本發(fā)明屬于水稻育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及水稻赤霉素合成基因osga3ox1的一種全新的應(yīng)用和一種相關(guān)的新型水稻不育株系的創(chuàng)制方法，具體涉及osga3ox1基因在水稻雄性不育株系創(chuàng)制中的應(yīng)用、應(yīng)用osga3ox1基因創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法以及通過此種方法創(chuàng)制的水稻雄性不育株系的育性恢復(fù)方法。
背景技術(shù)：
：獲得不育系是水稻中進行雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)。目前水稻生產(chǎn)中應(yīng)用的不育系主要為細胞質(zhì)(質(zhì)核互作)雄性不育系和光溫敏核不育系。相關(guān)制種也相應(yīng)分為″三系″及″兩系″制種?！迦怠逑到y(tǒng)由于受恢保關(guān)系限制存在配組不自由的問題，并且由于育性恢復(fù)非簡單地受單基因控制，又增加了恢復(fù)系或保持系培育的難度，因此，″三系″育種年限較長，效率低下，而″兩系″不育系也存在育性轉(zhuǎn)換臨界溫度受遺傳背景影響較大、難以預(yù)測的問題，而且由于極端天氣的影響，″兩系″制種面臨較高風(fēng)險。雖然能克服上述缺點的利用核隱性不育基因的spt技術(shù)已初步應(yīng)用于水稻生產(chǎn)，但這種方法存在必須依賴專門昂貴設(shè)備的問題，而且技術(shù)較為復(fù)雜，不易為普通育種者掌握。因此，生產(chǎn)中急需培育過程簡單且育性穩(wěn)定的新型不育系。通過基因工程干預(yù)某種生化代謝，使得某種育性維持必須的代謝物缺乏，從而造成不育，而且此種不育材料的育性可通過外源施加缺乏的代謝物而恢復(fù)，這可能是不育系獲得的一種全新途徑，國內(nèi)外已有一些研究者進行了有益嘗試[baehk，kangh-g，kimg-j，etal.transgenicriceplantscarryingrnainterferenceconstructsofaos(alleneoxidesynthase)genesshowseveremalesterility.plantbreeding，2010，129：647-651；huangs，cernyre，qiy，etal.transgenicstudiesontheinvolvementofcytokininandgibberellininmaledevelopment.plantphysiol，2003，131(3)：1270-1282；engelket，hirschej，roitscht.anther-specificcarbohydratesupplyandrestorationofmetabolicallyengineeredmalesterility.jexpbot，2010，61(10)：2693-2706；goetzm，godtde，guivarc′ha，etal.inductionofmalesterilityinplantsbymetabolicengineeringofthecarbohydratesupply.procnatlacadsciusa，2001，98(11)：6522-6527；vandermeerim，stamme，vantunenaj，etal.antisenseinhibitionofflavonoidbiosynthesisinpetuniaanthersresultsinmalesterility.plantcell，1992，4(3)：253-262；yistrab，busscherj，frankenj，etal.flavonolsandfertilizationinpetuniahybrida：localizationandmodeofactionduringpollentubegrowth.plantj，1994，6：201-212；ribaritsa，mamunan，lis，etal.combinationofreversiblemalesterilityanddoubledhaploidproductionbytargetedinactivationofcytoplasmicglutaminesynthetaseindevelopinganthersandpollen.plantbiotechnolj，2007，5(4)：483-494；albertsen，m.c.，etal.1999，inductionofmalesterilityinplantsbyexpressionofhighlevelsofavidin.unitedstates，pioneerhi-bredinternational，inc.