一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種核糖體rrna熒光探針，具體地說是一種核糖體rrna雙光子熒光探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及其制備方法和用途。

二、

背景技術(shù)：

最近德國生物化學家thomascarell在《科學》雜志上提出，rna是形成所有生命的首個自復制分子，可以作為生命的起源物質(zhì)。rna分子包括轉(zhuǎn)運rna(trna)，信使rna(mrna)和核糖體rna(rrna)，具有很多功能，如體內(nèi)運輸、遺傳信息的解讀、基因表達的調(diào)控以及一些必要的生物催化作用。其中rrna是細胞內(nèi)含量最多的rna，它可以在核仁內(nèi)與蛋白結(jié)合，產(chǎn)生核糖體。借助rrna熒光探針，可以在共聚焦顯微鏡下觀察rrna在體內(nèi)的存在狀態(tài)和活動行為。但是很多分子對細胞核膜穿透性差，難以進入細胞核內(nèi)，所以有關(guān)rrna探針的報道不多。目前，市場上唯一可利用的是syto系列rna探針，由于syto探針的分子結(jié)構(gòu)至今沒有公開，大大限制了對syto探針進一步的研究。

2006年，紐約大學的qianli和young-taechang用三種吡啶鹽來識別活細胞中的rna，同年，杜倫大學的davidparker課題組用eu配合物來特異性識別核仁，但是以上的rna探針都是單光子熒光探針。相對于單光子探針，雙光子熒光探針具有高穿透性，低的細胞損傷，長波長可避免生物體內(nèi)自發(fā)熒光干擾等特點。發(fā)明人課題組在2016年的chemicalscience上報道了雙光子比率熒光探針對dna和rna的識別。以上提到的探針都是同時識別細胞核仁和細胞質(zhì)中的rna，不能特異性識別rrna、mrna或trna。合成特異性識別rrna的探針，對檢測細胞內(nèi)rrna的狀態(tài)和活動具有重要意義。

申請人對本申請的主題進行了如下的文獻檢索：

1、http://scholar.glgoo.org/網(wǎng)檢索結(jié)果：(2017/6/19)

2、中國知網(wǎng)檢索結(jié)果：

檢索方式一：

篇名-一種水溶性雙光子熒光核糖體rna探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及制備方法：無相關(guān)文獻。

篇名-一種水溶性雙光子熒光rna探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及制備方法：無相關(guān)文獻。

篇名-一種水溶性熒光rna探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及制備方法：無相關(guān)文獻。

檢索方式二：

全文-一種水溶性雙光子熒光核糖體rna探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及制備方法：45篇相關(guān)文獻，均與水溶性雙光子熒光核糖體rna探針無關(guān)。

全文-一種水溶性雙光子熒光核糖體rna探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及制備方法：331篇相關(guān)文獻，均與水溶性雙光子熒光核糖體rna探針無關(guān)。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種核糖體rrna雙光子熒光探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物及其制備方法和用途。所要解決的技術(shù)問題是通過分子設(shè)計合成特異性識別rrna的雙光子熒光探針。

水溶性是許多有機分子探針的主要缺陷。季銨鹽作為有機分子的修飾基團，一方面，大大提高了有機物的水溶性，使其與無機鹽具有相似的水溶性；另一方面，帶正電荷的季銨鹽易與細胞內(nèi)帶負電荷的物質(zhì)如rna相互吸引。三聯(lián)吡啶作為疏水基團可以通過π-π相互作用，固定在具有螺旋結(jié)構(gòu)的rrna空腔內(nèi)。季銨鹽和三聯(lián)吡啶共同作用有可能獲得對rrna具有特異性響應的探針?；谝陨纤枷耄景l(fā)明分別以季銨鹽(a)和三聯(lián)吡啶(a')為受體，以苯環(huán)作為π橋，合成一種a-π-a'結(jié)構(gòu)的目標化合物j1。性質(zhì)研究表明，該目標分子具有良好的水溶性和雙光子熒光性質(zhì)，可以與rna結(jié)合。在細胞內(nèi)可以穿過細胞膜和核膜，特異性識別細胞核仁內(nèi)的rrna，該化合物在生命科學研究領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

本發(fā)明核糖體rrna雙光子熒光探針(j1)，是一種季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物，結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明核糖體rrna雙光子熒光探針的合成方法，包括如下步驟：

步驟1：中間體b1的合成

稱取2g(4.85mmol)n，n-二羥乙基苯胺三聯(lián)吡啶(q1)于150ml圓底燒瓶中，加入80ml乙腈和20mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶劑，通入n2，在冰浴條件下緩慢滴加1.97g(7.2mmol)三溴化磷，然后逐漸升溫至80℃，加熱回流反應8h；反應結(jié)束后冷卻至室溫，倒入冰水中調(diào)節(jié)ph至中性，抽濾、水洗并干燥得到淡黃色固體；所得淡黃色固體依次經(jīng)水洗、萃取并干燥，柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v/v)，得白色固體，即為中間體b1；

