本發(fā)明涉及蔬菜害蟲的分子鑒定技術(shù)，特別涉及一種鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性的分子檢測方法。
背景技術(shù)：
：西花薊馬frankliniellaoccidentalis(pergande)又名苜蓿薊馬，屬纓翅目(thysanoptera)，薊馬科(thripidae)，世界各地均有分布。2000年在我國昆明首次被發(fā)現(xiàn)，此后迅速傳播并成為田間作物的主要害蟲之一。西花薊馬食性雜，對幾乎所有開花的植物均可造成危害。目前，對其防治以農(nóng)藥防治為主，物理防治和生物防治為輔。而化學(xué)防治中又以多殺菌素的防治效果最為顯著，但由于長期大面積的反復(fù)施用，已經(jīng)導(dǎo)致了田間的西花薊馬對多殺菌素產(chǎn)生抗性。為了有效防治西花薊馬，鑒定田間西花薊馬種群對多殺菌素的抗性水平，采取的防治措施是否恰當非常重要。目前測定西花薊馬抗性水平的主要方法為生物測定，即采集至少300頭西花薊馬，配制5～6個濃度梯度的多殺菌素對其進行處理，然后觀察記錄西花薊馬的半數(shù)致死濃度。該方法十分繁瑣，需要捕捉相當大數(shù)量的西花薊馬才能進行測定，而且通常需要進行兩次或多次試驗才能得到結(jié)果，耗費時間長，工作量大。有研究表明西花薊馬煙堿型乙酰膽堿受體nachrs的a6亞基是多殺菌素的作用受體。nachra6亞基基因的全長序列已于2016年由本實驗室的何秉青碩士克隆并且已在genbank上登陸(登陸id＝ku557780.1)。目前還尚未見到研究nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例與西花薊馬對多殺菌素抗性之間的關(guān)系，以及如何利用nachra6亞基基因，采用分子檢測方法對田間西花薊馬抗性水平進行鑒定的報道，更未見到應(yīng)用nachra6亞基基因來檢測西花薊馬多殺菌素抗性水平的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：根據(jù)上述領(lǐng)域的不足和需求，本發(fā)明提供一種鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性水平的方法，通過構(gòu)建抗性倍數(shù)與nachra6亞基缺失型比例的線性模型，運用分子生物學(xué)方法鑒定西花薊馬種群對多殺菌素的抗性水平，僅僅需要20～50頭待測種群西花薊馬即可完成鑒定，具有快速、便捷、準確的優(yōu)點。請求保護的技術(shù)方案如下：一種鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性的方法，其特征在于，步驟如下：(1)隨機捕捉20～50頭待測種群的西花薊馬，提取總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna；(2)以所述cdna為模板，用西花薊馬煙堿型乙酰膽堿受體nachra6亞基全長基因的特異性引物進行pcr，得到pcr產(chǎn)物；(3)將所述pcr產(chǎn)物與克隆載體進行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆進行測序；(4)對測序結(jié)果進行分析，統(tǒng)計缺失nachra6亞基基因編碼序列的陽性克隆數(shù)，以其為分子，以測序的陽性克隆數(shù)為分母，計算得到待測種群的nachra6亞基缺失型比例x；(5)獲取“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”的標準曲線方程，其橫坐標x為以西花薊馬已知種群為系列待測樣品，按照步驟(1)－(4)的方法測得的nachra6亞基缺失型比例，縱坐標y為所述西花薊馬已知種群對多殺菌素的抗性倍數(shù)以10為底的對數(shù)；(6)將步驟(4)計算得到的待測種群的nachra6亞基缺失型比例x代入所述“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”的標準曲線方程中，計算y的值，即得到待測種群對多殺菌素的抗性倍數(shù)以10為底的對數(shù)；y的值越大，則待測種群對多殺菌素的抗性越高；所述抗性倍數(shù)是指多殺菌素對待測種群的半數(shù)致死濃度除以多殺菌素對敏感種群的半數(shù)致死濃度所得的商。優(yōu)選地，所述“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”的標準曲線方程為y＝5.395x-1.1906。優(yōu)選地，所述多殺菌素對敏感種群的半數(shù)致死濃度為0.072mg/l。優(yōu)選地，所述西花薊馬煙堿型乙酰膽堿受體nachra6亞基全長基因的特異性引物如下：a6-cds-f1：5’-accttctccatgtcgcgtag-3’，a6-cds-r1：5’-cagtgctcgaatcactgcac-3’。優(yōu)選地，所述pcr的反應(yīng)體系如下：2xgc緩沖液i10.0ul，dntps2.0ul，10um的a6-cds-f10.5ul，10um的a6-cds-r10.5ul，cdna2.0ul，lataq聚合酶0.2ul，ddh2o4.8ul。