，desmoines，iowa.us5962769；sinhar，raiammv.rnaisilencingofthreehomologuesofs-adenosylmethioninedecarboxylasegeneintapetaltissueoftomatoresultsinmalesterility.plantmolbiol，2013，82(1-2)：169-180]。當(dāng)前，基因工程法制備代謝缺陷型不育材料仍然存在育性不徹底、成本較高或引起其他其他農(nóng)藝性狀嚴重劣變等問題，生產(chǎn)中未見相關(guān)成果的實際應(yīng)用。在水稻中，通過尋找更為優(yōu)良的代謝缺陷型雄性不育材料不失為一條尋找新型不育系以克服水稻現(xiàn)有不育系缺點的重要途徑?；蚓庉嫾夹g(shù)的迅猛發(fā)展使得現(xiàn)在可以非常便捷地創(chuàng)制某種代謝基因功能缺失突變體，從而創(chuàng)制代謝缺陷型不育系?；蚓庉嫾夹g(shù)主要包含鋅脂蛋白核酸酶(zfn)、類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)蛋白核酸酶(talen)及crispr系統(tǒng)[gaj，t.，etal.zfn，talen，andcrispr/cas-basedmethodsforgenomeengineering.trendsbiotechnol，2013，31(7)：397-405]。crispr/cas9是目前使用最為廣泛且最為高效的基因編輯系統(tǒng)，與先前的zfn及talen技術(shù)相比，過程更便捷，成本更低。crispr/cas9系統(tǒng)由兩部分組成，其中一個組分是cas9蛋白(一種核酸酶)，另一個組分是引導(dǎo)cas9蛋白至目的特異靶位點的sgrna(singleguiderna)，欲敲除某個基因時，只需設(shè)計sgrna上針對靶基因的特異的20bp堿基序列(稱為引導(dǎo)序列，guidesequece)即可。crispr/cas9系統(tǒng)作用時，sgrna引導(dǎo)cas9蛋白至與sgrna上的引導(dǎo)序列相匹配的基因組目標序列并在特定位點創(chuàng)造雙鏈斷裂，細胞在修復(fù)雙鏈斷裂時采用非同源末端連接(nhej)或同源重組(hr)方式而引入突變，從而完成基因編輯。目前crispr/cas9系統(tǒng)已經(jīng)在水稻中成功應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有質(zhì)核互作雄性不育系、光溫敏不育系及spt核隱性不育系在水稻雜種生產(chǎn)應(yīng)用中的不足，提供了一種新型的水稻雄性不育系系統(tǒng)及生產(chǎn)方法。研究發(fā)現(xiàn)植物中一些內(nèi)源激素為正常育性所必須，因此本申請的發(fā)明人猜想水稻中某些植物激素代謝基因突變體可能成為理想的代謝缺陷型雄性不育材料。通過文獻查詢及生物信息學(xué)分析，篩選，本案發(fā)明者認為水稻植株中赤霉素合成基因osga3ox1功能缺失突變后有可能成為理想的代謝缺陷型突變體。此種猜想基于如下信息：1)水稻赤霉素合成途徑中只存在ga3ox的兩種同工酶基因，osga3ox1和osga3ox2，osga3ox2功能缺失突變引起嚴重矮桿[sakamoto，t.，etal.anoverviewofgibberellinmetabolismenzymegenesandtheirrelatedmutantsinrice.plantphysiol，2004，134(4)：1642-1653]，但可結(jié)實，暗示osga3ox1對于維持正常育性發(fā)揮主要作用；2)osga3ox1在花粉發(fā)育中后期大量表達，其他部位則幾乎不表達[itoh，h.，etal.cloningandfunctionalanalysisoftwogibberellin3beta-hydroxylasegenesthataredifferentlyexpressedduringthegrowthofrice.procnatlacadsciusa，2001，98(15)：8909-8914和hirano，k.，etal.comprehensivetranscriptomeanalysisofphytohormonebiosynthesisandsignalinggenesinmicrospore/pollenandtapetumofrice.plantcellphysiol，2008，49(10)：1429-1450]，更暗示了其對于育性維持的重要性，也暗示了其對于營養(yǎng)器官發(fā)育并不是必須的；3)水稻赤霉素合成突變體造成的矮桿表型一般可以通過外源添加赤霉素而恢復(fù)，提示了osga3ox1基因功能缺失突變亦可以通過類似方法添加外源赤霉素而恢復(fù)其表型。