本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和植物品種鑒別領(lǐng)域，具體涉及一種四倍體北沙柳無性系品種的est-ssr鑒定引物、指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：北沙柳(salixpsammophila)又稱沙柳，分布在中國(guó)大陸的寧夏、山西、陜西、內(nèi)蒙古等地。北沙柳枝稠葉茂，且柔嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含較高的蛋白質(zhì)和脂肪，纖維素含量較低，所含必需氨基酸也較一般禾谷類飼料多，大約與小麥麩含量相近，是牛、羊、駝的好飼料，在冬季飼料缺乏時(shí)，各類家畜都喜吃，為牲畜度荒年的主要飼料之一。在毛烏素沙地，每畝可產(chǎn)風(fēng)干枝葉飼料120—155公斤。此外，北沙柳具有耐旱、耐寒、耐高溫、耐沙埋壓、抗風(fēng)蝕、易繁殖、速生等特性，現(xiàn)已成為中國(guó)西北地區(qū)生態(tài)修復(fù)、園林綠化的主要造林樹種，不僅是碳纖維、生物質(zhì)資源、強(qiáng)化復(fù)合板等的原料，也是沙產(chǎn)業(yè)開發(fā)的主要灌木樹種。隨著北沙柳利用價(jià)值和方式的不斷研發(fā)，為了實(shí)現(xiàn)高效利用北沙柳的目的，需要從現(xiàn)有資源中篩選和培育滿足于不同利用目的的品種或類型。但是目前鑒別北沙柳種質(zhì)及無性系主要技術(shù)是表型性狀鑒別，表型性狀是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，致使表型性狀鑒定法存在局限性，不僅耗時(shí)長(zhǎng)，穩(wěn)定性和一致性都很差。例如，目前在新品種權(quán)申請(qǐng)時(shí)采用的是表型性狀鑒別方法，但是北沙柳的培育引種情況很多，受環(huán)境的影響，每個(gè)品種在不同地方的表型性狀可能不同，這就很有可能造成同一無性系品種重復(fù)申請(qǐng)新品種權(quán)的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)以上問題，提供了一種快速、準(zhǔn)確鑒別北沙柳無性系的est-ssr(experssedsequeneetags-simplesequeneereapts)鑒定引物、指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種四倍體北沙柳無性系品種的ssr鑒定引物，包括核苷酸序列號(hào)為seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物。一種四倍體北沙柳無性系品種的ssr指紋圖譜，所述指紋圖譜如下表所示：一種四倍體北沙柳無性系品種的ssr指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：1)、dna提取采用天根植物dna試劑盒提取北沙柳基因組dna，提取后加入200μlte緩沖液進(jìn)行稀釋，用瓊脂糖凝膠電泳和nanodrop2000對(duì)其含量和純度進(jìn)行檢測(cè)，將濃度調(diào)至50ng·μl-1，合格樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?)、pcr擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳以步驟1)提取的dna為模板，以est-ssr鑒定引物為擴(kuò)增引物，建立pcr反應(yīng)體系并進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用dna分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳；3)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析用genemarkerv2.2.0軟件參照mac-pr的方法對(duì)步驟2)中每個(gè)位點(diǎn)的峰面積進(jìn)行比對(duì)讀取峰圖，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，得到北沙柳無性系指紋圖譜。所述步驟2)中的est-ssr鑒定引物包括核苷酸序列號(hào)為seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物。所述步驟2)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系包括dna模板2體積份，10×buffer2體積份，dntp1.6體積份，mg1.2體積份，rtaq0.2體積份，正向引物0.2體積份，反向引物0.8體積份，m13引物0.8體積份，ddh2o11.2體積份；pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10min，4℃保存。所述步驟3)中讀取峰圖的方法為：a)根據(jù)每個(gè)引物總體的峰趨勢(shì)進(jìn)行判讀主峰和副峰，對(duì)主峰進(jìn)行判讀。b)判讀主峰時(shí)考慮每個(gè)引物的基序，讀取相隔堿基數(shù)大小符合基序的主峰值，熒光量小于500的不讀取峰值。c)根據(jù)北沙柳為四倍體的特性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄峰值：如出現(xiàn)一個(gè)主峰將主峰值讀取四次；如出現(xiàn)兩個(gè)主峰，按照峰面積進(jìn)行讀取記錄，峰面積大的讀三次峰值面積小的讀一次，若兩個(gè)主峰面積一樣大，則兩個(gè)主峰值分別讀取兩次；如出現(xiàn)三個(gè)主峰，讀取方式參照出現(xiàn)兩個(gè)主峰的方式進(jìn)行讀取，峰面積最大的主峰讀取兩次；如出現(xiàn)四個(gè)主峰，每個(gè)主峰值讀取一次。一種四倍體北沙柳無性系品種的ssr指紋圖譜在鑒定四倍體北沙柳無性系品種方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：(1)采用位點(diǎn)的峰面積比對(duì)讀取峰圖的方法，借助四倍體帶型組合的特性，構(gòu)建了僅用1對(duì)多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)的引物區(qū)分48個(gè)北沙柳無性系的指紋圖譜，具有有效、簡(jiǎn)捷、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，可用于我國(guó)四倍體北沙柳無性系、良種及新品種鑒定、鑒別與保護(hù)等方面；(2)est-ssr分子標(biāo)記技術(shù)擴(kuò)增中，使用具有操作簡(jiǎn)便、高分辨率(可達(dá)到1bp)和便于多倍體共顯性統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)法，相比之前相關(guān)研究利用非變性聚丙酰胺技術(shù)，毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜更準(zhǔn)確、更清晰。