優(yōu)選地，所述pcr的反應(yīng)程序為：95℃5min；95℃30s，63℃30s，72℃130s，35個循環(huán)；72℃10min。為獲取“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”的標準曲線方程，采用對多殺菌素具有不同抗性的西花薊馬已知種群，優(yōu)選對多殺菌素的抗性呈梯度增長的種群，利用生物測定方法(例如，葉管藥膜法，或其它本領(lǐng)域公知的方法)檢測每個已知種群對多殺菌素的抗性，得到多殺菌素對每個已知種群的半數(shù)致死濃度，然后除以多殺菌素對敏感種群的半數(shù)致死濃度，所得的商即為抗性倍數(shù)。所述nachra6亞基缺失型比例＝nachra6亞基缺失型克隆數(shù)量/總的陽性克隆數(shù)量，其中nachra6亞基缺失型克隆數(shù)量指缺失部分(例如，缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多個堿基，缺失一段或更多段核苷酸序列)或全部nachra6亞基基因編碼序列的陽性克隆數(shù)。本發(fā)明以本實驗室飼養(yǎng)和篩選的5個不同抗性水平的西花薊馬室內(nèi)種群(敏感種群、低抗種群、中抗種群、高抗種群和極高抗性種群)為研究對象，采用生物測定方法檢測了每個種群對多殺菌素的抗性水平，其中多殺菌素對敏感種群的半數(shù)致死濃度為0.072mg/l，將其抗性倍數(shù)設(shè)為1，然后用其它種群的半數(shù)致死濃度分別除以0.072mg/l，得到低抗種群、中抗種群、高抗種群和極高抗性種群的抗性倍數(shù)。并根據(jù)nachra6亞基的基因序列(genbankid＝ku557780.1)，設(shè)計了nachra6亞基全長基因的特異性引物a6-cds-f1/a6-cds-r1，利用該全長引物對5個種群的cdna進行pcr反應(yīng)，得到pcr產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和測序后，統(tǒng)計每個種群的測序結(jié)果中缺失nachra6亞基基因編碼序列的陽性克隆數(shù)，除以測序的陽性克隆數(shù)，得到nachra6亞基缺失型比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)nachra6亞基缺失型比例與西花薊馬對多殺菌素的抗性呈正相關(guān)，基于此建立了“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”線性模型，獲得了回歸直線方程式y(tǒng)＝5.395x-1.1906,相關(guān)系數(shù)r2＝0.9804，其中y表示以10為底抗性倍數(shù)的對數(shù)值，x表示nachra6亞基缺失型比例。發(fā)明人利用田間種群的試驗對該線性模型進行了驗證，如圖2所示，田間種群的數(shù)據(jù)與線性模型基本符合。對田間數(shù)據(jù)的擬合度進行卡方檢驗，結(jié)果表明田間種群數(shù)據(jù)與模型預(yù)測數(shù)據(jù)之間無顯著差異，說明該“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”線性模型適用于田間情況。本發(fā)明提供的鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性的方法，結(jié)合rt-pcr技術(shù)及統(tǒng)計學(xué)方法，建立了一種快速高效的鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性水平的分子鑒定方法。由于本發(fā)明方法的核心是采用分子生物學(xué)方法進行檢測和統(tǒng)計，因此，在檢測一個地區(qū)或一定區(qū)域的田間西花薊馬的抗性水平時，只需要捕捉20～50頭西花薊馬作為檢測樣品，獲得cdna用作pcr的模板，不需要捕捉大量的西花薊馬用于生物測定以判定其多殺菌素抗性水平，大大減少了抗性測定所需的工作量，節(jié)約了時間。通過檢測田間西花薊馬的nachra6亞基缺失型比例，即可參照該線性模型計算得到對應(yīng)的抗性倍數(shù)，判斷該西花薊馬種群的抗性水平，具有簡便、快速、可靠的優(yōu)點，為進一步制定防治手段和用藥策略提供指導(dǎo)和依據(jù)。附圖說明圖1.西花薊馬敏感種群總rna電泳圖。圖2.西花薊馬nachra6亞基缺失型比例與抗性倍數(shù)的線性回歸關(guān)系圖，其中，橫坐標為nachra6亞基缺失型比例，縱坐標為log10(抗性倍數(shù))。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，需要理解的是，下述實施例僅作為解釋和說明，不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。生物材料西花薊馬的敏感種群(ivf03)、低抗種群(spin-low)、中抗種群(spin-mid)、高抗種群(spin-high)和極高抗種群(spin-r)，均為本實驗室飼養(yǎng)的西花薊馬種群。其中，敏感種群于2003年采自北京海淀田間，此后一直以無藥的豆角飼喂10年以上而得。低抗種群(spin-low)、中抗種群(spin-mid)、高抗種群(spin-high)和極高抗種群(spin-r)是以實驗室飼養(yǎng)的西花薊馬敏感種群(ivf03)為原始種群，用多殺菌素持續(xù)汰選多代而得。