基于以上了解，本申請的發(fā)明人通過基因敲除技術(shù)獲得了一種敗育徹底、簡單易行、成本較低且不帶來其他農(nóng)藝性狀嚴重劣變的水稻不育系的生產(chǎn)方法，此種不育系為通過定點敲除水稻赤霉素合成基因osga3ox1而創(chuàng)制，具體地，本發(fā)明的內(nèi)容包括一種水稻osga3ox1基因在水稻雄性不育創(chuàng)制中的應(yīng)用、一種通過敲除水稻osga3ox1基因創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法以及對此種不育株系進行育性恢復(fù)以進行自身繁育的方法。除非另外指明，否則本發(fā)明的實施將采用本領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、雜交育種、雜種優(yōu)勢利用以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域技術(shù)。除非另外指明，否則本申請中所用的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明提供了一種水稻赤霉素合成基因osga3ox1的應(yīng)用，所述的osga3ox1基因編碼的多肽氨基酸序列如seqidno.1所示，或為與seqidno.1所示序列存在90％以上序列相似性的序列。本發(fā)明第一方面所述的應(yīng)用具體是，用于水稻雄性不育株系的創(chuàng)制。進一步地，所述的水稻雄性不育株系的創(chuàng)制為通過構(gòu)建水稻osga3ox1基因突變體株以實現(xiàn)。進一步地，所述的osga3ox1基因突變體株為與正常水稻相比基因組中一個或兩個osga3ox1等位基因所編碼的多肽功能喪失或受抑制的水稻植株，并且植株中花粉50％以上是敗育的。第二方面，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用osga3ox1基因創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法。本發(fā)明中，所述的osga3ox1基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，或為與seqidno.2所示序列存在90％以上序列相似性的序列。本發(fā)明中，所述的創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法是通過利用crisprr/cas9系統(tǒng)對普通水稻中的osga3ox1基因進行定點敲除實現(xiàn)的。進一步地，所述的crispr/cas9系統(tǒng)為crispr/cas9基因敲除載體。進一步地，所述的crispr/cas9基因敲除載體優(yōu)選基于載體pcambia1390的crisprr/cas9基因敲除載體。在一具體實施例中，crispr/cas9基因敲除載體為pcubi1390cas9-u3，所采用的sgrna引導(dǎo)序列(guidesequence)為seqidno.3所示的序列或與此序列存在1至3個堿基差異的序列。在一具體實施例中，crispr/cas9基因敲除載體為pcubi1390cas9-u6，所采用的sgrna引導(dǎo)序列為seqidno.4所示的序列或與此序列存在1至3個堿基差異的序列。本發(fā)明所述的創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法中，通過利用crisprr/cas9基因敲除載體對普通水稻中的osga3ox1基因進行定點敲除獲得水稻雄性不育株系的方法包括步驟：1)利用公開軟件crispr-p或其他工具設(shè)計sgrna引導(dǎo)序列，本發(fā)明采用如seqidno.3(用于第一種方法)或seqidno.4(用于第二種方法)所示的sgrna引導(dǎo)序列；2)根據(jù)設(shè)計的sgrna引導(dǎo)序列及載體構(gòu)建要求，合成末端四個堿基外其余堿基反向互補的寡脫氧核糖核酸sgg3x1u3-f(ggcacatctgcttcgggtaccgg)和sgg3x1u3-r(aaacccggtacccgaagcagatg)(用于第一種方法)，以及sgg3x1u6-f(cttgactcgtcgatgagagctct)和sgg3x1u6-r(aaacagagctctcatcgacgagt)(用于第二種方法)；3)分別把反向互補寡脫氧核糖核酸退火成雙鏈寡核酸；4)酶切、連接和轉(zhuǎn)化，分別把所得的雙鏈寡核酸連接到crispr/cas9載體；5)測序，選取正確克隆，擴大繁殖提取質(zhì)粒，其中，測序前先挑單克隆，以如下引物對單克隆進行測序，osu3-f(ggcatgcatggatcttggaggaat)(檢測克隆正確性，啟動子為osu3時用)，osu6-f(ttgagcgattacaggcgaaagtg)(檢測克隆正確性，啟動子為osu6時用)，35s-f(tgacgcacaatcccactatccttc)(35s正向引物，檢測載體完整性)，cas9-r-1(tcgagcctgcgggacttagag)(cas95′端引物，檢測載體完整性)，c126(tcgtgaagaagaccgaggtt)(cas93′端引物，檢測載體完整性)；6)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；7)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得t0代轉(zhuǎn)化子；8)對t0代轉(zhuǎn)化子中osga3ox1基因的靶位點進行測序檢測，具體為，提取轉(zhuǎn)化子dna，分別利用g3x1u3-f(tcgcgctgccggcggacgac)和g3x1u3-r(gcggatggcagggggagggaaggt)，以及g3x1u6-f(tcgatccgccattgcttgcat)和g3x1u6-r(ccgagcgccttgaagaacatgg)組成的引物對對轉(zhuǎn)化子osga3ox1基因組dna中seqidno.3和seqidno.4所在位點序列進行擴增，將擴增片段克隆至t載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑單克隆測序，每個片段至少測10個單克隆以上，至少獲得5個陽性克??；9)判定突變情況，具體為，將測序結(jié)果與野生型序列進行比對，分析，結(jié)果存在四種可能，無突變，純合突變、雜合突變或雙等位基因突變；10)觀察突變轉(zhuǎn)化子表型，判定osga3ox1基因敲除情況，具體為，觀察t0代osga3ox1基因突變轉(zhuǎn)化子表型，包含花粉i2-ki染色情況，散粉情況，結(jié)實情況以及除育性之外的其他農(nóng)藝性狀是否受影響；根據(jù)花粉i2-ki染色判定osga3ox1基因是否敲除，若一轉(zhuǎn)化子中一半左右花粉i2-ki染色較正常花粉淺(稱為染敗)，則該突變轉(zhuǎn)化子中有一個等位基因完成osga3ox1基因敲除，若幾乎全部花粉染色都比正?；ǚ蹨\，則兩個osga3ox1等位基因都完成敲除，若染色與野生型無異，則突變并不影響基因功能；11)按照10)確定的等位基因敲除類型選擇赤霉素噴施方案實施噴施，獲得水稻雄性不育株系，具體為，若轉(zhuǎn)化子中僅有一個osga3ox1等位基因被敲除，即突變是雜合的，則突變株在t0代是可育(此處可育指可結(jié)實)的，直接收獲種子，種植獲得t1植株，由于osga3ox1是在花粉后期表達的基因，其控制的不育性狀為配子體雄性不育，因而此種突變體不可能通過自然自交得到純合的不育株(這也可能是目前國內(nèi)外水稻突變體庫中沒有發(fā)現(xiàn)osga3ox1功能缺失突變體的原因)，因此，t1代在osga3ox1基因位點只有兩種基因型，雜合可育株和野生型可育株，呈1∶1分離，在下一代分離群體中通過標記選擇雜合株或通過花粉染色選出雜合株，讓其自交繁殖，如此往復(fù)，突變體得以保存，通過在孕穗期到揚花期分3-5次噴施含10-60mg/lga3的水溶液于雜合植株穗部，從獲得的自交種中鑒定突變基因純合且不含轉(zhuǎn)基因成分的不育植株，以后均通過相同方法噴施ga3水溶液以繁殖此種純合不育株，擴大繁殖，即得用于生產(chǎn)的雄性不育株系；若轉(zhuǎn)化子中兩個osga3ox1等位基因均被敲除，則t0代即不育，可通過在孕穗期到揚花期分3～5次噴施含10-60mg/lga3的水溶液于植株穗部繁殖此種不育株，t0植株上獲得的種子應(yīng)該是分離的，在后代可通過分子標記篩選獲得去除轉(zhuǎn)基因成分且osga3ox1突變基因純合的單株，繼續(xù)對這些單株噴施ga3水溶液，收獲種子，種植，如此往復(fù)，突變體得以擴大繁殖，即得用于生產(chǎn)的雄性不育株系，或替代地，以t0代轉(zhuǎn)化子作母本與野生型父本雜交，獲得突變基因雜合的f1代植株，此后按照前述僅一個等位基因發(fā)生敲除的情況所采用的方法進行處理，亦可得到用于生產(chǎn)的雄性不育株系。第三方面，本發(fā)明提供了通過本申請第二方面的方法創(chuàng)制的水稻雄性不育株系的育性恢復(fù)方法，所述的育性恢復(fù)方法為向水稻雄性不育株系植株穗部噴施赤霉素類物質(zhì)的水溶液。本發(fā)明的水稻雄性不育株系育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素類物質(zhì)優(yōu)選為ga3。