附圖說明圖1是北沙柳9居群48份無性系采樣地理位置示意；圖2是無性系1-22指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖3是無性系2-1指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖4是無性系2-3指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖5是無性系2-10指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖6是無性系2-11指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖7是無性系2-16指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖8是無性系2-17指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖9是無性系2-18指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖10是無性系2-25指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖11是無性系3-7指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖12是無性系3-9指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖13是無性系3-11指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖14是無性系3-16指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖15是無性系3-24指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖16是無性系3-25指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖17是無性系3-36指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖18是無性系3-27指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖19是無性系4-5指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖20是無性系4-6指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖21是無性系4-8指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖22是無性系4-11指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖23是無性系4-15指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖24是無性系4-18指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖25是無性系4-22指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖26是無性系4-28指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖27是無性系4-29指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖28是無性系4-30指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖29是無性系5-4指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖30是無性系5-12指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖31是無性系5-13指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖32是無性系5-21指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖33是無性系6-5指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖34是無性系6-7指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖35是無性系6-11指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖36是無性系6-36指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖37是無性系7-3指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖38是無性系7-13指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖39是無性系7-17指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖40是無性系7-19指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖41是無性系7-21指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖42是無性系8-21指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖43是無性系8-33指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖44是無性系8-34指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖45是無性系9-7指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖46是無性系9-15指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖47是無性系9-22指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖48是無性系9-24指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖49是無性系9-34指紋圖譜毛細(xì)管電泳峰圖；圖1中p1表示種源區(qū)達(dá)拉特旗保紹圪堵，p2表示種源區(qū)伊金霍洛旗扎薩克鎮(zhèn)，p3表示種源區(qū)烏審旗查汗淖爾，p4表示種源區(qū)烏審旗烏蘭陶勒蓋鎮(zhèn)高勒，p5表示種源區(qū)烏審旗烏蘭陶勒蓋鎮(zhèn)敖包，p6表示種源區(qū)鄂托克前旗城川鎮(zhèn)，p7表示種源區(qū)馬季溝，p8表示種源區(qū)蔡馬場(chǎng)，p9表示種源區(qū)駱駝井。