步驟1中所用原料n，n-二羥乙基苯胺三聯(lián)吡啶(q1)的合成參考文獻(daltontrans.,2015,44,8041-8048.本課題組工作)。

步驟2：目標產(chǎn)物j1的合成

在100ml高壓反應釜中，稱取2g(3.72mmol)n，n-二溴乙基苯胺三聯(lián)吡啶溶于20ml四氫呋喃中，再加入60ml40％三甲胺水溶液(354mmol)，在90℃條件下加熱攪拌反應10h，反應結(jié)束后自然冷卻至室溫，濃縮溶劑，除水，二氯甲烷洗滌，干燥，得到淡黃色固體；將1g(1.52mmol)所得淡黃色固體溶于20ml甲醇中，加到100ml圓底燒瓶中，避光條件下，將0.54g(3.04mmol)agno3溶于甲醇中，加入反應液中，常溫下攪拌反應0.5h，反應結(jié)束后用硅藻土抽濾，取濾液，旋干溶劑，得黃色固體即為目標產(chǎn)物j1。

本發(fā)明合成路線如下：

本發(fā)明核糖體rrna雙光子熒光探針-季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物的用途，是作為特異性識別細胞內(nèi)rrna熒光探針的應用。

本發(fā)明j1的生物學研究如下：

將肝癌細胞(hepg2)細胞種在激光共聚焦小皿上，每個孔接種10⁴個細胞，用1.5ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)24-36h。j1配成10^-3m的母液，向培養(yǎng)基中加入15μl的j1母液，在細胞培養(yǎng)箱中染色30min，用pbs洗三遍，可直接用于顯影。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1、本發(fā)明目標產(chǎn)物j1水溶性好(圖2)，作為熒光探針更適宜應用在生物體內(nèi)。

2、本發(fā)明目標產(chǎn)物j1比syto9的光穩(wěn)定性好(圖3)，可以在共聚焦顯微鏡下長時間觀察顯微成像。

3、本發(fā)明目標產(chǎn)物j1可以通過雙光子熒光增強對rna進行識別(圖4)，是一種雙光子熒光增強的識別效應，低能量的長波(710nm)激發(fā)對生物體損傷小。

4、特異性識別細胞核仁內(nèi)的rrna(圖5)，j1與核仁商染syto9在細胞核仁處的共定位效果很好，皮爾森系數(shù)可達到90％。

5、本發(fā)明目標產(chǎn)物j1具有良好的腫瘤和腎臟組織穿透性(圖7)，在腫瘤組織雙光子顯微成像深度可達100μm左右。

6、本發(fā)明目標產(chǎn)物j1的原料易得，成本低，合成步驟簡單，合成高效，產(chǎn)率達到90％以上。

四、附圖說明

圖1是j1的單晶橢球圖，表明合成的季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物是尚未見報道且結(jié)構(gòu)明確的新物質(zhì)。

圖2中a是濃度從10μm到100μmj1水溶液的紫外-可見吸收光譜圖，由圖可見，隨著j1濃度的增加，吸光度不斷增大；b是吸光度隨濃度增加的變化圖，由圖可見，吸光度隨濃度的變化成線性關(guān)系，說明j1在10μm到100μm濃度范圍內(nèi)水溶性很好。

圖3是j1與商染syto9的光穩(wěn)定性對比圖，由圖可見，j1比商染syto9的光穩(wěn)定性更好，說明j1具有很好的光穩(wěn)定性。

圖4是j1在pbs緩沖液中和710nm激發(fā)光源下對rna識別的雙光子激發(fā)熒光(tpef)光譜。從圖中可以看出隨著rna的增加，雙光子熒光逐漸增強。說明j1對rna具有雙光子熒光增強的識別效果。

圖5是j1分別與細胞核仁商染(syto9)和細胞核商染(nuc-red)共定位圖。表明j1可以特異性識別細胞核仁。

圖6是j1對細胞核仁染色的高分辨圖。與普通的共聚焦顯微成像(圖4)相比，可以清晰地將細胞核仁內(nèi)的rrna密集纖維組分(dfc)和細胞核內(nèi)rdna聚集的纖維中心(fc)區(qū)分開，進一步表明j1特異性識別細胞核仁內(nèi)的rrna。