本發(fā)明的水稻雄性不育株系育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素類物質(zhì)噴施的時期是在水稻孕穗期至揚花期。本發(fā)明的水稻雄性不育株系育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素類物質(zhì)噴施的時間選自早上6-9點或下午4-6點。本發(fā)明的水稻雄性不育株系育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素類物質(zhì)噴施的次數(shù)為2～8次或優(yōu)選3～5次，所述噴施的赤霉素類物質(zhì)的濃度為5～90mg/l或優(yōu)選10～60mg/l或更優(yōu)選20～40mg/l中的一種。本發(fā)明的水稻雄性不育株系育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素噴施用量為5-25g每667m2；本發(fā)明的水稻雄性不育株系育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素溶液包含0.03％表面活性劑。本發(fā)明的水稻雄性不育株系的育性恢復(fù)方法的一些實施方式中，赤霉素溶液包含0.002％表面活性劑。本發(fā)明的水稻雄性不育株系的育性恢復(fù)方法的一實施例中，赤霉素溶液包含0.01％吐溫-20。第四方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明第二方面的方法獲得的水稻不育株系在水稻雜種生產(chǎn)中的應(yīng)用。雜種生產(chǎn)時，將穩(wěn)定的osga3ox1基因敲除不育材料作為母本種植，依據(jù)父母本生育期差異錯期播種，其他等同常規(guī)雜種生產(chǎn)方法。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于提供了一種赤霉素合成基因osga3ox1全新的應(yīng)用，為雜種生產(chǎn)提供了一種新型的兩用不育系系統(tǒng)，此種不育系可通過外源噴施赤霉素而得以自身繁殖，育性不受環(huán)境條件影響，克服了以往光溫敏兩用不育系受極端天氣影響而制種風(fēng)險高的缺點。附圖說明圖1：crispr/cas9載體pcubi1390cas9-u3和pcubi1390cas9-u6的t-dna區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖，兩個載體的差別僅在于驅(qū)動sgrna表達的啟動子前者為osu3，后者為osu6；圖中各符號示意為，lb、rb，t-dna左、右邊界，hpt，抗潮霉素選擇標記，2×35s，串聯(lián)的35s啟動子，cmr-ccdbcassette，抗氯霉素基因及自殺基因表達盒，sgrnascaffoldandpoly(t)7，sgrna骨架及終止子，maizeubipromoter，玉米ubi基因啟動子，ricecodonoptimizedcas9，水稻密碼子優(yōu)化的cas9基因，aari，供引導(dǎo)序列克隆的酶切位點，psti-snabi-mlui，三個單一限制性內(nèi)切酶識別位點，圖中省略了hpt和cas9基因各自表達所需的終止子camv3′utr和nospolyasignal。圖2：通過crispr/cas9定點敲除獲得的osga3ox1基因突變植株的靶序列突變情況；其中，wt-u6表示seqidno.4對應(yīng)的野生型osga3ox1基因的位點(在正義鏈上)附近的序列(展示了正義鏈)，wt-u3表示seqidno.3對應(yīng)的野生型osga3ox1基因的位點(在負義鏈上)附近的序列(展示了正義鏈)，a1-6，a4-2，a4-3，a5-2和a6-5為測序時不同樣品的編號并以此代表不同的突變類型。圖3：為圖2中展示序列所對應(yīng)的測序峰圖，為對突變體中靶序列測序所獲得，(+)表示測序時測到的是靶序列的正義鏈，(-)表示測序時測到的是靶序列的負義鏈，中括號內(nèi)數(shù)字范圍表示測序峰圖中此數(shù)字范圍內(nèi)的堿基對應(yīng)于圖2中的對應(yīng)序列。圖4：一個osga3ox1基因雙等位基因突變體(右側(cè))t0植株及其野生型(左側(cè))的結(jié)實情況，野生型正常結(jié)實，突變體結(jié)實率為零。圖5：一個osga3ox1基因雙等位基因突變體t0植株作為母本與野生型進行雜交可以正常結(jié)實(即雌蕊功能正常)的情況，箭頭指示了一部分結(jié)實的種子。圖6：一個osga3ox1基因雙等位基因突變體(右側(cè))t0植株其穎花(小穗)形態(tài)結(jié)構(gòu)與野生型(左側(cè))并不存在明顯差異，且雄蕊中存在黃色花藥。