具體實(shí)施方式定義：居群：即北沙柳的采樣種源區(qū)，本發(fā)明對(duì)北沙柳的9個(gè)采樣種源區(qū)達(dá)拉特旗保紹圪堵、伊金霍洛旗扎薩克鎮(zhèn)、烏審旗查汗淖爾、烏審旗烏蘭陶勒蓋鎮(zhèn)高勒、烏審旗烏蘭陶勒蓋鎮(zhèn)敖包、鄂托克前旗城川鎮(zhèn)、馬季溝、蔡馬場(chǎng)、駱駝井依次用阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)，分別為1,2,3,4,5,6,7,8,9，各種源區(qū)的具體地理信息見表1；居群內(nèi)無性系編號(hào)：在每個(gè)居群中取50個(gè)無性系樣本，依次用阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)，分別為1,2,3…48,49,50；無性系編號(hào)表示方法：居群編號(hào)–居群內(nèi)無性系編號(hào)，如無性系1-22表示達(dá)拉特旗保紹圪堵種源區(qū)中的第22個(gè)無性系樣本。宋祥碩等(2014)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)，報(bào)道了基于ssr分子(simplesequencerepeats)標(biāo)記(通用引物)的沙柳遺傳多樣性，jiahuixia等(2016)首次報(bào)道北沙柳的染色體核型為四倍體。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體說明。實(shí)施例1表型性狀國(guó)家沙柳種質(zhì)資源保存庫(kù)位于內(nèi)蒙古鄂爾多斯達(dá)拉特旗，采集保存庫(kù)內(nèi)9個(gè)種源區(qū)各48個(gè)無性系樣品，各收集地編號(hào)、地理分布和采樣量如圖1和表1所示。對(duì)其中48個(gè)(48個(gè)無性系編號(hào)如表2中所示)三年生無性系進(jìn)行株高，地徑測(cè)量，每個(gè)無性系測(cè)定5個(gè)分枝角度，同時(shí)每個(gè)無性系上選取當(dāng)年生長(zhǎng)良好的成熟葉片8-13片，集中照相后，利用mapgis67軟件(mapgis是中地?cái)?shù)碼集團(tuán)的產(chǎn)品名稱，是中國(guó)具有完全自主知識(shí)版權(quán)的地理信息系統(tǒng)，是全球唯一的搭建式gis數(shù)據(jù)中心集成開發(fā)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)遙感處理與gis完全融合，支持空中、地上、地表、地下全空間真三維一體化的gis開發(fā)平臺(tái))矢量化處理后，測(cè)量葉片表型性狀，表型性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2所示。試驗(yàn)地地勢(shì)平坦，生長(zhǎng)環(huán)境條件一致，釆樣時(shí)選取生長(zhǎng)良好、無病蟲害的幼嫩葉片，用塑封袋裝好并放入帶冰的保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃低溫冰箱中保存待用。表1:群體采樣信息表2:無性系表型性狀調(diào)查表實(shí)施例2建立指紋圖譜1)、dna提取采用天根植物dna試劑盒提取表2中各無性系的基因組dna，提取后加入200μlte緩沖液(tris和edta配制而成，主要用于溶解核酸，能穩(wěn)定儲(chǔ)存dna和rna)進(jìn)行稀釋，用瓊脂糖凝膠電泳和nanodrop2000(超微量分光光度計(jì))對(duì)其含量和純度進(jìn)行檢測(cè)，將濃度調(diào)至50ng·μl-1，合格樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?)、est-ssr引物篩選取北沙柳同一株不同部位(根、莖、葉、雌花和雄花)的rna進(jìn)行提取，使用等量mrna將五種組織混合并合成cdna，建立cdna文庫(kù)并在lllumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，使用microsatellite(misa)軟件分析查找所有的ssr(simplesequeneereapts，是一種以特異引物pcr為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星dna)，最終保留前后序列均不小于125bp的ssr用于引物設(shè)計(jì)，最后確定168對(duì)ssr引物，通過pcr反應(yīng)、毛細(xì)管電泳檢測(cè)(方法同步驟3)、pcr擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳)，篩選出22對(duì)多態(tài)性豐富、重復(fù)性高，穩(wěn)定性好的est-ssr引物用作圖譜構(gòu)建的基本引物。然后用genemarkerv2.2.0軟件參照mac-pr(esselinketal.,2004)的方法對(duì)每位點(diǎn)的峰面積進(jìn)行比對(duì)讀取峰圖，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。通過matlab編程軟件篩選特異條帶，對(duì)每個(gè)引物在不同無性系的四倍體帶型組合分別進(jìn)行篩選，篩選出僅出現(xiàn)一次的帶型組合數(shù)，再與峰圖進(jìn)行比對(duì)，挑選出僅出現(xiàn)一次帶型組合數(shù)最多，能夠?qū)?8份無性系區(qū)分開的引物。最后確定1對(duì)引物可將48份無性系完全區(qū)分開。該對(duì)引物包括核苷酸序列號(hào)為seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物。3)、pcr擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳核苷酸序列號(hào)為seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物在上海thermofisher公司合成并進(jìn)行ipagr純化。