圖7中a是j1在腫瘤塊上的雙光子共聚焦顯微成像圖；b圖是j1在腫瘤塊中在不同深度的雙光子顯影圖，100μm仍可以觀察到顯微成像，表明雙光子熒光具有較深的穿透效果；c圖i是小鼠腎臟組織上的雙光子共聚焦顯微成像圖，ii是放大圖。(以上雙光子顯微成像用800nm的激發(fā)光)。表明j1具有良好的腫瘤和腎臟組織穿透性，可以對腫瘤塊和腎臟組織進行生物顯影。

五、具體實施方式

本發(fā)明核糖體rrna雙光子熒光探針(j1)，是一種季銨鹽三聯(lián)吡啶衍生物，結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明核糖體rrna雙光子熒光探針的合成方法，包括如下步驟：

步驟1：中間體b1的合成

稱取2g(4.85mmol)n，n-二羥乙基苯胺三聯(lián)吡啶(q1)于150ml圓底燒瓶中，加入80ml乙腈和20mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶劑，通入n2，在冰浴條件下緩慢滴加1.97g(7.2mmol)三溴化磷，然后逐漸升溫至80℃，加熱回流反應8h；反應結(jié)束后冷卻至室溫，倒入冰水中調(diào)節(jié)ph至中性，抽濾、水洗并干燥得到淡黃色固體；所得淡黃色固體依次經(jīng)水洗、萃取并干燥，柱層析分離(石油醚：乙酸乙酯＝2:1，v/v)，得白色固體，即為中間體b1，產(chǎn)率:90％。

ft-ir(kbrcm^-1):514(c-br),1275(c-n),1389(c-h),1584(c＝n).¹h-nmr(d6-dmso,400mhz,ppm)δ:8.76(d,j＝4.3hz,2h),8.65(d,j＝4.7hz,4h),8.03(t,j＝7.7hz,2h),7.82(d,j＝8.5hz,2h),7.52(dd,j＝6.6,5.5hz,2h),6.94(d,j＝8.6hz,2h),3.88(t,j＝7.2hz,4h),3.66(t,j＝7.1hz,4h).¹³cnmr(d6-dmso,100mhz,ppm)δ:155.45,155.19,149.27,149.04,147.22,137.36,128.03,125.25,124.34,120.85,116.53,112.32,51.72,29.75.anal.calcd.forc25h22n4br2:c,55.78；h,4.12；n,10.41％.found:c,55.74；h,4.20；n,10.40％.maldi-tof-ms:cal:536.02,found:537.43[m+1].

步驟1中所用原料n，n-二羥乙基苯胺三聯(lián)吡啶(q1)的合成參考文獻(daltontrans.,2015,44,8041-8048.本課題組工作)。

步驟2：目標產(chǎn)物j1的合成

在100ml高壓反應釜中，稱取2g(3.72mmol)n，n-二溴乙基苯胺三聯(lián)吡啶溶于20ml四氫呋喃中，再加入60ml40％三甲胺水溶液(354mmol)，在90℃條件下加熱攪拌反應10h，反應結(jié)束后自然冷卻至室溫，濃縮溶劑，除水，二氯甲烷洗滌，干燥，得到淡黃色固體；將1g(1.52mmol)所得淡黃色固體溶于20ml甲醇中，加到100ml圓底燒瓶中，避光條件下，將0.54g(3.04mmol)agno3溶于甲醇中，加入反應液中，常溫下攪拌反應0.5h，反應結(jié)束后用硅藻土抽濾，取濾液，旋干溶劑，得黃色固體即為目標產(chǎn)物j1，產(chǎn)率約92％。

m.p.:195℃.ft-ir(kbrcm^-1):3430(s),3023(w),1591(s),1523(m),1384(s),1203(m),813(m).¹h-nmr(d2o,400mhz,ppm)δ:8.15(d,2h),7.90(s,2h),7.69(d,2h),7.45(t,2h),7.21(t,4h),6.32(d,2h),3.65(t,4h),3.38(t,4h),3.18(s,18h).¹³c-nmr(100mhz,d2o):δ＝153.89,153.79,147.93,147.56,145.86,138.00,127.57,125.23,124.24,121.95,116.20,112.08,61.05,53.50,43.89.anal.calcd.forc31h40n8o6:c,59.99；h,6.50；n,18.05％.found:c,60.08；h,6.34；n,18.23％.esi-ms:m/z²⁺＝248.42.

本發(fā)明j1的生物學研究如下：

將肝癌細胞(hepg2)細胞種在激光共聚焦小皿上，每個孔接種10⁴個細胞，用1.5ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)24-36h。j1配成10^-3m的母液，向培養(yǎng)基中加入15μl的j1母液，在細胞培養(yǎng)箱中染色30min，用pbs洗三遍，可直接用于顯影。