圖7：一個osga3ox1基因雙等位基因突變體(右側(cè))t0植株的花粉與野生型(左側(cè))相比，其i2-ki染色較淺，因而敗育類型為染敗具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中末注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如書籍《分子克隆實驗指南(第3版)》(j.薩姆布魯克，d.w.拉塞爾著；黃培堂等譯；科學(xué)出版社，2008)中所述的條件，或按照制造試劑或設(shè)備廠商所建議的條件。實施例1、一種通過定點敲除赤霉素合成基因osga3ox1以創(chuàng)制水稻雄性不育株系的方法通過如下步驟完成osga3ox1基因的敲除及獲得雄性不育株：1)設(shè)計sgrna引導(dǎo)序列利用在線工具crispr-p(http：//cbi.hzau.edu.cn/crispr/)，按照開發(fā)者提供的方法，設(shè)計針對osga3ox1基因的sgrna引導(dǎo)序列，從軟件提供的結(jié)果中依據(jù)序列特異性及序列所在位置選擇合適的引導(dǎo)序列，本實施例所選的sgrna引導(dǎo)序列為seqidno.3和seqidno.4所示的序列。2)依據(jù)引導(dǎo)序列及載體要求合成用于克隆的寡核酸本實施例采用基于載體pcambia1390(由非盈利機構(gòu)cambia構(gòu)建，載體序列及圖譜見http：//www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)的crispr/cas9載體pcubi1390cas9-u3和pcubi1390cas9-u6(兩個載體的t-dna區(qū)結(jié)構(gòu)如附圖1所示)，均為本申請發(fā)明者自己構(gòu)建。依據(jù)載體構(gòu)建要求，對于引導(dǎo)序列采用seqidno.3的情況，合成除末端四個堿基外其余堿基反向互補的寡脫氧核糖核酸sgg3x1u3-f(ggcacatctgcttcgggtaccgg)和sgg3x1u3-r(aaacccggtacccgaagcagatg)，而對于靶序列采用seqidno.4的情況，合成寡脫氧核糖核酸sgg3x1u6-f(cttgactcgtcgatgagagctct)和sgg3x1u6-r(aaacagagctctcatcgacgagt)。3)退火寡核酸形成接頭用1倍te緩沖液溶解寡核酸，終濃度為100pmol/μl，將互補的寡核酸各取等量混合后加入2％體積的5mnacl(此方法中退火體系各組分及終濃度約為：10mmtris-cl，1mmedta，100mmnacl，兩種互補寡核酸各自50pmol/μl)，混勻，于pcr儀(杭州晶格t960)中95度2分鐘，自然冷卻至室溫，接頭即制成，把接頭稀釋50倍成1pmol/μl備用。4)酶切和回收用限制性內(nèi)切酶aari(生產(chǎn)商thermoscientific；貨號er1581)酶切crispr/cas9載體pcubi1390cas9-u3或pcubi1390cas9-u6。酶切體系：質(zhì)粒5μg，aari酶3u，10xaari緩沖液4μl，50xoligonucleotide(0.025mm；酶生產(chǎn)商提供)0.8μl，補水至40μl；酶切條件：37度溫育10小時；回收載體質(zhì)粒dna：直接乙醇沉淀回收，具體地，在酶切體系中加入4μl3mnacl，再加入2倍體積乙醇，-20度低溫保持30min，12000g/min離心10min，棄掉上清，再用70％乙醇洗滌2遍，待樣品干燥后用50μl水溶解質(zhì)粒dna。5)連接連接反應(yīng)體系為：t4連接酶緩沖液1μl，乙醇沉淀回收的載體100ng左右，接頭1pmol，t4連接酶(生產(chǎn)商neb，貨號m0202s)1μl，ddh2o補足至10μl總體積；連接反應(yīng)條件為：16℃連接2h。6)轉(zhuǎn)化大腸桿菌：把10μl全部連接產(chǎn)物全部接入100μl商業(yè)化的大腸桿菌dh5α化學(xué)感受態(tài)細胞(生產(chǎn)商北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；貨號mcc001)，轉(zhuǎn)化方法依據(jù)生產(chǎn)商提供的方法，用含卡那霉素的平板篩選陽性克隆。7)測序挑單克隆，以如下引物對單克隆進行測序，選取正確克隆，擴大繁殖提取質(zhì)粒。測序引物為：osu3-f(ggcatgcatggatcttggaggaat)(檢測克隆正確性，啟動子為u3時用)；osu6-f(ttgagcgattacaggcgaaagtg)(檢測克隆正確性，啟動子為u6時用)；35s-f(tgacgcacaatcccactatccttc)(35s正向引物，檢測載體完整性)；cas9-r-1(tcgagcctgcgggacttagag)(cas95′端引物，檢測載體完整性)；c126(tcgtgaagaagaccgaggtt)(cas93′端引物，檢測載體完整性)。