalprothrglygluthrserproglythrserasnglu275280285valtyrpheglyalaleualatrpserglysertrpgluilethrval290295300aspthrthriletyrglytyrserargilethrglyglyilehishis305310315320glnasppheglytrpthrleugluproglygluserphethrthrpro325330335valphealaalaglytyrthrasngluglyleuproglyalaarglys340345350argmetproarghisvalarglystyrglnleulysasnvallysthr355360365glnglnlyslysgluaspmettyrasnprovalleutyrasnsertrp370375380glualaleuthrpheasnilethrtyrasplysglnilealaleuala385390395400asplysalaalaalametglyilegluleuphealavalaspaspgly405410415trppheglyalaargaspasnaspseralaglyleuglyasptrpphe420425430valasnlysarglyspheprohisglymetlysproleualaasphis435440445valhisasnleuglymetlyspheglyleutrpphegluprogluser450455460pheasnproasnseraspleutyrarglyshisproasptrpalaphe465470475480tyrtyraspglyileproargtyrglualaargasnglnleuleumet485490495asnleuglyleuprogluvalargglutyrleutyrasnargileser500505510thrleuvallysgluileglyileasppheilelystrpaspmetasn515520525argprophealagluvalthrmethisasntyrlysaspargasnpro530535540argglualatrpvalleualavalgluglyphetyrserileileasp545550555560lysleulysglnglupheproaspleumetilegluthrcysalaser565570575glyglyglyargmetaspileglyileleuglnlysvalaspglnala580585590trpthrseraspasnthrargproaspalaargleupheileglntyr595600605glyalasermetpheleuproproargilemettyrglytrpvalthr610615620aspserprotyraspserglnilegluileproleuserpheargphe625630635640hisvalserphemetglyglyleuglyvalglyserasnleuasnasn645650655metglugluseraspilelysglualaalaglytrpilegluleutyr660665670lysglnilearghisvalileglnasnglyaspleuasptrpleuval675680685glnprosercysvalglyaspleuvalalavalserglnthrthrser690695700glnaspargserglualavalvalleualatyrargpheasnserval705710715720pheseraspglnleuasnproleuargleuargtyrleuaspprolys725730735histhrtyrargvalargvaltyrglnaspaspproserthrproser740745750aspglutyrglumetserglyalaleuleuleuserargglyileval755760765leuproglyleuasnasnilemetpheargseralavalvaltrpval770775780glnglnlys785當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12