汰選方法參照侯文杰，李飛，吳青君，等.(2013).西花薊馬對多殺菌素的抗性生化機制研究.應(yīng)用昆蟲學(xué)報，50，1042-1048。以上生物材料本實驗室亦有保存，申請人聲明，可自申請日起二十年內(nèi)向公眾免費發(fā)放用于必要的驗證實驗。石家莊種群(sjz)：石家莊種群西花薊馬為從石家莊田間采集而得。北京延慶種群(yq)：北京延慶種群西花薊馬為從北京延慶田間采集而得。西藏種群(xz)：西藏種群西花薊馬為從西藏拉薩田間采集而得。貴州種群(gz)：貴州種群西花薊馬為從貴州貴陽田間采集而得。北京海淀種群(hd)：北京海淀種群西花薊馬為從北京海淀田間采集而得。主要試劑2xgcbufferi(緩沖液)，購買自takara公司；lataqpolymerase(聚合酶)，購買自takara公司；peasy-t1cloningvector(克隆載體)，購買自全式金公司；以下實施例中，未特別說明的生物化學(xué)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得或商購獲得，規(guī)格為實驗室純級即可；未特別說明的實驗方法均為本領(lǐng)域常規(guī)方法，可按照本領(lǐng)域常規(guī)實驗方法的體系和步驟進行。實施例1.室內(nèi)實驗種群對多殺菌素的抗性的生物測定對西花薊馬的室內(nèi)毒力測定采用葉管藥膜法，具體方法如下：配藥浸管：用0.01％曲拉通溶液作為空白對照，0.01％的曲拉通溶液將藥劑梯度稀釋成5～6個濃度梯度。取用塑料吸管吸取藥劑溶液，注滿該濃度對應(yīng)的1.5ml離心管，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)。蓋好蓋子后將離心管水平放置于避光處，4小時后倒掉藥液，用剪刀在離心管底部剪直徑約5mm的小孔，然后置于通風(fēng)櫥中吹干待用。浸葉裝管：摘取新鮮的甘藍葉片，用蒸餾水浸濕的脫脂棉擦凈葉表面。取直徑1.5cm的打孔器，將葉片打成圓形小葉片，每個濃度藥液中浸4片，每片浸10s，取出后置于干凈的濾紙上晾干表面液體。用剪刀將干凈的吸水紙剪成1cmx1cm的小紙片。用鑷子將濾紙片和浸藥晾干后的葉片加入對應(yīng)的帶藥離心管中，使其水平放置于離心管中部。接蟲：使用橡膠吸蟲管接蟲。把離心管套在吸蟲管的一頭，從養(yǎng)蟲罐中吸取健壯的西花薊馬雌成蟲，每次15-20頭，接入離心管中。用封口膜將離心管底的小孔封住后，取下離心管并蓋上蓋子，水平放置。接蟲后將所有的離心管水平置于托盤中，放置在25℃，光照比16：8的培養(yǎng)箱中。48h后取出，統(tǒng)計各濃度下的西花薊馬死亡率。判斷西花薊馬是否死亡的標準為：用毛筆尖輕輕碰觸薊馬蟲體，不能爬出一個蟲體長度的試蟲視作已死亡。使用poloplus軟件統(tǒng)計并分析生測數(shù)據(jù)，得到西花薊馬對該藥劑的lc50值(半數(shù)致死濃度)，95％置信區(qū)間和斜率等數(shù)據(jù)。結(jié)果如表1所示，四個抗性種群(spin-low、spin-mid、spin-high、spin-r)相對于敏感種群(ivf03)的抗性倍數(shù)分別為十倍級、百倍級、千倍級和萬倍級，呈階梯式增長。表1西花薊馬室內(nèi)種群對多殺菌素的敏感性測定實施例2.鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性的方法建立1、引物設(shè)計根據(jù)已知的西花薊馬煙堿型乙酰膽堿受體nachra6亞基基因序列(genbank登陸id為ku557780.1)設(shè)計特異全長引物，引物序列如下：a6-cds-f1：5’-accttctccatgtcgcgtag-3’，a6-cds-r1：5’-cagtgctcgaatcactgcac-3’。2、cdna的獲得以5個室內(nèi)西花薊馬種群(敏感種群、低抗種群、中抗種群、高抗種群和極高抗性種群)為研究對象，每個種群隨機選取20～50頭，分別提取每個種群的總rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna。電泳結(jié)果表明，所提取的西花薊馬總rna包含18s和28srrna清晰條帶(圖1顯示了西花薊馬敏感種群總rna提取效果)，說明提取的rna質(zhì)量較高，其反轉(zhuǎn)錄的cdna可以作為下一步pcr反應(yīng)的模板dna。3、nachra6亞基的基因克隆和測序以5個室內(nèi)西花薊馬種群的cdna為模板，以a6-cds-f1/a6-cds-r1為引物，用takara的2xgcbufferi(緩沖液)和lataqpolymerase(聚合酶)，按照如下體系和程序進行pcr。pcr反應(yīng)體系：組分用量2xgcbufferi10.0uldntps2.0ula6-cds-f1(10um)0.5ula6-cds-r1(10um)0.5ulcdna2.0ullataqpolymerase0.2ulh2o4.8ul總體積20.0ulpcr反應(yīng)程序：階段溫度時間步驟195℃5min步驟295℃30s步驟363℃30s步驟472℃130s步驟5回到步驟235個循環(huán)步驟672℃10min步驟74℃不限對pcr產(chǎn)物進行純化，得到目的片段。將目的片段連接到peasy-t1克隆載體中，得到連接產(chǎn)物。