8)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌用常規(guī)的反復(fù)凍融法將正確克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至常規(guī)cacl2法制備的eha105農(nóng)桿菌化學(xué)感受態(tài)細胞中中，具體地，農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化包含如下步驟：a)取-70℃保存的eha105于合50μg/ml利福平板劃線，28℃培養(yǎng)。b)挑取單菌落接種于5mlyep液體培養(yǎng)基中，220rpm28℃振蕩培養(yǎng)12-16hr。c)取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100mlym液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至od600＝0.5。d)轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清液。e)加入10ml預(yù)冷的0.1m的cacl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min，4℃5000rpm離心5min，去上清。f)加入4ml預(yù)冷的含15％甘油的0.1m的cacl2溶液，輕輕懸浮。g)農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌1.5ml離心管中，每管200μl凍存于-70℃。h)雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105取1μg左右的質(zhì)粒dna加入到200μleha105感受態(tài)細胞中，混勻后，冰浴30min，液氮放置5min，再在37℃水浴5min，接著冰浴2min，加入800μlyep液體培養(yǎng)基28℃、175rpm搖培3h，后涂在含50μg/ml卡那霉素的yep平板上，28℃培養(yǎng)到形成單菌落。9)轉(zhuǎn)化愈傷組織利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻品種kasalath的愈傷組織(方法參考toki等的方法[tokis，haran，onok，etal.earlyinfectionofscutellumtissuewithagrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.plantj，2006，47(6)：969-976]。10)對轉(zhuǎn)化子中osga3ox1基因的靶位點進行檢測；提取轉(zhuǎn)化子dna(本實施例中為秧苗期葉片，實施者可以選擇任何時期的組織作為dna提取材料)，利用引物g3x1u3-f(tcgcgctgccggcggacgac)和g3x1u3-r(gcggatggcagggggagggaaggt)，以及g3x1u6-f(tcgatccgccattgcttgcat)和g3x1u6-r(ccgagcgccttgaagaacatgg)組成的引物對對轉(zhuǎn)化子osga3ox1基因dna中seqidno.3和seqidno.4所在位點序列進行擴增，將獲得的pcr產(chǎn)物目標片段克隆至pmd-18-t載體(廠商takara，貨號6011)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆測序，測10個單克隆以上，保證獲得5個以上陽性克隆。11)突變判定將測序結(jié)果與野生型序列進行比對，分析，結(jié)果存在四種可能，無突變(野生型)，純合突變、雜合突變或雙等位基因突變。本實施例中，獲得的轉(zhuǎn)化子t0發(fā)生突變的株系其基因基因組dna序列突變情況如表1及附圖2、附圖3所示，進而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)序列變化如表2所示。