熒光引物m13(5'-tgtaaaacgacggccagt-3'，帶有熒光標(biāo)記的通用引物)在上海捷瑞生物工程有限公司合成并進(jìn)行pag純化。buffer、dntp、mg、rtaq等pcr材料構(gòu)自天根生化科技有限公司。參照tp-m13-ssr毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)法進(jìn)行pcr擴(kuò)增。分別設(shè)計(jì)帶有熒光標(biāo)記的m13引物、5'接有m13序列的est-ssr正向f引物(即正向f引物的前端接m13引物，目的是為了和m13反應(yīng)產(chǎn)生熒光)和est-ssr反向r引物。pcr反應(yīng)體系總體積為20體積份：dna模板2體積份，10×buffer2體積份，dntp(脫氧核糖核苷三磷酸)1.6體積份，mg1.2體積份，rtaq(聚合酶)0.2體積份，接了m13的正向引物0.2體積份，反向引物0.8體積份，m13引物0.8體積份，ddh2o11.2體積份。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10min，4℃保存。用dna分析儀(abi，3730xl，appliedbiosystems，usa)檢測(cè)帶有熒光標(biāo)記的est-ssr擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行毛細(xì)管電泳。4)、建立指紋圖譜用genemarkerv2.2.0(基因標(biāo)記)軟件參照mac-pr(esselinketal.,2004)的方法對(duì)每位點(diǎn)的峰面積進(jìn)行比對(duì)讀取峰圖(如圖2-49所示)，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，得到48份無性系指紋圖譜，如表3所示。讀峰具體方法：a)根據(jù)每個(gè)引物總體的峰趨勢(shì)進(jìn)行判讀主峰和副峰，對(duì)主峰進(jìn)行判讀。b)判讀主峰時(shí)考慮每個(gè)引物的基序，讀取相隔堿基數(shù)大小符合基序的主峰值(如本發(fā)明中est-ssr引物的基序?yàn)?ga)8,讀取峰值時(shí)應(yīng)間隔2bp的整數(shù)倍，目的是防止峰值偏移造成誤差)，熒光量小于500的不讀取峰值。c)根據(jù)沙柳為四倍體的特性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄峰值，如出現(xiàn)一個(gè)主峰將其主峰值讀取四次；(例：主峰值為210bp，讀取為210:210:210:210)如出現(xiàn)兩個(gè)主峰，按照峰面積進(jìn)行讀取記錄，峰面積大的重復(fù)讀兩次，若兩個(gè)主峰面積一樣大，則分別讀取兩次。(例：主峰值為210bp和212bp，210bp峰面積大于212bp，讀取為210:210:210:212，若主峰值面積一樣大，讀取為210:210:212:212。)如出現(xiàn)三個(gè)主峰，讀取方式參照出現(xiàn)兩個(gè)主峰的方式進(jìn)行讀取，峰面積大的主峰讀取兩次。如出現(xiàn)四個(gè)主峰，每個(gè)主峰值讀取一次。表3est-ssr引物擴(kuò)增48個(gè)北沙柳無性系的不同大小片段構(gòu)建的指紋圖譜序號(hào)無性系編號(hào)四倍體帶型組合序號(hào)無性系編號(hào)四倍體帶型組合11-22290:294：294:296254-28288:288：288:29022-1288:288：294:300264-29288:288：298:30032-3282:288：288:300274-30274:276：288:29042-10288:288：288:298285-4274:274：288:29052-11274:288：296:300295-12274:290：290:29462-16290:290：296:300305-13288:290：290:30272-17284:284：288:288315-21282:288：288:29082-18288:288：306:306326-5304:304：304:30492-25290:290：292:292336-7288:288：296:298103-7284:288：294:296346-11276:284：288:288113-9282:288：290:296356-36288:288：290:296123-11274:288：288:298367-3296:296：296:296133-16272:272：290:296377-13288:290：296:296143-24282:288：288:294387-17290:290：290:292153-25274:276：284:294397-19284:288：288:296163-26290:290：298:298407-21290:296：296:296173-27298:298：298:298418-21290:294：294:294184-5272:290：290:296428-33294:294：294:294194-6274:296：296:296438-34274:284：288:288204-8276:276：296:302449-15272:288：288:294214-11282:290：290:296459-22276:288：288:288224-15298:298：300:300469-7278:288：288:290234-18276:288：290:298479-34282:282：290:298244-22288:288：288:302489-24288:294：296:298應(yīng)用實(shí)施例獲得未知北沙柳無性系的葉片材料，根據(jù)實(shí)施例2的方法和步驟，用核苷酸序列號(hào)為seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，讀取引物對(duì)應(yīng)的片段大小為287.9:287.9:294.2:299.8，對(duì)該未知北沙柳無性系在北沙柳無性系指紋圖譜(表3)中進(jìn)行鑒定，可知，該未知北沙柳無性系為北沙柳無性系2-1。sequencelisting<110>內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種四倍體北沙柳無性系品種的est-ssr鑒定引物、指紋圖譜及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1accgtttcattaaccgctcc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agaaatcacgcctctctcca20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3tgtaaaacgacggccagt18當(dāng)前第1頁12