按照《分子克隆實驗指南》中的熱激轉(zhuǎn)化法，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.colidh5α感受態(tài)細胞，然后按照上述pcr反應(yīng)體系和程序進行菌液pcr，挑選出陽性克隆進行測序。4、序列分析對測序結(jié)果進行分析和統(tǒng)計，獲得nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本數(shù)量(即，缺失nachra6亞基基因編碼序列的陽性克隆數(shù)，所述缺失nachra6亞基基因編碼序列指缺失部分或全部nachra6亞基基因編碼序列)。通過公式“nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例＝nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本數(shù)量/總的測序的陽性克隆數(shù)量”獲得各室內(nèi)種群的nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例。結(jié)果如表2所示，西花薊馬的多殺菌素抗性水平與nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例具有正相關(guān)關(guān)系。表2西花薊馬室內(nèi)種群nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例種群缺失型轉(zhuǎn)錄本比例log10(抗性倍數(shù))ivf0321.7％0spin-low42.3％0.987spin-mid57.1％2.000spin-high100％3.833spin-r100％4.556用sigmaplot軟件對表2的數(shù)據(jù)進行分析并建立線性回歸模型，得到如圖2所示的“nachra6亞基缺失型比例-抗性倍數(shù)”線性模型。回歸直線方程為y＝5.395x-1.1906，相關(guān)系數(shù)r2＝0.9804，其中y表示以10為底抗性倍數(shù)的對數(shù)值，x表示nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例。實施例3、“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”線性模型的驗證為了驗證實施例2中所建立的“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”線性模型是否適用于田間情況，我們采集了石家莊、北京延慶、西藏、貴州和北京海淀五個地區(qū)的田間西花薊馬種群，對這5個田間種群的多殺菌素抗性分別進行生物測定和實施例2中的分子生物學(xué)測定。按照實施例1的方法對5個田間種群的多殺菌素抗性分別進行生物測定，得到各西花薊馬田間種群對多殺菌素的抗性倍數(shù)(如表3所示)。分子生物學(xué)測定：按照實施例2中的方法進行，提取5個田間種群的總rna并進行rt-pcr，純化pcr產(chǎn)物，與peasy-t1克隆載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆進行測序，對測序結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得到各田間種群的nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例(如表4所示)。5個西花薊馬田間種群的生物測定結(jié)果和nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例分別如表3、表4所示。表3西花薊馬田間種群對多殺菌素的敏感性測定表4西花薊馬田間種群nachra6亞基缺失型轉(zhuǎn)錄本比例將表4的數(shù)據(jù)代入實施例2中獲得的“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”線性模型，結(jié)果如圖2所示，可以看出田間種群的數(shù)據(jù)與線性模型基本符合。用卡方檢驗對田間數(shù)據(jù)的擬合度進行檢驗，所得卡方值為0.048(p＞0.05)，表明田間種群數(shù)據(jù)與模型預(yù)測數(shù)據(jù)之間無顯著差異，說明本發(fā)明的“nachra6亞基缺失型比例－抗性倍數(shù)”線性模型同樣適用于田間情況。sequencelisting<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所<120>一種鑒定西花薊馬對多殺菌素抗性的分子檢測方法<130>p170125/sch<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>用于擴增西花薊馬nachra6亞基基因片段的上游引物a6-cds-f1<400>1accttctccatgtcgcgtag20<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>用于擴增西花薊馬nachra6亞基基因片段的下游引物a6-cds-r1<400>2cagtgctcgaatcactgcac20當前第1頁12