表1轉(zhuǎn)化子中osga3ox1基因靶位點突變情況及結(jié)實情況表2轉(zhuǎn)化子中基因突變對蛋白質(zhì)序列及功能的影響核酸突變類型氨基酸序列的改變1說明可能后果a1-6y146fs移碼功能失活a4-2r192_a193delinss保守序列的缺失/插入功能失活a4-3a194_e195delinsgragsd保守序列的缺失/插入功能失活a5-2r192fs移碼功能失活a6-5l194fs移碼功能失活1此欄中的氨基酸序列突變表示方法參考dendunnen等的文章[j.t.dendunnenands.e.antonarakisnomenclatureforthedescriptionofsequencevariations，humgenet，2001，109(1)：121-124及網(wǎng)頁http：//www.hgmd.cf.ac.uk/docs/mut_nom.html的描述]12)觀察和繁殖突變體，獲得雄性不育系觀察突變體表型，包含結(jié)實情況，花粉i2-ki染色情況，散粉情況，以及除育性之外的其他農(nóng)藝性狀是否受影響。本實施例中，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，在同樣種植條件野生型材料能正常結(jié)實的情況下，獲得的osga3ox1基因發(fā)生突變的轉(zhuǎn)化子中，2個雙等位基因突變體及1個純合突變體均未能正常結(jié)實(其中株系a4的情況如附圖4所示)，說明突變類型a4-2、a4-3及a6-5都是蛋白功能喪失的突變類型，而2個雜合突變體能夠正常結(jié)實，與預(yù)期表型相符。利用株系a4進一步觀察發(fā)現(xiàn)，突變體雌蕊可接受野生型花粉而結(jié)實(如附圖5所示)，而且突變體花器官形態(tài)與野生型相比并無顯著差異，其雄蕊中還含有花藥(如附圖6所示)，花粉i2-ki染色顯示，突變體中花粉染色較野生型淺(如附圖7所示)，為染敗型敗育。因此，本案發(fā)明者證明了osga3ox1基因敲除可導(dǎo)致雄性不育，而且證明此種不育突變體可作為雜種母本而利用。通過在穗子剛抽出時噴施1次30mg/lga3獲得了10％左右的結(jié)實率(穗子套袋隔離外來花粉，排除串粉的可能)，說明osga3ox1基因敲除突變體可通過外源施加赤霉素而恢復(fù)育性，且進一步提示了osga3ox1基因敲除突變體在未施加外源赤霉素時可作為不育系使用，而需要繁種時通過施加赤霉素恢復(fù)育性即可，因而可作為一種新的兩用不育系系統(tǒng)而利用。一個osga3ox1基因雙等位基因突變體(右側(cè))t0植株及其野生型(左側(cè))的結(jié)實情況，野生型正常結(jié)實，突變體結(jié)實率為零如圖4所示。一個osga3ox1基因雙等位基因突變體t0植株作為母本與野生型進行雜交可以正常結(jié)實(即雌蕊功能正常)的情況如圖5所示。一個osga3ox1基因雙等位基因突變體(右側(cè))t0植株其穎花(小穗)形態(tài)結(jié)構(gòu)與野生型(左側(cè))并不存在明顯差異，且雄蕊中存在黃色花藥如圖6所示。一個osga3ox1基因雙等位基因突變體(右側(cè))t0植株的花粉與野生型(左側(cè))相比，其i2-ki染色較淺，因而敗育類型為染敗如圖7所示。本實施例結(jié)果表明，本申請人通過創(chuàng)制osga3ox1基因雙等位基因突變體成功獲得了水稻雄性不育株系，并證明此種不育株系可以通過噴施赤霉素而恢復(fù)以及可作為不育母本進行雜交種制種。實施例2、osga3ox1基因敲除突變體的育性恢復(fù)在水稻抽穗期可通過上午8點用含赤霉素類物質(zhì)ga3的溶液噴施水稻穗部而恢復(fù)育性，濃度可在45mg/l赤霉素，噴施4次，每667m2用量18g內(nèi)，赤霉素溶液應(yīng)該包含一定量表面活性劑如0.01％吐溫-20，以增強藥劑在葉片表面的粘附，利用kasalath為背景時，使用濃度約30mg/l的ga3在穗子剛抽出時噴施。實施例3、osga3ox1基因敲除突變體的育性恢復(fù)在水稻抽穗期可通過下午5點用含赤霉素類物質(zhì)ga3的溶液噴施水稻穗部而恢復(fù)育性，濃度可在60mg/l赤霉素，噴施1次，每667m2用量30g內(nèi)，赤霉素溶液應(yīng)該包含一定量表面活性劑如0.03％吐溫-20，以增強藥劑在葉片表面的粘附。實施例4osga3ox1基因敲除突變體的育性恢復(fù)在水稻抽穗期可通過上午9點用合赤霉素類物質(zhì)ga3的溶液噴施水稻穗部而恢復(fù)育性，濃度可在10mg/l赤霉素，噴施5次，每667m2用量5g內(nèi)，赤霉素溶液應(yīng)該包含一定量表面活性劑如0.002％吐溫-20，以增強藥劑在葉片表面的粘附。實施例5、osga3ox1基因敲除突變不育系在雜種生產(chǎn)中的利用雜種生產(chǎn)時，將穩(wěn)定的osga3ox1基因突變不育材料作為母本種植，依據(jù)父母本生育期差異錯期播種，其他等同常規(guī)雜種生產(chǎn)方法。需要特別指出，雜種生產(chǎn)利用osga3ox1基因突變不育材料做雜交母本時，絕對不能用赤霉素類物質(zhì)調(diào)節(jié)花期或用以增加制種產(chǎn)量，因為如此操作將導(dǎo)致母本自交結(jié)實而使制種失敗。當(dāng)前第1頁12